Lékařská mykologie Iva Kocmanová Motto… Invazivní mykotické infekce jsou závažnou infekční komplikaci nejen u nemocných imunokompromitovaných nádorovým onemocněním a jeho léčbou nebo HIV-pozitivitou, ale v poslední době i u nemocných dlouhodobě hospitalizovaných na jednotkách intenzivní péče, po těžkých chirurgických zákrocích apod. V porovnání s bakteriálními infekcemi je jejich výskyt méně častý, nicméně jejich incidence narůstá a jsou spojeny s vysokou mortalitou. Kromě toho se mění epidemiologie tohoto onemocnění, neboť každým rokem se rozšiřuje spektrum hub, které jsou nově izolovány z humánních materiálů jako etiologická agens. Houby, které byly dříve považovány za saprofyty nebo původce povrchových infekcí, se začínají uplatňovat jako invazivní patogeny Úvod 2. Houby jsou organismy eukaryotní (pravé jádro, mitochondrie..), jednobuněčné i vícebuněčné, heterotrofní… 1. Mykologie – nauka o houbách (řec. mykes, lat. fungi) 3. Základní dělení: Øhouby mikroskopické (mikromycety) Øhouby makroskopické (těmi se zabývat nebudeme) Osnova 2. Patogeneze nemocí způsobených houbami (mykózy) 1. Rozmnožování hub, názvosloví 3. Léčba mykóz - antimykotika 4. Vyšetřovací metody v mykologii (mikroskopie, kultivace, sérologie a molekulárně biologické metody) 5. Nejčastější mykózy (kandidóza, aspergilóza, kryptokokóza, fusarióza, zygomykóza, dermatomykóza……) 1. Rozmnožování hub Textové pole: • • • pohlavní stadium (teleomorfa) a nepohlavní stadium (anamorfa) anamorfa + teleomorfa = holomorfa ANAMORFA A TELEOMORFA Penicillium repens (anamorfa) a Eurotium repens (telemorfa) - zdroj:www.myko.cz meióza (spory) mitóza (konidie) 1. Názvosloví hub Textové pole: • • • Systematika hub je velmi složitá a stále ve vývoji (rozvoj genetických metod, anamorfa x telemorfa) V současné době existují 2 přístupy: Margulisová (houby s.l. do dvou říší) Cavalier-Smith (houby s.l.do tří říší) 1. Názvosloví hub Textové pole: • • • Øvětšina medicínsky významných hub se vyskytuje jako anamorfy (nepohlavní stadia) Øpokud je teleomorfa (pohlavní stadium) známá, mělo by mít její pojmenování přednost – což se ovšem v klinické praxi obvykle neděje •Candida krusei •Issatchenkia orientalis •Scedosporium apiospermum •Pseudoallescheria boydii •Penicillium •Eupenicillium, Talaromyces •Aspergillus •Eurotium, Emericella, Petromyces, Neosartoria •anamorfa •teleomorfa 1. Názvosloví hub v klinické praxi…. Textové pole: • • • A) Kvasinky a jim podobné Ømikroskopicky kulaté nebo protáhlé buňky, 3-6 x 3-15 µm Ønepohlavní rozmnožování pučením a dělením Øna pevných půdách kolonie podobné bakteriálním rody Candida, Trichosporon, Cryptococcus etc. B) Vláknité houby (plísně) Øsloženy ze soustavy hyf (mycelium) jednobuněčné/mnohobuněčné Ønepohlavní rozmnožování rozrůstáním hyf, nebo vegetativní „spory“ Øna pevných půdách vláknité povlaky (hyalinní mikromycety – Aspergillus, Fusarium…, zygomycety - Rhizopus, Mucor.., pigm. mikromycety –Scedosporium, Alternaria.., dermatofyta –Trichophyton, Microsporum..) 