Analytické stanovení enzymů
M.Beňovská
Množství enzymu v biologickém materiálu lze vyjádřit dvojím způsobem
Nepřímé stanovení
• katalytická koncentrace aktivity
• μkat/l
• stanoví se reakční rychlost (odpovídá koncentraci produktu enzymové reakce – stanovujeme
koncentraci produktu či substrátu)
• při 37 oC
• většina klinicky významných enzymů
Přímé stanovení
• hmotnostní koncentrace
• μg/l, ng/l
• stanoví se molekula enzymu jako antigen (imunochemicky – existuje-li specifická protilátka proti
stanovovanému enzymu)
• např. tumorové markery - NSE, CKMB, ALP kostní
Doporučené metody
Enzym Referenční metoda Certifikovaný referenční materiál
ALP IFCC metoda JC ERM 20327
AMS IFCC metoda ERM-AD456 (IRMM Geel); JC-ERM 2032
AST IFCC/IRMM metoda JC-ERM 20327
ALT IFCC/IRMM metoda ERM-AD454 (IRMM Geel); JC-ERM 20327
CK IFCC/IRMM metoda ERM-AD455 (IRMM Geel); JC-ERM 20327
GGT IFCC/IRMM metoda ERM-AD452 (IRMM Geel); JC-ERM 20327
LD IFCC metoda ERM-AD453 (IRMM Geel); JC-ERM 20327
LPS
CHS
PAMS IFCC metoda ERM-AD456 (IRMM Geel); JC-ERM 20327
IFCC - International Federation of Clinical Chemistry
Optický test
•Měříme změny absorbance v UV-oblasti
(při 340 nm) způsobené změnami koncentrace redukovaných forem koenzymů NADH + H+ nebo NADPH + H+
•Využívá se například při stanovení ALT a AST
Alaninaminotransferáza (ALT)
L-alanin:2-oxoglutarátaminotransferáza, EC 2.6.1.2.
V metabolismu katalyzuje transaminační reakci:
L-alanin + 2-oxoglutarát --> pyruvát + L-glutamát
ALT obsažena v cytoplasmě všech buněk, zvláště hepatocytů, buněk srdečního svalu, ledvin a
kosterních svalů
Klinický význam
• onemocnění jater (infekční virová hepatitida, mononukleóza, chronické jaterní choroby,…)
• onemocnění žlučových cest
• dekompenzované srdeční vady
ALT
•Referenční rozmezí:
• M 0,20 - 0,80 µkat/l
• Ž 0,20 - 0,60 µkat/l
•
•
•Interference:
•Výsledky ovlivňuje silná hemolýza - ALT 7x více v erytrocytech než v plasmě
•
Stanovení ALT – doporučená metoda
Materiál : sérum, plasma
Do reakční směsi se přidává pyridoxal-5-fosfát (PDP) jako koenzym (aktivuje Apo-ALT --> ALT*)
PDP obsažen v séru, ale patologicky ho může být nedostatek
L-alanin + 2-oxoglutarát <--> pyruvát + L-glutamát (ALT)
pyruvát + NADH + H+ <--> L-laktát + NAD+ (LD)
FOTOMETRICKY - pokles absorbance NADH při 340 nm
• předinkubace při +37oC - při ní dojde k odstranění pyruvátu ze vzorku
• start : 2-oxoglutarát ( 2 činidlová metoda)
Aspartátaminotransferáza (AST)
L-aspartát:2-oxoglutarátaminotransferáza, EC 2.6.1.1
V metabolismu katalyzuje transaminační reakci:
L-aspartát + 2-oxoglutarát <--> oxalacetát + L-glutamát
AST obsažena v cytoplasmě a v mitochondriích všech buněk - zvláště hepatocytů, buněk srdečního
svalu, ledvin a kosterních svalů
Klinický význam
• onemocnění myokardu (nekróza, IM)
• jaterní choroby
• onemocnění kosterního svalstva
AST
•Referenční rozmezí:
• M 0,17 - 0,85 µkat/l
• Ž 0,17 - 0,60 µkat/l
•
•
•Interference:
•Výsledky ovlivňuje hemolýza - aktivita AST 40x vyšší v erytrocytech než v séru
•
Stanovení AST – doporučená metoda
Materiál : sérum, plasma
Do reakční směsi se přidává pyridoxal-5-fosfát (PDP) jako koenzym (aktivuje Apo-AST --> AST*)
PDP obsažen v séru, ale patologicky ho může být nedostatek
L-aspartát + 2-oxoglutarát <--> oxalacetát + L-glutamát (AST)
oxalacetát + NADH + H+ <--> L-malát + NAD+ (MDH)
FOTOMETRICKY - pokles absorbance NADH při 340 nm
• předinkubace při +37oC - při ní dojde k odstranění pyruvátu ze vzorku
(Ve vzorku enzym laktátdehydrogenáza - dochází k reakci, při které je pyruvát odstraňován, ale
současně dochází k úbytku NADH - falešně vyšší rychlost úbytku NADH)
• start : 2-oxoglutarát ( 2 činidlová metoda)
Laktátdehydrogenáza (LD)
L-laktát: NAD+oxidoreduktasa, EC 1.1.1.27.
