Úloha 6:  Stanovení aminokyselin pomocí papírové chromatografie (PC) 
 
 
Princip:  
Papírová chromatografie patří mezi separační metody, kdy k separaci aminokyselin dochází na                     
základě rozdílné afinity mezi stacionární fází (papírem) a mobilní fází (nejčastěji směs                       
rozpouštědel). Po separaci je pro každou aminokyselinu charakteristický retenční faktor Rf, což je                         
poměr mezi vzdáleností o startu, kterou urazila aminokyselina a vzdáleností čela rozpouštědla. 
 
Postup: 
Na chromatografický papír se vyznačí místo „start“ (2 cm od spodního okraje), kde se budou                             
nanášet jednotlivé aminokyseliny a vzorek. Postupně se nanese 6 aminokyselin a jeden neznámý                         
vzorek, který je tvořen směsí dvou aminokyselin. Aminokyseliny musí být od sebe dostatečně                         
vzdáleny, aby nedošlo k jejich smísení během vyvíjení v chromatografické komoře. Do                   
chromatografické komory se nalije mobilní fáze (směs acetonitrilu a 0,1 M octanu amonného 3:2),                           
tak aby výška hladiny byla cca 0,5 ­ 1 cm ode dna komory. Opatrně se vloží chromatografický papír                                   
a komora se uzavře víkem. Po 45­ti minutách nebo v okamžiku kdy mobilní fáze bude cca 2 cm od                                   
horního okraje chromatografického papíru, se vyvíjení ukončí a ihned se označí čelo mobilní fáze.                           
Chromatografický papír se vysuší fénem a následně postříká ethanolovým roztokem ninhydrinu. Po                       
opětovném vysušení se chromatogram vloží do sušárny vyhřáté na 110 °C po dobu 10 min. Po                               
uplynutí této doby jsou na chromatogramu viditelné skvrny aminokyselin. 
 
Vyhodnocení chromatogramu: 
U všech vzniklých skvrn aminokyselin a neznámého vzorku se označí středy skvrn. Změří se                           
vzdálenost mezi středem skvrny a startem (a) a vzdálenost mezi čelem mobilní fáze a startem (b).                               
Vypočítá se retenční faktor Rf podle vzorce níže a identifikují se obě aminokyseliny v neznámém                           
vzorku. 
 R f = b
a  
 
Laboratorní potřeby: 
mikropipety 10 a 50 µl 
chromatografický papír Whatman 3MM 
chromatografická komora 
tužka 
rozprašovač 
pravítko 
fén 
 
Chemikálie: 
ninhydrin 0,2% ethanolový roztok, acetonitril, octan amonný 0,1 M, glycin, cystein, kys. asparagová,                         
asparagin, tyrosin, leucin, izoleucin, alanin