Etanol Miroslava Beňovská Etanol nEtanol je obsažen v alkoholických nápojích: whisky, slivovice apod. obsahují 30 – 60 %, vína 6 – 12 % a pivo 2 – 5 % etanolu n nV klinické praxi se vyskytují: nProjevy chronického zneužívání (alkoholické léčebny, psychiatrie) nAkutní otravy způsobené záměrným nebo i náhodným požitím velkého množství etanolu, často v kombinaci s požitím různých léků a drog nKlinická oddělení potřebují rychle npotvrdit či vyloučit otravu alkoholem nzvolit odpovídající terapii n nK tomu nejčastěji slouží enzymatické stanovení etanolu Etanol nPo požití se etanol rychle vstřebává již v žaludku ( rychleji na lačno) nRychle proniká prakticky všemi membránami včetně placenty n nPoměrně rychle se v organismu metabolizuje: n nejdříve působením alkohol - dehydrogenázy vznikne acetaldehyd n Etanol + NAD+ <----à Acetaldehyd + NADH + H+ n Acetaldehyd se působením aldehyd-dehydrogenázy mění na acetyl-CoA n Acetaldehyd + NAD+ <----à Acetyl-CoA + NADH + H+ n n Konečným produktem metabolizace je kyselina octová (respektive CO2 a voda) nRychlost eliminace etanolu z organismu je u konkrétního jedince prakticky konstantní ( u mužů asi 100 mg etanolu na kg tělesné hmotnosti za hodinu, u žen jen asi 85 mg/kg/hod ) nMetabolizace bývá ukončena během 6 – 8 hodin nAsi 5 % požitého etanolu se vylučuje z organismu v nezmetabolizované formě močí, potem apod. Etanol nKlinické údaje: nEtanol se vstřebává v gastrointestinálním traktu a dostává se do krve n0,6-0,8 ‰(g/l ) - počínající opilost n1-2 ‰ opilost nPřes 2 ‰ těžkou intoxikaci nSmrtelná dávka je 6-8 g/kg tělesné hmotnosti ( tedy u dospělého asi 300-500 g etanolu) nPři chronickém používání vznikají nemoci jaterní, poškození ledvin a nemoci nervové nEtanol zvyšuje citlivost organismu na otravy některými látkami (tetrachlormetan, anilin, olovo, rtuť); interakce s řadou léků Etanol nKlinické údaje: n nKoncentrační časový profil v krvi, dechu i slinách je prakticky stejný nPomocným kriteriem při stanovení etanolu je srovnání naměřené osmolality séra a vypočtené osmolality (2x Na + glukoza + urea) - Osmolární gap 23 mmol/kg odpovídá cca 1 ‰ etanolu n nReferenční rozmezí: 0 mmol/l , 0 g/kg neboli promile (o/oo) n nPoznámka: Přepočet výsledku - mmol/l / 22,32 = o/oo n n Etanol nOdběr materiálu: nOdběr pro stanovení etanolu - do běžných odběrových zkumavek (sérum, plasma) nNabrat plnou zkumavku nZabránit použití desinfekčních prostředků obsahujících alkohol nVzorky ihned po odběru dobře uzavřít (pokud se stanovení neprovádí bezprostředně, uchovávat při 2 – 8 °C) n Stanovení etanolu v krvi, séru a plasmě: nEnzymaticky: nEnzymatický test prováděný na automatických analyzátorech je založen na oxidaci alkoholu s NAD+ na acetaldehyd za katalýzy alkoholdehydrogenasy ( ADH). n ADH n C2H5OH + NAD+ <---à CH3CHO+ NADH + H+ n nVznikající NADH je přímo úměrný obsahu alkoholu ve vzorku a fotometricky se stanovuje při 340 nm n nMetoda je specifická pro etanol i v přítomnosti acetaldehydu, acetonu, butanolu, etylenglykolu, izopropanolu, metanolu a propanolu v koncentracích do 20 g/l n nStanovení není určeno pro soudně lékařské a forenzní účely n Stanovení etanolu v krvi, séru a plasmě: nHeadspace plynová chromatografie nKrev je zahřívána ve speciální uzavřené lahvičce n nZahřátím se etanol uvolní z krve do vzduchového prostoru v lahvičce ( headspace ) n nUrčitá část z tohoto prostoru je automaticky injektována do plynového chromatografu n nPřed analýzou jsou vzorky krve nebo séra naředěny roztokem chloridu sodného s obsahem n-propanolu jako vnitřního standardu. Chlorid sodný zvyšuje tlak par etanolu a eliminuje rozdíly v matrici n nPlynová chromatografie je jediná metoda použitelná pro forenzní (soudní) účely sejmout0001 Stanovení etanolu nDechová zkouška– screeningový test nČasté použití vzhledem k nebezpečnosti a protizákonnosti či limitaci požití alkoholu při řízení motorových vozidel a v zaměstnání n nPrincip: n IČ absorpční spektroskopie ( nejčastěji) n Fotometrie - etanol se při oxidačně – redukční reakci n s bichromanem v prostředí kyseliny n sírové oxiduje na kyselinu octovou n Elektrochemická oxidace n nMezi alkoholem v krvi a v dechu je ustavena