• Cytoplasmatický enzym - katalyzuje reakci anaerobní glykolýzy, je přítomen ve všech tkáních
pyruvát + NADH + H+ <--> laktát + NAD+
• Zvýšení jeho aktivity v krvi není orgánově specifické -
slouží spíše k vyloučení onemocnění
LD
Referenční rozmezí: < 4,2 µkat/l
S-LD1 30,3 - 37,3 %
S-LD2 37,7 - 43,9 %
S-LD3 16,0 - 23,6 %
S-LD4 0,9 - 3,1 %
S-LD5 2,2 - 4,6 %
Interference:
Výsledky značně ovlivňuje hemolýza - LD až 160x více v erytrocytech než v séru
Klinický význam:
• onemocnění srdečního svalu (infarkt myokardu, myokarditida)
• onemocnění svalů
• hemolytická a perniciozní anémie
• onemocnění jaterního parenchymu
• maligní choroby (tumory, leukémie)
Stanovení LD – doporučená metoda
Materiál : sérum, plasma, (punktát)
Substrát: L-laktát
L-laktát + NAD+ ↔ pyruvát + NADH + H+ (LD)
FOTOMETRICKY - nárůst absorbance NADH při 340 nm
Stanovení izoenzymů:
•Elektroforetické metody – vyjímečně
Alkalická fosfatáza (ALP)
orthofosfát: monoesterfosfohydroláza, alkalické optimum, EC 3.1.3.1.
ALP katalyzuje reakci:
monoester kyseliny o-fosforečné + H2O ↔ alkohol/fenol + fosforečnan (hydrolýza)
R-OPO(OH)2 + R´-OH ↔ R-OH + R´-OPO(OH)2 (přenos fosfátové skupiny na jiný alkohol
-transfosforylace)
U dospělých zdravých osob převažují jaterní izoenzymy, u zdravých dětí kostní izoenzym, u těhotných
žen placentární (až 50%), u osob s krevní skupinou 0 a B je dokazatelný i střevní izoenzym
ALP
•Referenční rozmezí:
•
• M (18-120r) 0,67 - 2,17 µkat/l Ž (18-120r) 0,58 - 1,75 µkat/l
• (1-18r) 1,35-7,50 µkat/l
•
•
•
•
•
•Klinický význam:
•• onemocnění jater
•• onemocnění žlučových cest
•• onemocnění kostí
•• fyziologicky zvýšené hodnoty: rostoucí děti a těhotné ženy (max. 3 trimestr těhotenství)
•• zánětlivé střevní choroby, karcinomy
•
•Nespecifický
•
•
•
Stanovení ALP – doporučená metoda
Materiál : sérum, plasma
ALP hydrolyticky štěpí 4-nitrofenylfosfát (substrát) v přítomnosti pufru AMP
(2-amino-2-methyl-1-propanol) na 4-nitrofenol a fosforečnan
4-nitrofenylfosfát + H2O ↔ 4-nitrofenol + fosforečnan (ALP)
FOTOMETRICKY: Zvýšení absorbance 4-NITROFENOLU při 410 nm
Pozn.: V ČR dříve unifikována metoda s pufrem MEG (N-methyl-D-glukamin) – vyvinuta v Lachema Brno
Stanovení izoenzymů ALP
Provádí se výjimečně
•Elektroforetické metody
•
•Imunoanalytické metody
- pro stanovení koncentrace kostního izoenzymu
- po reakci se specifickou protilátkou proti stanovovanému izoenzymu imunoanalyticky
(hmotnostní koncentrace)
GAMA GLUTAMYLTRANSFERÁZA (GGT)
gama-glutamyl-peptid:aminolyselina gama-glutamyltransferasa, EC 2.3.2.2.
