Vyšetřovací metody v bakteriologii Jana Juránková OKM FN Brno Vyšetřovací metody v mikrobiologii •Přímý průkaz – průkaz přítomnosti bakterií nebo virů– bakteriologie, virologie • •Nepřímý průkaz – průkaz reakce makroorganizmu na přítomnost bakterií nebo virů - sérologie Vyšetřovací metody v bakteriologii •Mikroskopie •Kultivace •Průkaz antigenů •Průkaz metabolitů •Průkaz nukleových kyselin Mikroskopie •Preparát nativní •Preparát barvený –Monochromatické barvení –Barvení podle Grama –Barvení podle Giemsy –Barvení podle Ziehl – Nielsena –Barvení spor –Barvení pouzder –Fluorescenční barvení – – – Nativní preparát •Suspenze materiálu nebo kultury ve fyziologickém roztoku • •Pro pozorování živých mikroorganizmů, posouzení jejich pohyblivosti • •100 – 400násobné zvětšení • Nativní preparát - využití •Bakteriologie – sledování typického pohybu bakterií (listerie) •Parazitologie – průkaz střevních parazitů ve stolici •Mykologie – sledování růstu a množení kvasinek • • Nativní preparát nativní preparát kvasinky Barvení podle Grama •Hans Christian Joachim Gram, 1884 • •Dělí bakterie do dvou základních skupin • –Grampozitivní G +, modrofialové –Gramnegativní G -, růžovočervené – Barvení podle Grama •Barvitelnost podle složení buněčné stěny •Fixace plamenem •Postup barvení: –Krystalová violeť – 20 s –Lugolův roztok – 20 s –Oplach vodou –Odbarvení acetonalkoholem – 10 s –Safranin – 1 min – – Barvení podle Grama •Mikroskopie při 1000násobném zvětšení • •Pozorování pomocí imerzního oleje mezi preparátem a objektivem Barvení podle Grama Grampozitivní • s_1206000345 Barvení podle Grama Gramnegativní P1010132 Barvení podle Grama Význam •Diagnostické barvení – základ klasifikace a taxonomie bakterií • •Možnost okamžité a racionální antibiotické terapie Barvení podle Giemsy •Původně podle Giemsy – Romanovského •Slouží k diferenciaci buněčných struktur •Použití hlavně v parazitologii –Mikrobiální obraz poševní – průkaz Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem Barvení podle Giemsy •Azur a eosin rozpuštěný ve směsi glycerinu a metanolu • •Ředěn neutrální destilovanou vodou • •Roztok není stabilní, používá se vždy čerstvý Barvení podle Giemsy • patientImages%255C8327 Barvení podle Ziehl - Nielsena •Barvení acidorezistentních tyčinek –Špatně barvitelné –Vysoký obsah lipidů v buněčné stěně – •Nejčastěji Mycobacterium sp. Barvení podle Ziehl - Nielsena •Fixace teplem •Barvení karbolfuchsinem •Zahřátí •Odbarvení kyselým alkoholem •Oplach •Dobarvení malachitovou zelení • Barvení podle Ziehl - Nielsena • M_BI_MB_02 Barvení pouzder •Pouzdra pevně lnou k buněčné stěně •Faktor virulence •Nepřijímají běžná barviva •Negativní barvení tuší •Na tmavém pozadí světlé dvorce pouzder •Význam pro posouzení virulence bakterií (pneumokoky) Negativní barvení • Negativecocci Fluorescenční barvení •Pomocí fluoreskujícího barviva •Imunofluorescence –Na hledaný antigen se naváže protilátka označená fluoreskujícím barvivem •Pozorování pomocí fluorescenčního mikroskopu Fluorescenční barvení • fapos Kultivační průkaz •Základní mikrobiologický postup •Cílem je získat mikroba z klinického materiálu v čisté kultuře •Identifikovat ho •Určit citlivost k antimikrobním přípravkům • • Kultivační půdy • •Dělení podle konzistence • –Tekuté – k pomnožení bakterií –Polotuhé – ke sledování pohybu bakterií –Tuhé, pevné Kultivační půdy •Dělení podle funkce –Základní – masopeptonový bujon, krevní agar –Diagnostické – obsahují látky, které se mění vlivem metabolizmu bakterií (např. štěpení laktózy) –Selektivní – k výběrovému růstu bakterií, obsahují látky, které potlačují některé bakterie –Selektivně diagnostické Kultivační půdy •Dělení podle funkce (pokračování) • –Transportní - k transportu bez množení – umožňují přežití bakterií při transportu –Pomnožovací – tekuté, k pomnožení bakterií ve vzorku, mohou být i selektivní Podmínky kultivace •Dostatečná vlhkost prostředí •Optimální teplota - 37° C (4° C, 40° C) •Optimální pH půdy – 7,2 – 7,4 •Vhodná izotonie média – 0,5 – 1% NaCl •Dostatek vhodných živin •Vhodné plynné prostředí Dělení bakterií podle vztahu ke kyslíku •Striktně aerobní •Fakultativně anaerobní •Striktně ananerobní •Anaerobní aerotolerantní •Mikroaerofilní •Kapnofilní • Anaerostat P1010162 Nádoba pro anaerobní kultivaci P1010166 Termostat se zvýšenou tenzí CO2 P1010116 Kultivační půdy •Masopeptonový bujon •Krevní agar •Čokoládový krevní agar •Levinthalův agar •Endova půda •Sabouraudův agar •Desoxycholát – citrátový agar •Chromagary • Pomnožovací bujóny P1010159 Krevní agar S Krevní agar a Endova půda ESCO- izolace na KA+McC Endova půda • Ecoli_Feb07 Masopeptonový bujón • bujon Chromagar • 29h16p Identifikace bakterií •Podle morfologie •Podle růstových vlastností •Podle biochemických vlastností –Selektivní půdy –Komerční diagnostické soupravy •Podle antigenní struktury –Latexová aglutinace • Biochemické určení bakterií P1010093 Biochemické určení bakterií P1010151 Stanovení citlivosti na antibiotika •Disková difúzní metoda –Difuze antibiotik z disků do půdy a zábrana růstu bakterií – •Diluční testy –Stanovení koncentrace antibiotika, která je ještě na mikroba účinná Disková difúzní metoda přelévaný test Diluční metoda destička MIC 2 Průkaz antigenů z materiálu •Latexová aglutinace • •Rychlá vyšetřovací metoda např. mozkomíšního moku – Latexová aglutinace P1010143 Průkaz metabolitů •Těžko kultivovatelné bakterie • •Rychlý průkaz –Např.infekce Helicobacter pylorii – průkaz produkce ureázy Průkaz nukleových kyselin •Průkaz přítomnosti mikroorganizmu v klinickém vzorku • •Druhové identifikace izolovaného mikrobiálního kmene