Mgr. Jana Gottwaldová Optické metody-turbidimetrie, nefelometrie Turbidimetrie a nefelometrie lPatří mezi běžné analytické optické metody lv klinické biochemii se používají k stanovení velké skupiny bílkovin – tzv. „specifických proteinů“ lvyužívají rozptylu světla na heterogenních částicích v koloidních roztocích a mikrosuspenzích Turbidimetrie a nefelometrie lPrincip lRozptyl světla na heterogenních částicích je lzaložen na Tyndallově jevu: l„Rozptýlené záření na částicích má stejnou lvlnovou délku jako záření dopadající na koloidní lčástice“. lRozptýlené světlo vychází z roztoku všemi směry. l(Tyndall, britský fyzik, 19 st.) Turbidimetrie a nefelometrie lTyndallův jev - dokonalý difúzní rozptyl lplatí pro částice které mají velikost menší než 1/10 (př. IgG-20nm) vlnové délky dopadajícího záření lU částice o velikosti větší 1/10 – 1 (400-1400nm) násobek vlnové délky dopadajícího světelného záření je maximum rozptýleného světla směřováno dopředu a málo dozadu vzhledem k dopadajícímu záření – eliptický rozptyl Turbidimetrie • •Princip je založen na měření procházejícího světla zeslabeného rozptylem na částicích při průchodu světelného záření prostředím s velkými molekulami (bílkoviny) • sleduje pokles intenzity záření procházející absorbující a rozptylující vrstvou •Na částicích dochází k rozptylu záření a částečně i jeho absorpci •Závislost turbidance (odpovídá A) na koncentraci analytu je nelineární • l Turbidimetrie •K turbidimetrickému měření zákalu se využívají absorpční fotometry a spektrofotometry -jednoúčelové turbidimetry se dnes v klinické biochemii nevyužívají •měření se provádí v přímém směru, v ose světelného paprsku • ☼ M Vzorek D Turbidimetrie •měření stupně zákalu - turbidity • •využívají se precipitační reakce mezi antigenem a protilátkou • •Nutno získat dostatečně stálou suspenzi měřené reakční směsi - k tomuto účelu se používají ochranné koloidy (nejčastěji polyetylenglykol). Turbidimetrie lFotometrická citlivost je nepřímo úměrná vlnové délce. Proto se např. specifické proteiny stanovují při nejkratší vlnové délce dosažitelné standardním fotometrem, tj. při 340 nm v blízké UV oblasti. lDo střední UV oblasti nelze dál postupovat, i kdyby to spektrofometr technicky umožňoval, protože se začne projevovat absorpce nezreagovaných bílkovin, která může hrubě zkreslit měření zákalu po vzniku imunokomplexu. l Turbidimetrie lNa biochemických analyzátorech dosahují turbidimetrické metody reprodukovatelnost asi 5% lJe třeba snížit vliv interferujících látek na minimum – jakýkoliv vliv, který způsobí vznik částic odlišné velikosti (koncentrace činidel, teplota) lHemolýza a ikterus ruší méně než při nefelometrii l l Nefelometrie • •zabývá se měřením intenzity difúzně rozptýleného světla na dispergovaných částicích. • •Pro tyto účely slouží buď nefelometrický nástavec k fotometru, u nichž se difúzně rozptýlené světlo sleduje pod úhlem 90°, nebo jsou vyvinuty speciální přístroje - nefelometry nefelo1 Nefelometrie x turbidimetrie Nefelometrie lRozdělení ldle použitého zdroje záření: l lLaserový nefelometr lKonvenční nefelometry l l Laserový nefelometr lHelium neonový nebo argonový laser lTento zdroj monochromatického světla je mimořádně intenzivní a má vysoký stupeň směrovosti paprsku l lRozptýlené světlo se sleduje detektorem nastaveným pod úhlem 5 až 35° (fotonkou nebo fotonásobičem), ale ve víceúčelových přístrojích pod úhlem 90°. Laserový nefelometr lLASER = Light Amplification by Stimulated lEmission of Radiation = zesilování světla pomocí