1. Názvosloví hub v klinické praxi…. C) Dimorfní houby Ørůst ve dvou formách (kvasinkové a vláknité) v závislosti na teplotě Øimportované (endemické) mykózy (Severní i Jižní Amerika, Dálný Východ) Ø rody Histoplasma, Blastomyces.. D) Ostatní Øpřeřazeny z parazitů díky studiu genomu Ønekultivovatelné (nebo obtížně) Pneumocystis jiroveci, Microsporidium spp... candida gcandidumx1000 rhizopus-stolonifer-2-rem1250 fusarium1 1. Houby - zástupci Candida Fusarium Rhizopus Geotrichum candida gcandidumx1000 rhizopus-stolonifer-2-rem1250 fusarium1 1. Houby - zástupci Candida Fusarium Rhizopus Geotrichum irpex_lacteus1 Irpex lacteus 2. Patogeneze mykóz Textové pole: • • • Houby až na výjimky (dermatofyta, endemické mykózy) nejsou primárně patogenní (mohou kolonizovat kůži i GIT…), ale jsou oportunními patogeny což znamená, že ke vzniku onemocnění (invazivního/neinvazivního) napomáhá přítomnost nějaké predispozice hostitele - tedy tzv.rizikové faktory (onkologická onemocnění a jejich léčba, léčba kortikoidy, diabetes, pobyt na JIP, nezralí novorozenci – ale i léčba antibiotiky, vlhká zapářka apod) Pro vznik život ohrožujících - invazivních infekcí - je největším rizikem neutropenie (obrana organismu proti houbám závisí nejvíce na buněčné imunitě) 2. Mykózy - rozdělení Textové pole: • • • Lokální infekce (povrchové a slizniční mykózy) infekce kůže, kožních adnex a sliznic (dermatomykózy a kandidózy) Celkové infekce (invazivní mykózy) sepse (nejč.kandidové), pneumonie (nejč.aspergilové), diseminované mykózy Mykotoxikózy obvykle alimentární otravy způsobené toxiny hub (Claviceps purpurea, Aspergillus..), které kontaminují potravu (ergotismus-námel, aflatoxiny..) Alergická onemocnění přecitlivělost na části hub (konidie, části hyf..) 3. Antimykotika (léčba mykóz) Dle použití Ølokální Øcelková Dle struktury molekuly Øalyeny (amfotericin a jeho lipidové formy, nystatin) Ø Øazoly (flukonazol, itrakonazol, vorikonazol, clotrimazol..) Ø Øechinokandiny (caspofungin, micafungin, anidulafungin) Ø Øantimetabolity (flucytosin) Ø Øalylaminy (terbinafin) Ø Øostatní (k.undecylová, ciclopiroxolamin) Medical Mycology: The Last 50 Years 5-FC Miconazole Ketoconazole Fluconazole Itraconazole L-AmB ABCD ABLC Terbinafine # of drugs 3. Alyeny – změna permeability buněčné membrány (vazba na ergosterol) Textové pole: • • • Ergosterol Amphotericin B, jeho lipidové formy, nystatin Binding to ergosterol, Intercalation of cell membrane K+ Na+ Ca++ Ca++ Na+ K+ Leakage of intracellular cations and proteins nefrotoxické Cell membrane Ergosterol Azole (flukonazol, vorikonazol, posakonazol..) Squalene Ergosterol Synthesis Pathway Toxic sterols Accumulation of toxic sterols in cell membrane Inhibition of 14-alpha-demethylase hepatotoxické, mnoho interakcí, monitorace hladin 3. Azoly – inhibice syntézy ergosterolu (cytochrom P450) Mannoproteins ß(1,6)-glucan ß(1,3)-glucan Chitin Phospholipid bilayer of cell membrane ß(1,3) glucan synthase glucan synthase inhibitor Inhibition of ß(1,3) glucan synthase takřka bez nežádoucích účinků, drahé 3. Echinokandiny – inhibice syntézy glukanu 4. Vyšetřovací metody v klinické mykologii Textové pole: • • • 1.Mikroskopické metody 3.Sérologie (stanovení antigenu, protilátky) 4.Molekulárně-biologické metody (nestandardní) aspergillus_terreus 2.Kultivační metody A) nativní preparát Øčasto v KOH, lze dobarvit buď nespecificky (Lugol), nebo specificky (MycoInk, Rylux – vážou se na chitin) Økultury 4. Mikroskopické metody A 56 fig001-of A. fumigatus (kultura) •C.parapsilosis –rýžový agar (kultura) Calcofluor, Rylux (fluorescenční) Myco Ink 4. Mikroskopické metody B) fixovaný preparát Øobecná barvení (Gram) Øspeciální barvení (imunofluorescence, Groccot, Gram-Weigert …) Kandidémie - Gram Punktát z jater - Gram •Výhody: •rychlost (minuty) •relativně nízká cena vyšetření •specificita, • riziko kontaminace není velké, ale může být pozitivní i v případech, kdy houba již není životaschopná (př.dermatomykóza) •Nevýhody: •malá senzitivita, pozitivní obvykle až pozdějších stádiích onemocnění •v materiálu lze většinou jen orientačně zařadit patogena do rodu nebo skupiny (septované x neseptované) 4. Mikroskopie – shrnutí 4. Kultivační metody •Kultivační média -pevná -tekutá •Kultivační teplota •37+/-1ºC, 30+/-1ºC, 25+/-1ºC kandida_miska •nejběžnější médium pro mykologii: •Sabouraudův agar s glukózou s antibiotiky •(pro zabránění růstu rychlejších bakterií) •další speciální média: •chromogenní agar (dourčení kvasinek) •rýžový agar (dourčení kvasinek) •RPMI 1640, MH s glukózou a metylenovou modří (testování citlivosti) •Czapek Dox (dourčení aspergilů) •atd. 4. Kultivační metody zařazení kultivátů do rodu a druhu •Kvasinky a jim podobné: • Ømakro a mikromorfologie • (vzhled kolonií, tvorba mycélií a pseudomycélií na rýžovém nebo bramborovém agaru, tvar buněk v mikroskopickém preparátu..) Ø Ø Øbiochemické vlastnosti • (utilizace a kvašení cukrů, event. dalších látek, komerční „chromagary“) • • Øsekvenace (PCR), proteomika (MALDI-TOF) • 4. Kultivační metody zařazení kultivátů do rodu a druhu •Vláknité houby (včetně dermatofyt): • Ømakro a mikromorfologie • (vzhled kolonií, tvorba pigmentu – Czapek Dox agar, tvar a větvení mycélií, velikost a tvar konídií ….) Ø Ø Øbiochemické vlastnosti • (takřka nepoužitelné – Christensenova urea T. mentagrophytes / T. rubrum) Ø Ø Ø Øsekvenace (PCR), proteomika (MALDI-TOF) ØStále není zcela prokázaný vztah mezi výsledky in vitro a in vivo • houby rostou pomaleji než bakterie (difuze ATM v agaru x růst mikroorganismu) • stavba buňky (eukaryota) a složení (chitin) • jiná reakce makroorganismu…. • ØExistují standardní metodiky – CLSI, EUCAST • (M27-A pro kvasinky, M37-A pro vláknité houby, M44-A, E7.1) • pracné, drahé a v rutinně nepoužívané • ØV rutinní praxi lze využít pomocné metodiky s různou shodou se standardními • ETEST, Sensititre, diskový difuzní test.. 4. Testování citlivosti hub k antimykotikům Princip: stanovení MIC (minimální inhibiční koncentrace) pomocí plastikového proužku s gradientem antimykotika 4. Příklad: metodika ETEST (vysoká shoda se standardem) •Výhody: • •umožní zařadit patogena do rodu i druhu (epidemiologie) •otestovat citlivost na antimykotika •specifická (z primárně sterilních materiálů) • •Nevýhody: • •málo senzitivní (ale víc než mikroskopie) •časově náročnější (dny až týdny) •riziko kontaminací (pomnožení) •u nesterilních materiálů obtížná interpretace – rozhodnutí o kolonizaci nebo infekci (moč, sputum etc.) 4. Kultivace – shrnutí Ø antigeny buněčné stěny hub (v našich podmínkách) Ø •invazivní aspergilóza galaktomannan •invazivní kandidóza mannan •invazivní kryptokokóza glukuronoxylomannan •invazivní mykóza glukan • 4. Sérologie (dg invazivních mykóz) Ø protilátky • •invazivní kandidóza antimannan • •Pro dg invazivních mykóz není stanovení protilátek obvykle přínosné (velká promořenost obyvatelstva) • •Výjimka – endemické mykózy (histoplazmóza, kokcidioidomykóza apod.) stěna aspergilus fumigatus 4. Sérologie (dg invazivních mykóz) pro prognózu pacienta s invazivní mykózou je zásadní časné zahájení léčby à velký důraz je kladen na časnou diagnostiku (tj. serologické a molekulárně-biologické metody) mortalita IA & čas zahájení léčby Von Eiff, Respiration, 1995 4. Používané metody Latexová aglutinace (kryptokokóza, histoplazmóza….) ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) (kandidóza, aspergilóza…..) G-test (limulus test) (panfungální – vše kromě kryptokoků a zygomycet) Komplement-fixační reakce, hemaglutinace, imunodifuze v gelu.. (protilátky mají význam u alergických stavů a endemických mykóz…. lat v přítomnosti antigenu vznik okem viditelného aglutinátu 4. Latexová aglutinace - princip DV00000 Rat monoclonal antibody EB-A2 + peroxidase 1 2 3 4 Rat monoclonal antibody EB-A2 Galactomannan Chromogen Mennink-Kersten et all, 2004 4. Sendvičová ELISA – princip 4. G-test - princip Limulus polyphemus (S.Amerika) Tachypleus tridentatus (JV Asie) •Výhody: •rychlé •senzitivní •specifické •možnost monitorovat léčebnou odpověď (v případě antigenů) •vysoká negativní prediktivní hodnota! • (tj. negativní výsledek s vysokou pravděpodobností znamená nepřítomnost choroby) • •Nevýhody: •falešné pozitivity •nejednoznačná interpretace (u protilátek) •cena (G-test) 4. Nekultivační (sérologické) metody shrnutí Øvelmi citlivá – může detekovat jen několik kopií genu v reakci a dokonce méně než jeden genom. • Ølze využít jak konzervované, tak variabilní úseky genomu a tak navrhnout assay panfungální nebo specifickou pro určité rody nebo druhy. Ø Økvantifikací lze odlišit kolonizaci od aktivní infekce. Ø Øpři použití multiplex PCR lze detekovat více druhů v jedné PCR reakci. Ø Øvýsledek je znám během několika málo hodin. 4. Molekulárně biologická diagnostika - výhody Falešné negativity z důvodu: Ømálo účinné metodě izolace DNA Øvelkému nadbytku humánní DNA ve vzorku (kompetice) 4. Molekulárně-biologická diagnostika - nevýhody Økontaminace • (při odběru, izolaci DNA, přípravě PCR reakce) Ønízké specificitě • (zkřížené reakce s jinými příbuznými druhy nebo dokonce lidskou DNA) Falešné pozitivity z důvodu: 4. Vyšetřovací metody v mykologii totální shrnutí J •Mikroskopie •(v minutách) • Sérologie (hodiny) PCR (24 - 72 hodin) Kultivace (dny až týdny) •- falešné pozitivity • •- nelze detekovat •zygomycety •- nestandardní •- falešné pozitivity •- falešné negativity •- málo senzitivní •- mnohdy nelze odebrat •vhodný materiál •- jednoduché •- rychlé •- specifické •- senzitivní • -časná diagnóza • -standardní •- monitorace •úspěchu/selhání léčby •- velmi senzitivní •- panfungální •- určení patogena •- určení patogena •(rod, druh) •- stanovení citlivosti Nevýhody Výhody •- málo senzitivní • -mnohdy nelze odebrat •vhodný materiál • -neurčí patogena •septované/neseptované 5. Nejčastější mykózy invazivní neinvazivní Kandidózy Aspergilózy Zygomykózy Fusariózy invazivní neinvazivní invazivní neinvazivní invazivní neinvazivní Kryptokokózy Pneumocystózy Povrchové mykózy invazivní neinvazivní invazivní neinvazivní 5. Epidemiologie invazivních mykotických infekcí nejčastější oportunní mykotická infekce je invazivní kandidóza, následována invazivní aspergilózou (Wisplinghoff 2004, Pfaller 2007) NICMÉNĚ zastoupení různých houbových rodů se liší u různých skupin pacientů!!! 