Ø Ø Fyziologie hemostázy Ø ø ø P. Smejkal Hemostáza Ø je schopnost organismu zastavit krvácení Ä udržení tekutosti krve při neporušeném cévním řečišti Ø účastní se: Äcévní stěna øendotel Älátky přítomné v krvi a na vnitřní straně cévy: øtrombocyty øčervené krvinky, leukocyty ølipidy, bílkoviny, minerály atd. Äporušená tkáň: øtkáňový faktor øADP Poranění = poškození endotelu subendotel CÉVA TROMBOCYTY PLAZMAT.FF vasokonstrikce Primární hemostáza subendotel CÉVA TROMBOCYTY PLAZMAT.FF vasokonstrikce aktivace primární zátka Hemokoagulace subendotel CÉVA TROMBOCYTY PLAZMAT.FF vasokonstrikce aktivace aktivace koagulace primární zátka definitivní zátka + FIBRIN Hemokoagulace subendotel CÉVA TROMBOCYTY PLAZMAT.FF vasokonstrikce aktivace aktivace koagulace aktivace fibrinolýzy přiroz.inhibitory primární zátka definitivní zátka + FIBRIN Fibrinolytický systém subendotel CÉVA TROMBOCYTY PLAZMAT.FF vasokonstrikce aktivace aktivace koagulace aktivace fibrinolýzy přiroz.inhibitory primární zátka definitivní zátka + FIBRIN definitivní zátka Inhibitory koagulace a fibrinolýzy subendotel CÉVA TROMBOCYTY PLAZMAT.FF vasokonstrikce aktivace aktivace koagulace aktivace fibrinolýzy přiroz.inhibitory primární zátka definitivní zátka + FIBRIN definitivní zátka Hemostáza Øprimární Ävasokonstrikce ihned Äadheze trombocytů sekundy Äagregace trombocytů sekundy až minuty Ä Øsekundární (koagulace) Äaktivace koagul. faktorů sekundy až minuty Ätvorba fibrinu minuty Ä Øfibrinolýza Äaktivace minuty Älýza krevní sraženiny hodiny Poranění = poškození endotelu subendotel CÉVA TROMBOCYTY PLAZMAT.FF vasokonstrikce aktivace primární zátka Vasokonstrikce: • způsobena střední vrstvou cévy: • hladká svalovina • elastická vlákna • především reflexní reakce • dočasná Endotel Øje aktivní jednovrstevná buněčná výstelka všech cév, kapilár a serózních dutin • Øje místem kontaktu látek a buněk kolujících v krvi a látek navázaných na povrch endotelu Ätyto buď cirkulují v krvi a na endotel se váží nebo Äjsou endotelem syntetizovány • Øje důležitým zprostředkovatelem a regulátorem látkové výměny mezi krví, lymfou a tkáněmi ø Endotel Ø Cévní tonus Øendotelové buňky kapilár uvolňují látky, které regulují prokrvení orgánů, způsobují převážně vasodilataci, např.: Ämetabolity kyseliny arachidonové, např. prostacyklin PGI2 - tromboxan A2 ÄNO - endotelin Äbradykinin (potencuje uvolnění NO) Endotel - hemostáza Ø Význam pro hemostázu ØEB na jedné straně podporují srážení (vWF) Øna druhé straně produkují faktory aktivní ve fibrinolýze Øv klidovém fyziologickém stavu převažují látky působící proti krevnímu srážení V endotelu jsou syntetizovány ØVon Willebrandův faktor ØPlatelet Derived Growth Factor (růstový faktor odvozený z destiček) Ødestičky aktivující faktor (PAF) Øprostaglandiny, prostacyklin Øglykoproteiny, fibronektin, trombospodin Øněkteré typy prokolagenu ØEndothelium Derived Relaxing Factor (z endotelu odvozený faktor = NO) Øendotelin-1 a další Endotel - vlastnosti