Krevní buňky a principy jejich vyšetřování na hematologických analyzátorech a mikroskopicky Bourková L., OKH FN Brno Příklady webových stránek •hematologický atlas –http://www.hematocytologie.eu/ –http://www.hematologyatlas.com/ –http://www.grsmu.by/files/file/university/cafedry/klinicheskaya-immynologiya/files/fiu/atlas.pdf •RBC –https://www.google.cz/search?hl=cs&site=imghp&tbm=isch&source=hp&biw=1280&bih=908&q=erythroblasts& oq=erythrob&gs_l=img.1.3.0i19l10.6606.9583.0.12410.8.8.0.0.0.0.68.208.8.8.0....0...1ac.1.64.img..0. 8.201.NRIoSeIUgdk –http://www.sekk.cz/infoservis/2006_Morfologie_erytrocytu.pdf •WBC https://www.google.cz/search?hl=cs&site=imghp&tbm=isch&source=hp&biw=1280&bih=908&q=leukocytes&oq=l eukocy&gs_l=img.1.2.0l3j0i30l7.1937.12377.0.15795.7.6.0.1.1.0.244.565.5j0j1.6.0....0...1ac.1.64.img ..0.7.577.pvdZx9LlCHk •PLT https://www.google.cz/search?hl=cs&site=imghp&tbm=isch&source=hp&biw=1280&bih=908&q=platelets&oq=pl atelets&gs_l=img.1.0.0i19l10.1770.5225.0.7869.9.7.0.2.2.0.207.325.6j0j1.7.0....0...1ac.1.64.img..0. 9.349.CiouVP0aXo0 Vyšetřování krevních buněk v periferní krvi Ønesrážlivá periferní krev Øantikoagulační činidlo: K3EDTA nebo K2EDTA Øvyšetření: ühematologické analyzátory ümikroskop Ø – http://ruby.fgcu.edu/courses/hogedegb/80026/Hem01Lab1a_files/image032.gif myeloblast promyelocyt neutrofilní myelocyt eozinofilní myelocyt bazofilní myelocyt neutrofilní metamy eozinofilní metamy bazofilní metamy neutrofilní tyč eozinofilní tyč neutrofilní segment bazofilní segment proerytroblast středně zralý erytroblast (polychromní normoblast) pozdní erytroblast (ortochromní/oxyfilní normoblast) retikulocyt erytrocyt monoblast promonocyt monocyt magakaryoblast promegakaryocyt megakaryocyt trombocyty lymfoblast prolymfocyt lymfocyt bazofilní tyčí eozinofilní segment časný erytroblast (bazofilní normoblast) PERIFERNÍ KREV KOSTNÍ DŘEŇ plazmat. b. makrofág C:\Users\3840\Documents\Databáze-Dif-KO_10-13\AL1\A0070392BB_033.jpg promyelo3 C:\Users\3840\Documents\Cíl-Databáze-10-12\F4\A00717R6DB_057.jpg C:\Users\3840\Documents\Databáze-Dif-KO_10-13\MP4-baso\A0068645BB_012.jpg C:\Users\3840\Documents\Databáze-Dif-KO_10-13\F1\A0010172DA_052.jpg C:\Users\3840\Documents\Databáze-Dif-KO_10-13\F1\A0010172DA_014.jpg C:\Users\3840\Documents\Databáze-Dif-KO_10-13\F1\A0010172DA_025.jpg C:\Users\3840\Documents\Databáze-Dif-KO_10-13\F1\A0010172DA_047.jpg Leukocyty blast promyelocyt myelocyt meatamyelocyt neutrofilní segment eozinofilní segment bazofilní segment lymfocyt lymfocyt monocyt C:\Users\3840\Documents\Databáze-Dif-KO_10-13\F7\8403699442_021.jpg neutofilní tyč proerytroblast1 NRBC-baso,poly,oxy C:\Users\3840\Documents\Databáze-Dif-KO_10-13\F1\A0010172DA_001.jpg mgk-8 aniso 01 Erytrocyty Trombocyty proerytroblast bazofilní NRBC polychromní NRBC oxyfilní NRBC C:\Users\3840\Documents\Databáze-Dif-KO_10-13\F3\8403637449_050.jpg oxyfilní NRBC megakaryocyt Hematologické analyzátory https://www.sysmex.com/us/en/Company/News/PublishingImages/2013_summer_XN-3000_DI-60.jpg https://www.beckmancoulter.com/ucm/idc/groups/public/documents/webasset/glb_bci_052106.jpg http://www.interbiolab.com/wp-content/uploads/2014/07/CD-Sapphire-1.jpg Principy měření hematologických analyzátorů Øhydrodynamická fokusace Øprincipy měření: üimpedanční analýza üoptická analýza –kombinace různých principů analýzy Øspektrofotometrická analýza hemoglobinu •Principy měření umožňují vyšetření: Økvantitativní – počet buněk Økvalitativní – morfologie buněk ütvar buňky ütvar a velikost jádra üobsah cytoplazmy Hydrodynamická fokusace Øusměrnění buněk proudem nosné izotonické kapaliny (diluent) při průchodu měřícím kanálem „po jedné“ http://www.selectscience.net/images/hydrodynamic-focussing.jpg Impedanční analýza Øředění buněčné suspenze üdiluent - vodivý ükrevní buňka – nevodivá Øprůchod buněk mezi elektrodami (stejnosměrné elektrické pole) → impulz üpočet impulzů = počet buněk üvelikost impulzů = velikost buněk Ømožné doplnění vysokofrekvenční analýzou üna buňku superponováno vysokofrekvenční elektrické pole üanalýza vysokofrekvenčního napětí buňky = morfologie buňky • Ø