1992-3, 1048 pacientů (Rees, 1998) 5. Epidemiologie invazivních mykotických infekcí Pacienti po transplantaci krvetvorných buněk (Noefytos 2009) 2004-7, 250 IFI Aspergillus 59% Candida 25% Zygomycety 7% ostatní 7% Pacienti po transplantaci solidních orgánů a krvetvorných buněk (Pfaller 2006) 5. Epidemiologie neinvazivních mykotických infekcí 1. mykózy kůže a nehtů nohou (dermatomykózy) jsou nejčastější mykotická onemocnění (vůbec) 2. vulvovaginální kandidózy (slizniční kvasinkové infekce) jsou druhé v pořadí a jejich problémem je častá „neústupnost“ 5. Kandidóza •Původci: •C. albicans •C.tropicalis, C.glabrata, C.parapsilosis, C.krusei a ostatní kandidy – ale i rod Trichosporon, Blastoschizomyces, Saccharomyces etc. •Infekce: •invazivní - sepse (fungémie) – často katétrová (tvorba biofilmu), diseminovaná kandidóza – postižení jakéhokoliv orgánu (srdce, játra, ledviny, mozek…) •neinvazivní - onychomykóza, kožní kandidóza (v místech vlhké zapářky), vaginální kandidóza… V malém množství patří kvasinky do běžné flóry kůže či GIT, z čehož plyne, že kandidózy jsou obvykle endogenního původu Kolonizace infekce 5. Vulvovaginální kandidóza Ødruhá nejčastější poševní infekce Ø75% žen prodělá za život alespoň jednu epizodu Øasi polovina z nich onemocní dvakrát •Predispoziční faktory: •těhotenství (zvýšená hladina glykogenu a hormonů..) •diabetes mellitus •léčba širokospektrými antibiotiky •chlorované bazény, těsné syntetické prádlo… • Léčba: lokální i celková, u rekurentních forem svízelná, uplatnění vakcín.. 5. Kandidóza mikrobiologická diagnostika kultivace, mikroskopie - stále základní diagnostické metody nutný vhodně odebraný a transportovaný materiál pozitivita z primárně sterilního materiálu (krev, likvor, biopsie) – prokazuje invazivní kandidózu při pozitivitě ostatních materiálů (kůže, sliznice, moč..) je nutno rozhodnout mezi kolonizací a infekcí (dle klinického stavu) sérologické markery při invazivní infekci (mannan, antimannan, glukan) jsou pouze pomocné (nejednoznačné výsledky studií) C.albicans C.krusei - sputum 5. Aspergilóza Původci: •Aspergillus fumigatus (90%) •Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Aspergillus tereus… Infekce: •invazivní - nejčastěji plicní (vdechnutí konidií), možnost diseminace hematogenně prakticky kamkoliv (ledviny, játra, mozek..) •neinvazivní – onychomykózy, otomykózy, alergická broncho-pulmolární aspergilóza.. Na rozdíl od kvasinek nejsou aspergily součástí běžné flóry člověka (kolonizace sliznic je rizikový faktor) a infekce jsou tedy exogenního původu (riziko přestaveb v blízkosti onkologických oddělení) 5. Aspergilóza mikrobiologická diagnostika Kultivace a mikroskopie - pro invazivní infekce nízká senzitivita i specificita A.fumigatus-diseminovaná IA-ledviny A.fumigatus A.fumigatus-Etest u nesterilních materiálů (kůže, nehty, ucho apod.) je riziko kontaminace (ubikvitní), u materiálů z dýchacích cest se často jedná o kolonizaci… mnohdy je nemožné získat primárně sterilní materiál, kultivační pozitivita z krve není běžná… Základem diagnostiky IA jsou sérologické markery !!! (galaktomannan, glukan) 5. Sérologie aspergilózy GALAKTOMANAN DEN 0 RTG S+P DEN +5 CT DEN +6 kultivace DEN +10,5 DEFINITIVNÍ DG. DEN +17 start th Ø možnost sledování léčebné odpovědi (úspěch x selhání) Ø pozitivní v brzkých stádiích invaze (včasné zahájení léčby = lepší prognóza) Maertens, CID, 2001 a 2002 5. Zygomykóza Původci: Rhizopus spp. (až 50%) Mucor spp., Absidia spp., Rhizomucor spp., Cunninghamella spp. Infekce: exogenní (stejně