lstimulované (vynucené) emise záření lHlavní součásti laseru : lzdroj excitační energie laktivní prostředí lrezonátor l l Laser_DSC09088 Laser lHlavní součásti laseru : lzdroj excitační energie – budící zdroj působící elektrický výboj laktivní prostředí -tj. látka obsahující oddělené kvantové energetické hladiny elektronů – může se jednat o plyn (nebo směs plynů), krystaly, polovodiče lrezonátor – tvořen dvěmi zrcadly: 1.Koncové s odrazivostí 100% 2.Výstupní s odrazivostí 99%, tzn. částečně propustné, umožňující vyzařování světelného paprsku l Konvenční nefelometry lKonvenční nefelometry lpoužívají jako světelný zdroj žárovku nebo xenonovou výbojku lMonochromátor - interferenční filtr. lDetektor je nastaven pod úhlem 70 až 90o. Xenonová oblouková lampa • Poskytuje intenzivní světelné záření pomocí elektrického oblouku • Skládá se z oválné baňky vyrobené z křemenného skla ve které jsou proti sobě umístěné katoda a anoda v atmosféře xenonu • Teplota elektrického obloku se pohybuje okolo 6000 ºC • Produkuje vysoce energetické, spojité záření v UV oblasti • l Xenonová oblouková lampa l Instr_tech_nefelometr_turbidimetr 004 Nefelometrie lRozdělení podle typu měření lSystém měření v end point režimu– po smíchání antigenu a protilátky proběhne měření po dosažení rovnovážného stavu - možnost falešně negativní (nízká) koncentrace antigenu. Proto je nutné nastavení systému tak, aby měření probíhala v oblasti lineární části křivky l Měření v tomto režimu je o řád citlivější než turbidimetrie (0,1 mgl) l Nefelometrie lSystém měření v end point režimu Nefelometrie lRozdělení podle typu měření lSystém měření v kinetickém režimu - lRATE-reakce je rychlejší, měří se přírůstek vzniku precipitátu v pravidelných časových intervalech, po dosažení rovnovážného stavu (desítky vteřin) se měření ukončuje Nefelometrie lSystém měření v kinetickém režimu l Průběh imunoprecipitační reakce Heidelbergova-Kendalova křivka: Oblast ekvivalence • Oblast nadbytku protilátky Zákalové metody: nefelometrie, turbidimetrie • Oblast nadbytku antigenu • Ab - protilátka Ag - antigen lzesílení turbidance je možné dosáhnout pomocí mikročástic. Mikročástice lze „potáhnout“ protilátkami. lpři reakci těchto mikročástic s analytem dochází k tvorbě zesíťovaného kompaktního precipitujícího komplexu a k naměření vyšších hodnot turbidance. lTakto je pomocí (mikro) částic (particles) posíleno (enhanced) turbidimetrické imunostanovení (turbidimetric immunoassay). PETIA - Particle Enhanced Turbidimetric Immunoassay lpříliš malé molekuly, které samy o sobě nemohou s protilátkami tvořit nerozpustné komplexy lze „upevnit“ na mikročástice, zvětšit tímto způsobem jejich velikost a „posílit“ (enhance) tak metodu (v daném případě inhibici turbidimetrického stanovení (turbidimetric inhibition immunoassay). lmikročástice „potažené“ malými molekulami (analytem) tvoří s protilátkami zesíťované, nerozpustné komplexy. Je-li však ve vzorku pacienta přítomen analyt, soupeří tento s analytem na mikročásticích o vazebné místo na protilátce a protože sám není schopen tvorby komplexů, ruší (inhibuje) tuto tvorbu.Výsledná turbidita je mnohem nižší, než by byla bez volného analytu. PETINIA - Particle Enhanced Turbidimetric Inhibition Immunoassay Limitující faktory imunochemických stanovení lLimitující faktor: precipitát se tvoří pouze při optimálním množství antigenu a protilátky, při nadbytku některé ze složek se precipitát začne rozpouštět. l tzn. JEDNA HODNOTA KONCENTRACE lPRECIPITÁTU TAK ODPOVÍDÁ DVĚMA lKONCENTRACÍM ANTIGENU – možnost vydání lfalešně negativního výsledku l Imunoprecipitační křivka podle Heidelberga a Kendalla l Detekce nadbytku antigenu lNěkolik způsobů: lKontrola přídavkem naředěného antigenu po lproběhnuté imunoprecipotační reakci – následuje lautomatické opakování analýzy s vyšším ředěním. l lPřídavek malého množství vzorku k činidlu lpřed vlastní reakcí – je-li po krátké inkubaci lpřekročen koncentrační práh zjištěný při kalibraci, lvzorek se měří automaticky znovu při vyšším lředění l l l Detekce nadbytku antigenu Instr_tech_nefelometr_turbidimetr 007 1.V případě zachování nadbytku Ab dojde další tvorbě imunokomplexů a nárůstu intenzity rozptýleného světla 2.Pokud byla protilátka již spotřebována, nevede přidání dalšího antigenu k tvorbě imunokomplexů a na detektoru nezjistíme žádnou odezvu – reakce se automaticky opakuje při vyšším ředění 3. Imunochemický systém - IMMAGE 800 lAnalyzátor výrobce Beckman Coulter l využívá turbidimetrického a nefelometrického principu lPracuje v kinetickém režimu - měří zvýšení intenzity světla rozptýleného částicemi v kyvetě v čase l IMMAGE 800 - reagenční část lReagenční karusel pro 24 reag. kazet lTeplota 15°C l4 lahvičky s pufry bez chlazení lReag. kazety značené čárovým kódem lOtevřený systém lSoftwarová kapacita -50 metod lKalibrační data- kal. křivka výrobce má 8-12 bodů, provádí se pouze jednobodové ověření l l Vzorková část lVzorky ve zkumavkách s čár. kódem lVzorkový karusel pro 8 stojánků po 9 vzorcích l ředící roztoky pro vzorky l ředící segmenty pro ředění vzorků lKapacita: 180 testů za hodinu, v sérii lze provést 12 metod Reakční část lReakční karusel – 39 reak. plastových kyvet, l 1 referenční – známá hodnoty rozptylu, nastavení optického systému lTeplota 37°C lOptika – zdroje záření, detektory Turbidimetrie lměření stupně zákalu (turbidity) – v důsledku imunoprecipitační reakce lMěří se snížení intenzity světla při průchodu roztokem částic v kyvetě v důsledku rozptylu světla lImmage pracuje v kinetickém režimu – hodnotí rychlost nárůstu zákalu v čase lNIPIA= imunoanalýza na částicích v blízké l infračervené oblasti l l Turbidimetrie lZdroj pro NIPIA: světlo emitující dioda – poskytuje monochromatické záření λ = 940 nm lDetekce záření: v přímém směru, v ose světelného paprsku zdroje v blízké IR oblasti (940 nm) lVyžití: stanovení FLC l Nefelometrie lZdroj: helium-neonový laser – dává monochromatické záření o λ = 670 nm lDetekce: detektor je umístěn v úhlu 90° ke směru laserového paprsku lVyužití: stanovení specifických proteinů v séru, v likvoru a moči l Nefelometrie lZdroj: helium-neonový laser – dává monochromatické záření o λ = 670 nm lDetekce: detektor je umístěn v úhlu 90° ke směru laserového paprsku lVyužití: stanovení specifických proteinů v séru, v likvoru a moči l Řešení problému s imunoprecipitační křivkou lNutno provést taková opatření, aby nedošlo k omylu při odečítání vyšších koncentrací antigenu lIMMAGE : detekce nadbytku antigenu l pomocí přídavku dalšího antigenu po ukončení reakce Jestliže nenavázaná protilátka … Přídavek dalšího antigenu bude mít za následek… Systém IMMAGE… Je přítomna Zvýšení poměrové odezvy Použije k výpočtu výsledku původní poměrovou odezvu Není přítomna Žádné zvýšení poměrové odezvy Vzorek automaticky zopakuje s vyšším ředěním s testem na přebytek antigenu dokud nezíská správný výsledek Automatizovaný nefelometr BN Pro Spec lVýrobce: Siemens (dříve Dade Behring) lMax. provozní rychlost 180 analýz za hod. lPracuje v režimu po vzorcích lK dispozici je více než 