Serologické vyšetřovací metody Serologické reakce • Přímý průkaz • üprůkaz antigenu üprůkaz nukleové kyseliny • Nepřímý průkaz • üprůkaz protilátek Nepřímý průkaz • = průkaz specifických protilátek neboli průkaz serologický • •serologické reakce – reakce mezi antigeny a protilátkami in vitro •Materiál: 5 - 7 ml srážlivé krve, likvor, punktát Přehled serologických metod 1.Precipitace 2.Aglutinace 3.Komplement fixační reakce (KFR) 4.Neutralizace 5.Reakce se značenými složkami: – - imunofluorescence – - enzymová imunoanalýza – - Western blot (imunoblot) • • • Precipitace •antigen koloidní povahy •precipitační neboli vločkovací testy na lues •VDRL, RRR, RPR • • kardiolipin + protilátky v séru precipitace P5280008 vdrl2 Aglutinace •antigen korpuskulární povahy •antigen + hledaná protilátka viditelný shluk (aglutinát) •přímá, nepřímá (na nosičích) •průkaz protilátek u salmonelózy (Widalova reakce), yersiniózy, listeriózy, tularémie P2080013 Aglutinace – průkaz protilátek proti Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis Aglutinace na nosičích •antigen navázaný na vhodnou částici: ü latex – latexová aglutinace ü erytrocyt – pasivní hemaglutinace • •TPHA – T. pallidum hemagglutination – erytrocyty potažené treponemovým Ag protilátky v séru hemaglutinace + P5280004 TPHA – průkaz protilátek proti T.pallidum pasivní hemaglutinací Komplement fixační reakce • ükomplex antigen + hledaná protilátka ükomplement üindikátorový neboli hemolytický systém (beraní erytrocyty senzibilizované králičí protilátkou) ü ü • zábrana hemolýzy hemolýza • pozitivní reakce negativní reakce cf_test2 Komplement fixační reakce pozitivní negativní Neutralizační reakce •protilátka brání biologickým účinkům antigenu •ASLO – průkaz antistreptolyzinu O • • přítomnost ASLO ve vyšetřovaném séru • • zábrana hemolýzy • pozitivní reakce P2090016 Neutralizační reakce - průkaz ASLO Imunofluorescence •jedna složka značena fluorescenčním barvivem, průkaz pomocí fluorescenčního mikroskopu •přímá – průkaz antigenu: T.pallidum •nepřímá – průkaz protilátek: syfilis, ehrlichióza, HHV6 • trepon01 Nepřímá imunofluorescence - protilátky proti T.pallidum Enzymová imunoanalýza •jedna složka značena enzymem, který rozloží přidaný substrát za vzniku barevného produktu •Výsledek: barevná reakce •Hodnocení: měření absorbance •ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) •průkaz antigenu: HBsAg, respirační viry, chlamydie •průkaz protilátek: univerzální použití Princip metody ELISA elisa3 Obrázek2 P2080015 ELISA – průkaz HBsAg Souprava pro vyšetření metodou ELISA Western blot • Antigen rozdělený na jednotlivé polypeptidy dle molekulové hmotnosti na nitrocelulózovém pásku 1.vazba hledaných protilátek ze séra na příslušné antigenní frakce 2.přidání protilátky značené enzymem 3.přidání substrátu 4.výsledná reakce – barevný proužek Obrázek2 P5280005 Western blot T.pallidum IgG Autoblot 2000, Medtec, USA Snímek 004 Autoblot 6000, Medtec, USA WB02 Western blot B.garinii IgG Interpretace serologických výsledků •průkaz protilátek svědčí pro setkání s antigenem (kdy ?), k diagnóze infekce většinou nestačí •vyjímka: syfilis, infekce HIV • •dynamika imunitní reakce: • • setkání s antigenem průkaz protilátek 10 dní •IgM – první protilátky, přetrvávají týden až několik měsíců, svědčí pro čerstvou infekci •IgA – přetrvávají o něco déle, svědčí pro čerstvou nebo nedávnou infekci •IgG – nejvyšší hladina měsíc po začátku onemocnění, mohou přetrvávat roky abtime Serologický průkaz infekce •vyšetření dvou vzorků séra: akutní na začátku onemocnění, rekonvalescentní za 10 až 14 dní •průkazný nález: čtyřnásobný vzestup titru nebo serokonverze •vzorky nutno vyšetřit zaráz ! • • titr protilátek = nejvyšší ředění, v němž ještě došlo k prokazatelné serologické reakci PCR •polymerázová řetězová reakce •přímý průkaz NK bakterií, virů, kvasinek, parazitů •různé modifikace •výhody: vysoká specificita, rychlost, ATB nejsou kontraindikací vyšetření •nevýhody: vysoká cena, přístrojové vybavení, riziko kontaminace P2090017 PCR – LightCycler (Roche) Princip PCR •opakované cykly tří jednoduchých reakcí: –denaturace dvojšroubovice hledané DNA na dvě izolovaná vlákna (94 °C) –annealing - připojení dvou krátkých syntetických nukleotidů (primery) na tato vlákna (54 – 65 °C) –prodlužování primerů v přítomnosti vhodných reakčních složek a enzymu Taq-polymerasy za vzniku dvou kopií hledané DNA (72 °C) pcranimatie