Ø Antitrombotické Øvazodilatace Ømodulující zánět Øpotlačující růst Øprostacyklin - PGI2 ØNO = EDRF Øaktivátory plazminogenu Øproteoglykany (heparan) Øtrombomodulin Øprotein C, S Ø Prokoagulační Øvazokonstrikce Äendotelin Øpodporující zánět Øpodporující růst Øtkáňový faktor ØPAF ØvWF ØPAI Markery aktivace a poškození endotelu ØTF Äexprimovaný na povrchu endotelu odráží stupeň jeho stimulace • Øt-PA, PAI-1 • Øtrombomodulin • ØvWF Uvolnění při poškození nebo aktivaci endotelu Poranění = poškození endotelu subendotel CÉVA TROMBOCYTY PLAZMAT.FF vasokonstrikce aktivace primární zátka Krevní destičky ØFunkce trombocytů při zástavě krvácení je dvojí: Øtvorba primární krevní zátky, Øtzv. prokoagulační Ätj. poskytnutí povrchů = fosfolipidů pro průběh koagulačních dějů - PF3 øvazba na vit. K závislých faktorů: FII, VII, IX, X øvazba kofaktrů: FV, VIII øvazba a aktivace: FXI, XII ø Účast destiček v hemostáze: Äadheze Äzměna tvaru Äuvolňovací reakce Äagregace Äpřesun negativně nabitých fosfolipidů na povrch Äretrakce Ø Primární hemostáza Granula trombocytů Øa-granula ØDF4, bTG– neutralizace GAG ØvWF – adheze, agregace ØFV – prokoagulačně ØPAI-1 – inhibice fibrinolýzy ØPDGF – růst tkáně, hojení Øtrombospondin – agregace Øfibrinogen – agregace Øfibronectin – adheze ØPS – inhibice koagul. FF Ødenzní granula ØATP, ADP - agregace ØCa - agregace Ø - vazba koagul. FF Ø - tvar-změna, retrakce Øserotonin - vasokonstrikce ØP-selektin – váže leukocyty Ø Adheze Øpřilnutí krevních destiček na jakýkoliv povrch s výjimkou dalšího trombocytu Øvedle trombocytů se na ni podílejí Ästruktury subendotelu: kolagen Äplazmatické adhezivní proteiny: vWF, fibronectin Ähemodynamické změny (smykové rychlosti, množství a viskozita krve, velikost a tvar cév). Øadheze je přímo lineárně závislá na počtu trombocytů Von Willebrandův faktor Øje adhezivní protein Øtvořen v endotelu a megakaryocytech Øhraje klíčovou roli v primární hemostáze a koagulaci Øzralý vWF představuje sérii multimerů od 500 kD až přes 10.000 kD, každý s komplexní strukturou Øcirkulující vWF se váže s FVIII vWF - primární hemostáza ØMultimery o vysoké molekulové hmotnosti Øadheze trombocytů k subendotelovým strukturám prostřednictvím GP Ib Øagregace vazbou na aktivovaný GP IIb/IIIa SE GP Ib vWF trombo GP IIb/IIIa vWF trombo vWF - funkce v koagulaci ØMultimery všech molekul. hmotností Øváže a stabilizuje FVIII (ochrana před proteolytickou degradací) Ølokalizuje FVIII v místě poruchy cévní stěny Adheze (ale i trombin) navodí s aktivací receptorů komplexní aktivaci trombocytů Øztráta diskoidního tvaru, tvorba pseudopodií (vývěžků) • Øcentralizace granulí a přeměna cytoskeletonu Äuvolnění působků z granulí (sekreční fáze): øADP, PDGF, PF4, bTG, fibrinogen a další • Ømetabolizmem kyseliny arachidonové vzniká TXA2 Ävýrazný stimulátor agregace trombocytů • Øaktivace receptorů GP IIb/IIIa • Øpřesun negativně nabitých fosfolipidů na povrch Äumožňují vazbu koagulačních faktorů v místě krvácení Ø