jako aspergilózy), lokalizace infekce dle základního onemocnění (rhinocerebrální, plicní, kožní, sinusitidy…) Analýza 929 případů – 1885-2004, 504 zemřelo (Roden, 2005) 5. Zygomykóza mikrobiologická diagnostika kultivace a mikroskopie – u invazivních infekcí nízká senzitivita i specificita Rhizopus sp. - sinusitida Rhizomucor sp. – popálená plocha zatím neexistuje žádná standardizovaná nekultivační metodika pro časnou diagnostiku (největší pokroky jsou v oblasti PCR) mnohdy je nemožné získat primárně sterilní materiál, kultivační pozitivita z krve není běžná… u nesterilních materiálů (kůže, nehty, ucho apod.) je riziko kontaminace (ubikvitní), u materiálů z dýchacích cest se často jedná o kolonizaci… 5. Fusarióza Původce: Fusarium solani (až 50%), F.oxysporum, F.verticillioides… Infekce: exogenní: kožní, keratitidy (čočky), pneumonie, sinusitidy -- u imunokompromitovaných až v 70% diseminace!! Mikrobiologická diagnostika: Kultivace a mikroskopie Ømožnost kontaminace (senzitivita, specificita) Økožní léze (histologie), Øu diseminovaných pozitivní hemokultura!! Nekultivační metody Ø1,3-β-D glukan ØPCR?! 10_1198105200 petris 5. Kryptokokóza (invazivní) Původce: C. neoformans (C. gatii??) Infekce: exogenní (rezervoár- holubí trus) primárně plicní, při diseminaci má afinitu k CNS (meningitidy), často první příznak rozvíjejícího se AIDS Mikrobiologická diagnostika: Kultivace a mikroskopie Øv mikroskopickém preparátu typické polysacharidové pouzdro Økultivace – běžné půdy Nekultivační metody: Ølatexová aglutinace (glukuronoxylomanan) cry1_l Mozek (tkaň) – pac s AIDS 5. Pneumocystová pneumonie Původce: P. jiroveci (na počest českého parazitologa prof.Jírovce) – původně parazit, přeřazeno k houbám na základě studia genomu Infekce: exogenní (ubikvitní), plicní, často první příznak rozvíjejícího se AIDS, komplikace u neutropenických pacientů Mikrobiologická diagnostika: Kultivace a mikroskopie: Øspeciální mikroskopická barvení Øimunofluorescence Øběžně se nekultivuje Nekultivační metody: Øglukan (krev, tekutina z BAL) ØPCR (tekutina z BAL) fig85_2 pcpcysta © E.Keiser 5. Povrchové (superficiální) mykózy ØDermatofytózy (tinea – dle lokalizace capitis, corporis, manus, pedis, unguium - onychomykóza…) ØKandidózy ØKeratomykózy (Pityriasis versicolor) Dle kliniky Dle původce ØTinea (Trychophyton spp., Epidermophyton floccosum, Microsporum spp., Scopulariopsis spp.) ØKandidóza (C.albicans, C.parapsilosis, T.asahii, C.albidus..) ØKeratomykóza (Malassezia furfur..) Mikrobiologická diagnostika ØKultivace (dle původce – obvykle Sabouraudův agar, 25-30ºC, až 1-5 týdnů) ØMikroskopie (preparát s MycoInk a KOH) trichophyton_rubrum T Trichophyton rubrum antropofilní, nejčastější T trichophyton_menta Trichophyton mentagrophytes zoofilní Scopulariopsis_brevicaulis S Scopulariopsis brevicaulis Scopulariopsis geofilní M Microsporum canis mcanis1 zoofilní Resolving kerion after treatment Tinea capitis Tinea_Pedis-36 Tinea pedis b4derm5_clip_image004 136_04 P.versicolor pp_009_thumb Tinea cruris Kandidóza Závěry – co byste měli vědět JJ Rozdíl bakterie x houby, jak se dělí Mikrobiologická diagnostika (mikroskopie, kultivace, sérologie, PCR) Nejpočetnější (kandidózy, aspergilózy, zygomykózy, dermatomykózy) V diagnostice je nutný komplexní přístup (rizikové faktory x klinický stav x mikrobiologie) Mykózy (invazivní x neinvazivní)