http://eu.idexxbioresearch.com/images/research-analyzers/procyte-laminar-flow-impedance.png http://www.cyto.purdue.edu/cdroms/cyto2/6/coulter/si000277.gif http://www.cyto.purdue.edu/cdroms/cyto2/6/coulter/si000276.gif Optická analýza Øředění buněčné suspenze üdiluent – opticky inaktivní ükrevní buňka – opticky aktivní Øinterakce buněk s monochromatickým laserovým paprskem Øpo interakci buňky s paprskem se provádí analýza: üprošlého světla (0°) üodraženého světla üdepolarizovaného světla üfluorescence ocytochemické barvení buněk, doplňková analýza absorbce světla dle stupně probarvení cytoplazmy (u některých typů přístrojů) Øvyšetření: ükvantitativní a velikost buňky → detekce ve směru (0°) ükvalitativní/morfologie buňky → detekce odraženého a depolarizovaného světla, fluorescence, případně kombinace s cytochemickou analýzou Ø Ø http://flowcytometry.med.ualberta.ca/wp-content/uploads/2015/04/Flow-Cytometry-how-it-works-Diagram .jpg http://www.eclinpath.com/wp-content/uploads/rbc-analysis1.jpg http://www.eclinpath.com/hematology/tests/hemoglobin/rbc-analysis-2/ Spektrofotometrická analýza hemoglobinu Øhemolýza všech erytrocytů lyzačním (bezkyanidovým) roztokem Øuvolněný HGB je převeden na chromogenní formu s nejvyšší hodnotou absorbance při λ = 540 nm üHGB je převeden na chromogenní formu reagencií (např. imidazolem nebo sodium lauril sulfátem), která vytváří hemoglobinový komplex Øměření absorbance hemolyzovaného vzorku a blanku (lyzační roztok) üměření cca 8x (dle typu přístroje) Øz rozdílu absorbancí je vypočítána koncentrace HGB Ø http://www.healthcare.siemens.com/siemens_hwem-hwem_ssxa_websites-context-root/wcm/idc/groups/publi c/@global/@lab/documents/image/mdaw/mzk3/~edisp/cellavision_dm96_b-00299413/~renditions/cellavision _dm96_b-00299413~10.jpg http://jogjas.com/indogama/wp-content/uploads/olympus-cx21optilab-eshop.jpg http://ptanm.com/wp-content/uploads/2015/09/Mikroskop-Olympus-BX-51-Polarisasi.jpg Mikroskopovací zařízení Zhotovení nátěru krve Øroztírací sklíčko položit před kapku krve na podložním skle pod úhlem cca 30 - 40° (nikdy ne do kapky krve); po doteku krve a roztíracího skla se krev rozlije podél hrany skla; po té rychle krev rozetřít po podložním skle Øsílu nátěru zvažovat – čím větší úhel, tím silnější nátěr Ønátěr musí být: rovnoměrný, přiměřeně tenký, dlouhé okraje musí být rovné, na konci přechází „do ztracena“ Dif-1_nátěr Mikroskopování Ømikroskop üsuchý objektiv: mezi preparátem a objektivem je vzduch üimerzní objektiv: mezi preparátem a objektivem je imerzní olej oimerzní olej má podobný index lomu jako sklo – vznikne opticky homogenní prostředí, zvýší se index lomu prostředí mezi preparátem a objektivem imerzí může být: voda, parafinový olej, glycerol, cedrový olej, kanadský balzám (voda má vyšší index lomu než vzduch, ale nižší než imerzní olej) • • • • Ødigitální morfologie nové generace analyzátorů svým softwarovým vybavením digitálně zpracovávají a vyhodnocují krevní nátěry, hovoří se o virtuální mikroskopii (telehematologie), digitální analýza vytváří databázi digitálních fotografií krvinek, které lze i exportovat e-mailem nebo po internetu odborníkům ke konzultaci https://www.sysmex.com/us/en/Company/News/PublishingImages/2013_summer_CellavisionScreen.png Barvení nátěrů periferní krve a aspirátů kostní dřeně ØPanoptická barvící technika: üfixační roztok May-Grunwald – složení: eozin Y, metylenová modř, metylalkohol, glycerol übarvící roztok Giemsa-Romanowsky – složení: metylenová modř, azur-eozin, azur II, metylalkohol, glycerol, fosfátový pufr pH 6,8-7,0 ØZákladníprincipy barvení: üAniontové (kyselé) barvivo eosin Y se váže na kationtové části molekul proteinů a barví oranžovočerveně hemoglobin a eozinofilní granula üKationtové (zásadité) barvivo azur B, se váže na aniontové části molekul a barví modrošedě zbarvení nukleové kyseliny (DNA nebo RNA), nukleoproteiny, granula bazofilů a sekundární granula neutrofilů. • •Celkové obarvení nátěru je výsledkem řady různých kombinací těchto barevných reakcí, které nakonec dávají výsledný vzhled nabarveného preparátu. • •Poznámka: preparáty lze také připravovat na nátěrových a barvících automatech.