•GGT katalyzuje přenos γ-glutamylového zbytku z γ -glutamylpeptidů na jiný akceptor (např. peptid
nebo aminokyselinu)
•GMT je vázána na cytoplasmatické membrány epitelu žlučových cest, ledvinných tubulů, jater,
pankreasu, střeva, erytrocytů,…)
•V krvi dokazatelný enzym je převážně jaterního původu
GGT
Referenční rozmezí: M 0,17 - 1,19 µkat/l
Ž 0,10 - 0,70 µkat/l
Klinický význam:
• onemocnění jater
• obstrukce žlučových cest
• sekundární nádory jater
• monitorování chronického alkoholismu (poškození jater alkoholem)
Stanovení GGT – doporučená metoda
Materiál : sérum, plasma
Substrát: L-gama-glutamyl-3-karboxy-4-nitroanilid (Glucane)
GGT přenáší gama-glutamylovou skupinu ze substrátu (Glucane) na glycylglycin (GlyGly), který
v metodě funguje i jako pufr
Glucane + Glygly ↔ 5-A-2NB + Glu-GlyGly (GGT)
FOTOMETRICKY: Zvýšení absorbance žlutého 5-amino-2-nitrobenzoátu (5-A-2NB)
α -amyláza (AMS)
alfa-1,4-D-glukan-4-glukanohydrolasa, EC 3.2.1.1.
AMS štěpí α -1,4 glykozidické vazby
Polysacharidy + H2O → Oligosacharidy → Maltóza
Štěpí glykozidické vazby uvnitř polysacharidového řetězce (endohydroláza)
AMS je sekreční enzym vytvářený pankreatem a slinnými žlázami, vzniká částečně i v játrech
Fyziologicky sérum obsahuje přibližně stejnou katalytickou koncentraci pankreatického a slinného
izoenzymu
AMS
Referenční rozmezí: S,P <1,67 µkat/l
U <7,67 µkat/l
Klinický význam
• onemocnění pankreatu (akutní pankreatitida)
• onemocnění slinných žláz ( parotitis)
• přítomnost makroamylasového komplexu
• onemocnění jater
• ledvinná nedostatečnost
Stanovení AMS – doporučená metoda
Materiál : sérum, plasma, moč (především jednorázová), punktát
substrát : EPS-G7-PNP
4,6-ethyliden(G7)-4-nitrofenyl(G1)- α -(1,4)-D-maltoheptaosid
EPS-G7-PNP + H2O ↔ 7 glukóza + 4-nitrofenol (AMS)
FOTOMETRICKY: Zvýšení absorbance 4-NITROFENOLU při 405 nm
Ethylidinová koncová skupina je vázána na koncovou molekulu glukózy(G7), která chrání substrát před
účinkem jiných enzymů typu glukozidáz, na opačném konci je navázán 4-nitrofenol. AMS v substrátu
hydrolyticky štěpí vnitřní vazby, vznikají jednotlivé fragmenty (oligosacharidy). Zbytek řetězce
rozštěpí α-glukozidáza a uvolní se-nitrofenol. V konečné fázi je může být substrát rozštěpen až na
glukózu.
Izoenzymy AMS
• SLINNÝ
• PANKREATICKÝ
MAKROAMYLÁZOVÝ komplex = komplexy glykosylovaných izoenzymů s imunoglobulíny a jinými bílkovinami v
séru (Mr = 400 000 až 2 000 000)
-Způsobuje zvýšení hodnot AMS v krevním séru bez patologických
příznaků
Metody stanovení
1.Selektivní INHIBICE isoenzymů monoklonálními protilátkami - takto stanovení pankreatické AMS -
referenční rozmezí: 0,22 – 0,88 µkat/l
2.ELEKTROFORÉZA (pankreatická + slinná)
Lipáza (LPS)
triacylglycertol-acylhydrolasa, EC 3.1.1.3.
LPS katalyzuje reakci
triacylglycerol + 3H2O → glycerol + 3 mastné kyseliny (LPS)
postupně
Výskyt: pankreatická lipáza, jaterní lipáza, lipoproteinová lipáza,…
LPS
Referenční rozmezí: 0,22 - 1,00 µkat/l (platí pro metodu Roche)
do 3,3 µkat/l (turbidimetrie)
Klinický význam:
• detekce a vyloučení akutní pankreatitidy
• chronická pankreatitida
• obstrukce pankreatického traktu
Stanovení LPS
Materiál: sérum, plasma, punktát
Referenční metoda: není k dispozici
Rutinní metody:
a) Fotometrie
substrát :
DGGR (1,2-o-DILAURYL-rac-GLYCERO-3-GLUTARIC ACID-(6´-METHYLRESORUFIN) ESTER - patent Roche
DGGR↔ glutarová kyselina + 6´-methylresorufin (LPS)
FOTOMETRICKY: Nárůst absorbance METHYLRESORUFINU při 580 nm
substrát : 1,2-DIGLYCERID
1,2-diglycerid + H2O ↔ glycerol + mastná kyselina (LPS)
glycerol + ATP → glycerol-3-fosfát + ADP (GK)
glycerol-3-fosfát + O2 → dihydroxyacetonfosfát + H2O2 (GPO)
H2O2 + 4-aminoantipyrin + fenol → chinonmonoiminové barvivo + H2O (peroxidáza)
FOTOMETRICKY: Nárůst absorbance barevného produktu
b) Turbidimetrické metody
Kreatinkináza (CK)
ATP-kreatin N-fosfotransferasa, EC 2.7.3.2.