rovnováha přibližně 2100:1 (krev : dech) Stanovení etanolu nVe slinách nSnadný a neinvazivní sběr nSliny absorbovány do vatového tamponu, ten vložen do testovací kartridže nReakce založena na reakci s ADH s vizuální end point detekcí (2 min inkubace) nKoncentrace odpovídá sérovým hodnotám n nV moči nKoncentrace alkoholu je přibližně 1,3x vyšší než v krvi - může být variabilní, omezený význam stanovení nPři stanovení etanolu v moči vadí obsah cukrů v moči, který může způsobit pozitivní interferenci v důsledku metabolizace cukrů na etanol Intoxikace metanolem a stanovením jeho metabolitu – kyseliny mravenčí Aféra metanol nNa podzim roku 2012 série otrav metanolem nIntoxikace způsobeny konzumací pančovaných alkoholických nápojů s nejasným původem nPřijetí řady opatření zamezujících prohloubení krize (zákaz prodeje a vývozu nápojů s obsahem alkoholu nad 20%) nV souvislosti s intoxikací metanolem hospitalizováno 117 osob, z toho 37 zemřelo nStále existuje velké množství tohoto nebezpečného alkoholu nMetabolismus metanolu nI když metanol samotný tlumí funkci centrálního nervového systému, největší míra toxicity je způsobena až jeho metabolity – formaldehydem a především kyselinou mravenčí vznikající v játrech (obr. 1). Působením alkoholdehydrogenázy dochází k pomalé přeměně metanolu na formaldehyd, který se pak rychle oxiduje v přítomnosti aldehyddehydrogenázy na kyselinu mravenčí. Alternativní cestou odbourávání metanolu je oxidace folátovou metabolickou dráhou. Reakce je pomalá a její rychlost se zvyšuje s koncentrací kyseliny folinové, což je aktivní redukovaná forma kyseliny listové. Konečným produktem oxidace metanolu je oxid uhličitý a voda. nCelková eliminace metanolu je pomalá, odpovídá zhruba 1/7 rychlosti odbourávání etanolu. Etanol má ve srovnání s metanolem asi dvacetkrát vyšší afinitu k alkoholdehydrogenáze a je tedy preferovaným substrátem. Z výše uvedených fakt vyplývá, že velmi záleží na poměru metanol : etanol. Je-li v požitém destilátu výrazně více etanolu, přetrvává metanol v těle a je postupně vylučován plícemi a močí, aniž by se hromadil ve formě kyseliny mravenčí. n Laktát nLaktát (sůl kyseliny mléčné) vzniká především v kosterním svalstvu, mozku, kůži a erytrocytech n nPřibližně 65% laktátu je zpracováno v játrech n nVětší množství laktátu vzniká při dlouhodobé intenzivní fyzické aktivitě n nLaktát je konečným produktem glykolýzy za anaeorobních podmínek n nSignifikantní laktátovou acidózu představuje koncentrace laktátu větší než 5 mmol/l a pH menší než 7,25 n nPot obsahuje značné množství laktátu - zabránit dotykání se špiček n nReferenční rozmezí P- laktát : 0,6 - 2,3 mmol/l n CSF-laktát : 1,2 - 2,1 mmol/l Laktát Stanovení v plasmě a likvoru nPreanalytické požadavky: n nK odběru pro stanovení v plasmě se využívají zkumavky s fluorid/EDTA nebo fluorid/oxalátem n nVzorek je nutné stočit co nejdříve, nejpozději do 2 hod po odběru Stanovení laktátu s laktátdehydrogenasou: n n LD n L - laktát + NAD+ <-------------à pyruvát + NADH + H+ n (pH 9-9,6) n n ALT npyruvát + L - glutamát <-------------à- L-alanin + oxoglutarát n nReakce laktát - pyruvát běžně běží výrazně vlevo n nPři pH 9 - 9,6 a následné reakci, kdy je spotřebováván pyruvát se rovnováha posunuje vpravo n nFotometricky se měří nárůst absorbance NADH při 340 nm Stanovení laktátu s laktátoxidasou: nLaktát je v přítomnosti specifického enzymu laktátoxidasy oxidován na pyruvát: n LOD n L - laktát + O2 < ------------------- > pyruvát + H2O2 n nPeroxid vodíku dále reaguje oxidační kopulací n např. s 4-aminofenazonem a 1,7 – dihydroxynaftalenem v přítomnosti peroxidasy (POD) za vzniku barviva - absorbance je přímo úměrná koncentraci laktátu n n POD n 2 H 2O2 + 1, 7 – dihydroxynaftalen + 4-aminoantipyrin+ < ------- > n n barvivo + 4H2O Stanovení laktátu v hemolyzátu či plasmě nElektrochemicky na POCT či glukometrech s využitím biosenzoru n nS využitím kapilárního odběru n nV senzoru je zabudován enzym LOD, který katalyzuje vznik peroxidu vodíku n L - laktát + O2 < ----- > pyruvát + H2O2 n nPeroxid vodíku se rozkládá na platinové elektrodě za uvolnění elektronů – generovaný proud se stanoví amperometricky n n