Agregace Øje vzájemné spojení destiček mezi sebou Øprobíhá s pomocí specifického komplexu závislém na Ca2+, GP IIb/IIIa a fibrinogenu Äfibrinogen slouží jako můstek mezi destičkami; nereaguje s klidovými destičkami Øza vysokých smykových rychlostí je adheze a agregace trombocytů zprostředkována vazbou vWF na GPIIb/IIIa a to i v nepřítomnosti fibrinogenu Äprimární agregace øADP z porušených buněk a tkání - reverzibilní Äsekundární agregace øADP a TXA2 z trombocytů – ireverzibilní Øvznik bílého destičkového trombu Retrakce Ø= smrštění vytvořené krevní zátky • Øjedná se o destičkovou funkci, která je analogní kontrakci svalů • Øslouží k podpoře uzavření rány • Øpro retrakci jsou destičky nezbytné • Øpseudopódia destiček přilnou k fibrinovým vláknům a retrakce kontraktilních bílkovin destiček (tj. „zatažení“ pseudopódií) vyvolá retrakci sraženiny Hemokoagulace subendotel CÉVA TROMBOCYTY PLAZMAT.FF vasokonstrikce aktivace aktivace koagulace primární zátka definitivní zátka + FIBRIN Plazmatický koagulační systém ØProenzymy Øserinové proteázy: FII, VII, IX, X, XI, XII, PK Ø PLG, tPA, uPA, PC Øtransglutaminázy: FXIII ØKofaktory: Øplazmatické: FV, VIII, HMWK Ø PS Øbuněčné: TF Ø TM, EPCR ØSubstrát: fibrinogen ØRegulační proteiny: AT III, HC II, C1inh, a2AP, PAI-1,2,3 Ø PC, TFPI, a2MG ØFosfolipidy (negativně nabité): fosfatidylserin, fosfatidyletanolamin ØCa2+ Původní schéma koagulačních dějů Koagulační faktory vitamín K dependentní • FII, FVII, FIX, FX • karboxylaxe glutamové kyseliny • nutná k vazbě na fosfolipidy přes Ca můstky • • koagulační faktory jsou tvořeny, ale nejsou koagulačně aktivní - PIVKA formy (Protein Induced by Vitamin K Absence / Antagonist) Současný model koagulace TF X Xa Va II IIa fibroblast VIII/vWF VIIIa V Va platelet activated platelet VIIa VIIa IX IXa Va IXa X Xa II IIa IIa TF Monroe et al. (1994) Br J Haematol 88, 364-371, Hoffman et al. (1995) Blood 86, 1794-1801 VIIIa V XI XIa Øtransmembránový glykoprotein Äv subendotelu na fibroblastech a svalových buňkách Äfyziologicky na všech buňkách mimo cévní řečiště Äza patologických stavů i na monocytech a endotelu • Øtkáňový faktor není za normálních okolností vystaven působení cirkulující krve • Øhemostázu zahajuje tvorba komplexu mezi TF a FVIIa • Øtvorba komplexů TF-FVIIa na povrchu buněk nesoucích TF vede k aktivaci FIX a FX Hemostáza a tkáňový faktor (TF) Roberts H, et al. Williams Haematology 2001 Zahájení (iniciace) koagulace Fibroblast Trombocyt TF TF X Xa Va Protrombin VIIa VIIa Trombin TF TF Fibroblast Trombocyt Zahájení (iniciace) koagulace V X Xa Va Protrombin Aktivovaný trombocyt VIIa VIIa Trombin TF TF VIII/vWF VIIIa V Va XI XIa Trombocyt Fibroblast Fáze aplifikace koagulace (priming= narůstání) XIa VIIIa Va V X Xa Va Protrombin VIIa VIIa IX IXa VIIIa Va IXa X Xa Protrombin Trombin Trombin Fibrinogen Fibrin TF TF XIa Fibroblast Trombocyt Aktivovaný trombocyt Propagace (šíření, rozmnožení) koagulace Va VIIIa XIa IX V VIII XI V Propagace