60 metod lZdroj světla: LED dioda (840 nm) lDetektor – křemíková fotodioda je umístěn pod úhlem 13-24 º l l l l Automatizovaný nefelometr BN Pro Spec lReagenční disk je temperován na 8ºC,v lanalyzátoru lze umístit 35 činidel lReakční disk: 60 polystyrénových kyvet pro opakované použití lMěření probíhá při 37 ºC lDélka inkubace je 6-12 min. lVzorková část: lze umístit až 100 vzorků, umožňuje používat primární, sekundární zkumavky a kepy l l l Nefelometr Array 360 lVýrobce: Beckman Coulter lMěření v kinetickém režimu lRychlost 40-80 analýz za hod. lZdroj světla: halogenová žárovka (400-620 nm) lDetektor:křemíková fotonka lK dispozici asi 60metod lNevýhoda:pracovní teplota pouze 26,7 ºC, velký mrtvý objem, stabilita kalibrace pouze 14 dní l l Nefelometr - Delta lVýrobce Radim lZdroj světla laser (670 nm) lK dispozici 100 metod lRychlost 150 analýz za hod. (startovací čas 30 min., ukončovací čas 15 min. !) lReagenční část: 54 pozic pro reagencie, chlazená lReakční část:120 omyvatelných kyvet, temperovaných na 37 ºC lVzorková část: pro 80 vzorků Turbox plus lJednoduchý manuální nefelometr lVýrobce: ORION Diagnostica lLze měřit až 100 vzorků za hodinu lZdroj světla je LED dioda (635 nm) lDetektor: 2 fotodiody lTovární kalibrace je na magnetické kartě Optické metody (pokrčování) – fluorescence, fluorimetrie Luminisceční metody lLuminiscence – je emise světla při návratu elektronu lz excitovaného stavu na nižší energetickou hladinu l lDruhy luminiscence: vFluorescence lFosforescence lChemiluminiscence lVzájemně se liší: lzpůsobem aktivace elektronu do excitovaného stavu lzpůsobem vyzáření energie Fluorescence l druh luminiscence, u níž dochází k emisi světla v čase kratším než 10-8 s lJe to emise elektromagnetického záření při přechodu mezi dvěma stavy téže multiplicity (obvykle dvěma singlety) lmolekuly absorbují světlo při jedné vlnové délce (excitační) a reemitují při větší vlnové délce (emisní) Fluorescence a fosforescence l Fluorescence lPři excitaci se molekuly dostanou na vyšší energetickou hladinu a při návratu do základního stavu se část energie vyzáří také ve formě tepla. lProto má emitované záření fluoreskujících sloučenin vždy vyšší vlnovou délku (tj. méně energie) než excitační záření, vyvolávající fotoluminiscenci l Fluorescence lStokesův posun lrozdíl mezi vlnovou délkou excitačního primárního) la emitovaného (sekundárního) záření l Fluorimetrie lPřístroje, které se používají k měření intenzity emisního záření se nazývají fluorimetry l l ☼ Mexcit Vzorek Memis D Fluorimetry lZdroj světla:xenonová nebo xenono-rtuťová lampa (300-550 nm) lMonochromátor pro výběr excitačního záření lAbsorpční prostředí – křemíková kyveta lMonochromátor pro sekundární emisní záření lDetektor: fotonásobič, je umístěn pod úhlem 90ºvzhledem ke zdroji záření l l Fluorimetrie lImunochemické metody s fluorescenční detekcí lIntenzita fluorescence je úměrná koncentraci fluoroforu lMetody jsou řádově citlivější než měření absorbance (100-1000x) lFluorescence je více specifická, protože existuje jen málo přirozených fluoroforů, které by mohly způsobit interferenci Fluorimetry lAutomatizované imunoanalyzátory lFluorescenční polarizované systémy – TDx, Imx lDELFIA – imunoreagencie značené europiem lPrůtoková cytometrie l Fluorofory Přirozené fluorofory •Tryptofan •porfyriny Analytické fluorofory •Fluorescein •Methylumbelliferon •Methylumbelliferonfosfát (MUP) •Cheláty lanthanidů (Europium) - látky, které fluoreskují. Většina obsahuje konjugované dvojné vazby Děkuji za pozornost