Kreatinkináza katalyzuje defosforylaci kreatinfosfátu v přítomnosti komplexu ADP-Mg2+ (a opačně)
•Kreatinfosfát - důležitá rezerva energie ve svalu
•Tvorbou ATP dodává energii pro svalovou práci
Kreatinfosfát + ADP ↔ Kreatin + ATP (CK)
CK přítomna v cytoplazmě a mitochondriích buněk kosterního svalstva, srdce, mozku a hladké
svalovině, ne v erytrocytech
Izoenzymy:
v myokardu: 80% CK-MM a 20% CK-MB
v kosterním svalstvu: 98% CK-MM a 2% CK-MB(!)
CK
Referenční rozmezí: M <3,12 µkat/l
Ž <2,87 µkat/l
Interference: Při hemolýze ruší adenylkináza z erytrocytů
Klinický význam:
• onemocnění kosterního svalstva
• onemocnění srdečního svalu (infarkt myokardu – sledování dynamiky)
• onemocnění centrální nervové soustavy (CNS)
Stanovení CK – doporučená metoda
Materiál : sérum, plasma
Kreatinfosfát + ADP ↔ Kreatin + ATP (CK)
ATP + D-Glukóza ↔ ADP + D-Glukózo-6-fosfát (Hexokináza)
D-GLU-6-P + NADP+ ↔ D-Glukonát-6-P+NADPH+H+ (G6PD)
FOTOMETRICKY - nárůst absorbance NADPH při 340 nm
Po odběru krve - CK rychle inaktivována oxidací SH-skupin
Reaktivace při stanovení: N-ACETYL CYSTEIN ( NAC)
Izoenzymy CK
•CK se skládá ze 2 podjednotek (dimer; Mr=40 000): M ( muscle) a B (brain)
•Kombinací vznikají 3 izoenzymy: CK-MM, CK-MB, CK-BB
•
•Je možné detekovat i makroenzym: CK- makro
•
•Izoformy izoenzymů: vznikají odštěpením koncových lysinových molekul CK-MB1 (žádný lysin) a CK-MB2
(1 lysin) CK-MM1 (žádný lysin), CK-MM2 (1 lysin) a CK- MM3 (2 lysiny)
Stanovení izoenzymů CK
•
•IMUNOCHEMICKY - CK-MB mass (hmotnostní koncentrace)
•je kardiospecifická
•vyšší analytická citlivost stanovení
•
•
•
•IMUNOINHIBIČNĚ - aktivita CK-MB (neprovádí se)
•založeno na inhibici M-podjednotek protilátkou
•
Cholinesterázy (CHE)
•
•estery CHOLINU + H2O → CHOLIN + příslušná kyselina (CHE)
• hydrolýza
•
•• Acetylcholinesterázy
• acetylcholin + H2O → CHOLIN + CH3COOH (CHE)
•- obsaženy v erytrocytech, mozku, plících; štěpí acetylcholin (nervová zakončení)
•
•• Pseudocholinesterázy (butyrylcholinesterázy) pocházejí z ribosomů jaterních buněk → krev →
sérum, plazma - stanovuje se na biochemii
•
CHE
•
•Referenční rozmezí:
• (40-110r) 89-215 µkat/l
•
•Klinický význam:
•otravy organofosfáty a karbamáty (nekompetetivní inhibitory cholinestráz)
•poruchy proteosyntézy - těžké hepatopatie - hladovění organismu
•vrozené chybění, atypické varianty
•Patologické je především snížení aktivity
•
•
Stanovení CHE
•Materiál : sérum, plasma
•
•Chybí referenční metoda
•
•butyrylthiocholin + H2O → thiocholin + butyrát (CHE)
•thiocholin + DTNB → 5-merkapto-2-nitrobenzoová kyselina
• žluté zbarvení
•
•DTNB = kyselina 5,5´dithio-bis-nitrobenzoová
Enzymy -Tumorové markery
•NSE (neuronspecifická enoláza)
cytoplazmatický, glykolytický izoenzym enolázy - katalyzuje
přeměnu 2-fosfoglycerátu na fosfoenolpyruvát
malobuněčný karcinom plic
•TK (thymidinkináza)
enzym podílející se na syntéze DNA ukazatel buněčné proliferace
hematologické malignity
Interpretace biochemických nálezů
•Kámen žlučníku
•Chronická pankreatitida
•Virová hepatitida
•Alkoholismus
•Otrava houbami
•Makroamylazémie