koagulace klíčové enzymatické komplexy ØTenáza (vnitřní) ÄFIXa ÄFVIIIa Äfosfolipidy ÄCa ØProtrombináza ÄFXa ÄFVa Äfosfolipidy ÄCa ØVytvoření iniciálního malého množství trombinu se následně podílí na aktivaci dějů, které zvyšují tvorbu trombinu více než 1000-násobně ÄAktivuje koagulační faktory V, VIII, XI • ØPomáhá aktivovat trombocyty v místě poranění, které následně poskytují negativně nabitý fosfolipidový povrch nutný pro další aktivaci koagulačních faktorů • Zahájení tvorby trombinu Množství trombinu je rozhodující pro: ØTvorbu dostatečné a pevné fibrinové zátky Ø ØAktivaci FXIII, vedoucí ke stabilizaci fibrinové sítě ØAktivaci TAFI, zajištující rezistenci fibrinové zátky k fibrinolýze TROMBIN Trombocyty FVIII a FV FXIII (plně stabilizovaná fibrinová zátka) FXI TAFI Trombomodulin a protein C (zpětnovazebné zesílení) (trombinem aktivovaný inhibitor fybrinolýzy) (PAR receptory) Protease-activated Receptors ØReceptory spojené s G-proteinem ØJsou schopné přeměnit EC probíhající proteolytické štěpení v transmembránový signál ØPrototypem skupiny je PAR1 ÄJe aktivován, když trombin odštěpí jeho N-konec ÄPři této aktivaci se objeví nové N-zakončení, které slouží jako liganda – váže se IC na „tělo“ receptoru a slouží jako transmembránový signál PAR trombin PAR1 PAR1* D doména D doména Původní schéma koagulačních dějů Poranění = poškození endotelu subendotel CÉVA TROMBOCYTY PLAZMAT.FF vasokonstrikce aktivace aktivace koagulace aktivace fibrinolýzy přiroz.inhibitory primární zátka definitivní zátka + FIBRIN Poranění = poškození endotelu subendotel CÉVA TROMBOCYTY PLAZMAT.FF vasokonstrikce aktivace aktivace koagulace aktivace fibrinolýzy přiroz.inhibitory primární zátka definitivní zátka + FIBRIN definitivní zátka Fibrinolýza Øpatří k základním fyziologickým mechanizmům Ømá dvě funkce v procesu hemostázy Äodstraňuje fibrinová koagula po té, co naplnily svou funkci Älimituje tvorbu koagula Øhraje dále roli v procesech zánětu, metastazování nádorů, ateroskleróze, odlučování placenty a embryogenezi Fibrinolýza Ø Vnitřní cesta (krevní) Zevní cesta (tkáňová aktivace) Ø Ø kalikrein, (FXIIa, FXIa) tPA, uPA Ø ØC1INH, ATIII PAI-1, PAI-2 Ø ØPlazminogen PLAZMIN Plazminogen Ø Ø Øa2-antiplazmin Ø Ø fibrinogen fibrin Ø Ø FVa,VIIIa Aktivace fibrinolýzy Øsilné aktivátory Øtkáňový aktivátor plazminogenu - tPA Øurokinázový aktivátor plazminogenu - uPA Øslabé aktivátory Økalikrein ØfXIIa, f XIa Plazminogen Plazmin Aktivace fibrinolýzy - přeměna plazminogenu na plazmin ØFibrinolýza - po formaci fibrinu dojde k navázání jak plazminogenu tak t-PA na jeho povrch ØNásledkem této vazby je tvorba komplexu, který výrazně urychluje formaci plazminu ØNa fibrin navázaný plg je výrazně lepším substrátem pro t-PA než volný plg ØNavíc – navázaný plazmin je chráněn před inaktivací a2AP Formy plazminogenu, plazminu Ø Ø Ø Ø aktivátor plg Ø ØLyz - plazminogen (mol.hmot.82 000) Ø Glu - plazmin Ø Ø Glu Ø aktivátor plg Ø Ø lyz - plazmin Ø Ø Ø Øvazebné místo pro lyzin Ø- S - S - disulfidové můstky Glu - plazminogen (mol.hmot. 90 000) Glu S -- S S -- S S S S S Fibrinolýza Ø Vnitřní cesta (krevní) Zevní cesta (tkáňová aktivace) Ø kalikrein, (FXIIa, FXIa) tPA, uPA Ø ØC1INH, ATIII PAI-1, PAI-2 Ø ØPlazminogen PLAZMIN Plazminogen Ø Ø Øa2-antiplazmin Ø Ø fibrinogen fibrin Ø FV, VIII Ø FVa,VIIIa FVai, VIIIai Štěpení fibrinogenu plazminem Aa-řetězec D-doména E-doména D-doména plazmin Fragment X Aa-řetězec, Bb 1-42 Fragment Y + + Fragment D Fragment D + Fragment E Štěpení fibrinu plazminem DD 195kDa DY 247kDa YY 285kDa XD 334kDa..... D D D D D D D D D E E E E Vznikají fibrin degradační produkty, obsahující zkříženou vazbu Inhibitory fibrinolýzy Øinhibitory plazminu: Äalfa2-antiplazmin ÄTAFI - Trombin Activated Fibrinolysis Inhibitor Øinhibitory aktivátorů plazminu: ÄPAI-1 (endotel) ÄPAI-2 (placenta) ÄPAI-3 (úloha v patofyziologii fibrinolýzy je nejasná) Ø Nespecifické inhibitory fibrinolýzy Øpřirozené inhibitory serinových proteáz: Äsvůj inhibiční vliv uplatňují zejména proti plazminu Äpatří sem: a2-makroglobulin Ä a1-antitrypsin Ä C1- esterase inhibitor Ä ATIII Äjde za fyziologických stavů o slabé inhibitory Øjiné mechanismy inhibice fibrinolýzy: ÄHRGP, trombospondin, lipoprotein (a) • TAFI Thrombin-Activated Fibrinolysis Inhibitor Øglykoprotein syntetizovaný v játrech • Øpravděpodobně koluje v plazmě v komplexu s plazminogenem • Øodštěpuje z fibrinu lyzinové zbytky Äodstraní tak vazebná místa pro plazminogen a t-PA Ä tím snižuje vznik plazminu • Øinhibuje aktivaci glu-plg a jeho konverzi na lyz-plg Ø Øuvolňuje PAI-1 z trombocytů Ø Aktivace TAFI ØPouze trombinem – neefektivní – potřebná velká množství IIa ÄV přítomnosti trombomodulinu probíhá reakce 1250x rychleji • ØAktivace plazminem pomalejší ÄVyžaduje přítomnost glykoasaminoglykanů endotelu ÄÚloha plazminu v aktivaci TAFI zatím není jasná • ØFyziologicky IIa předchází plazmin a je účinnější TAFI a trombomodulin • ØPři nízké koncentraci TM je stimulována aktivace TAFI na TAFIa (antifibrinolytické působení TM) • ØPři vysoké koncentraci TM je aktivace potlačována (zvyšována aktivace PC – profibrinolytické působení TM) • ØNavíc je zřejmě důležitá i velikost cév – koncentrace TM na endotelu stoupá směrem ke kapilárám Dvojí úloha trombomodulinu FBG Fibrin FDP IIa-TM II IIa Plg APC PC TAFIa TAFI Pln _ + + _ Fibrinolýza a koagulace ØAktivace TAFI trombinem indikuje důležitost koagulačního systému v regulaci fibrinolýzy ØVeškeré poruchy generace trombinu mají za následek i zvýšenou rychlost fibrinolýzy ØToto bylo jako první potvrzeno pro defekty FXI – krvácení z tkání s bohatou lokální fibrinolýzou ØNaopak – zvýšená aktivita TAFI je trombofilní stav Äbuď v důsledku zvýšené aktivity koagulačních faktorů Änebo samotného TAFI Ø Ø serpiny (inhibitory proteáz): Inhibovaná proteáza: ÄAntitrombin (IIa, Xa) ÄHC II (IIa, Xa) Äa-1-antitrypsinm (Xa, aPC) ÄC-1inhibitor (kalikrein, plazmin) Øsystém proteinu C: (FVa, FVIIIa) Äprotein C, S ÄC4bBP ÄTM Äinhibitor akt.proteinu C ÄEPCR ØTFPI (inhibitor zevní koagulační cesty) (TF/FVIIa/FXa) Ø nespecifické inhibitory: Äalfa2 MG (IIa, kalikrein, plazmin) Ä Přirozené inhibitory koagulace Monocyt TF TF VIIa IXa VIIIa IX VIIa Xa Va X V IIa II II Xa Va Aktivovaný trombocyt Fibrin Fibrinogen AT TFPI APC trombo Plazminogen Plazmin a2AP tPA, uPA PAI TAFI Antitrombin ØPřirozeně se vyskytující inhibitor proteáz Ø ØDalší serpiny: heparin kofaktor II, a2-antiplazmin, PAI-1, PAI-2, protein C inhibitor, a1-proteinase inhibitor (antitrypsin), a1-antichymotrypsin, C1inhibitor Ø ØSerpiny tvoří s cílovými proteinázami ireversibilní 1:1 komplex Antitrombin ØJe hlavní fyziologický inhibitor trombinu (IIa) a faktoru Xa Äinhibuje i IXa, XIa, XIIa a fragmenty, kalikrein, plazmin, TF-FVIIa Øpřítomnost heparinu a heparinu podobných látek (glykosaminoglykanů - GAG) urychluje tuto reakci 1000 – 2 000x - vazba na AT je reverzibilní ØGAG mají úlohu kofaktoru v této reakci Antitrombin Nový obrázek Rozdíl mechanismu reakce AT III s UFH a LMWH Antitrombin ØProtizánětlivé působení - schopnost AT stimulovat tvorbu prostacyklinu v buňkách endotelu Äprostacyklin působí øvazodilataci øinhibičně na destičky øinhibičně na aktivaci mononukleárů øindukci rezistence na endotoxin ØHeparin inhibuje tuto funkci AT Systém proteinu C Systém proteinu C Ø XIIa ØFVIIa-TF XIa FVIIIi Ø Ø FIX Ø FVIIIa FVIII ØFX FXa FIXa FVi Ø FVa FV Ø FII FIIa Ø Øfibrinogen FIBRIN Ca2+ TM PC APC PS Ø Protein C ØK-dependentní glykoprotein, serin. proteáza • Øsyntetizován v játrech • Øaktivován na endotelu komplexem IIa/TM • ØEPCR - receptor endotel. buněk pro PC Äpodporuje aktivaci PC na endotelu • Øza přítomnosti kofaktoru proteinu S: Äštěpí FVa, FVIIIa Ä Protein S ØK-dependentní protein Øsyntetizován v játrech, cévním endotelu, megakaryocytech a d. Øuložen v alfa-granulích trombocytů Økofaktor APC při enzymatickém štěpení kofaktorů Va a VIIIa Ønezávisle na APC přímo inhibuje faktory Va a Xa Protein S Øv plazmě je asi 60% nekovalentně vázáno (komplex 1:1) na C4BP: Äregulační protein cesty komplementu • Øvazba je reverzibilní • Øvázaný PS již nemá funkci kofaktoru • Ø Trombomodulin Øtransmembránový protein • Øtrombin vázaný na TM ztrácí koagulační aktivitu • Øv komplexu s trombinem aktivuje PC • Øv komplexu s trombinem aktivuje TAFI (thrombin activatable fibrinolysis inhibitor) • Øurychluje inhibici trombinu antitrombinem TFPI - inhibitor zevní koagulační cesty V iniciační fázi koagulace inhibuje: - uvolněný FXa - komplex TF/FVIIa - až po vazbě na FXa Je tvořen: - v endotelu Je uvolňován: - heparinem - současně s TF Monocyt TF TF VIIa IXa VIIIa IX VIIa Xa Va X V IIa II II Xa Va Aktivovaný trombocyt Fibrin Fibrinogen AT TFPI APC trombo Plazminogen Plazmin a2AP tPA, uPA PAI TAFI Poranění = poškození endotelu subendotel CÉVA TROMBOCYTY PLAZMAT.FF vasokonstrikce aktivace aktivace koagulace aktivace fibrinolýzy přiroz.inhibitory primární zátka definitivní zátka + FIBRIN definitivní zátka