Fyziologie hemostázy P. Smejkal Hemostáza  je schopnost organismu zastavit krvácení  udržení tekutosti krve při neporušeném cévním řečišti  účastní se:  cévní stěna endotel  látky přítomné v krvi a na vnitřní straně cévy: trombocyty červené krvinky, leukocyty lipidy, bílkoviny, minerály atd.  porušená tkáň: tkáňový faktor ADP Poranění = poškození endotelu subendotel CÉVA TROMBOCYTY PLAZMAT.FF vasokonstrikce Primární hemostáza subendotel CÉVA TROMBOCYTY PLAZMAT.FF vasokonstrikce aktivace primární zátka Hemokoagulace subendotel CÉVA TROMBOCYTY PLAZMAT.FF vasokonstrikce aktivace aktivace koagulace primární zátka definitivní zátka + FIBRIN Hemokoagulace subendotel CÉVA TROMBOCYTY PLAZMAT.FF vasokonstrikce aktivace aktivace koagulace aktivace fibrinolýzy přiroz.inhibitory primární zátka definitivní zátka + FIBRIN Fibrinolytický systém subendotel CÉVA TROMBOCYTY PLAZMAT.FF vasokonstrikce aktivace aktivace koagulace aktivace fibrinolýzy přiroz.inhibitory primární zátka definitivní zátka + FIBRIN definitivní zátka Inhibitory koagulace a fibrinolýzy subendotel CÉVA TROMBOCYTY PLAZMAT.FF vasokonstrikce aktivace aktivace koagulace aktivace fibrinolýzy přiroz.inhibitory primární zátka definitivní zátka + FIBRIN definitivní zátka Hemostáza  primární vasokonstrikce ihned adheze trombocytů sekundy agregace trombocytů sekundy až minuty  sekundární (koagulace) aktivace koagul. faktorů sekundy až minuty tvorba fibrinu minuty  fibrinolýza aktivace minuty lýza krevní sraženiny hodiny Poranění = poškození endotelu subendotel CÉVA TROMBOCYTY PLAZMAT.FF vasokonstrikce aktivace primární zátka Vasokonstrikce: • způsobena střední vrstvou cévy: • hladká svalovina • elastická vlákna • především reflexní reakce • dočasná Endotel je aktivní jednovrstevná buněčná výstelka všech cév, kapilár a serózních dutin je místem kontaktu látek a buněk kolujících v krvi a látek navázaných na povrch endotelu tyto buď cirkulují v krvi a na endotel se váží nebo jsou endotelem syntetizovány je důležitým zprostředkovatelem a regulátorem látkové výměny mezi krví, lymfou a tkáněmi Endotel Cévní tonus  endotelové buňky kapilár uvolňují látky, které regulují prokrvení orgánů, způsobují převážně vasodilataci, např.:  metabolity kyseliny arachidonové, např. prostacyklin PGI2 - tromboxan A2  NO - endotelin  bradykinin (potencuje uvolnění NO) Endotel - hemostáza Význam pro hemostázu EB na jedné straně podporují srážení (VWF) na druhé straně produkují faktory aktivní ve fibrinolýze v klidovém fyziologickém stavu převažují látky působící proti krevnímu srážení V endotelu jsou syntetizovány  von Willebrandův faktor (VWF)  Platelet Derived Growth Factor (růstový faktor odvozený z destiček - PDGF)  destičky aktivující faktor (PAF)  prostaglandiny, prostacyklin  glykoproteiny, fibronektin, trombospodin  některé typy prokolagenu  Endothelium Derived Relaxing Factor (z endotelu odvozený faktor = NO)  endotelin-1 a další Endotel - vlastnosti Antitrombotické  vazodilatace  modulující zánět  potlačující růst  prostacyklin - PGI2  NO = EDRF  aktivátory plazminogenu  proteoglykany (heparan)  trombomodulin  protein C, S Prokoagulační  vazokonstrikce  endotelin  podporující zánět  podporující růst  tkáňový faktor  PAF  VWF  PAI Markery aktivace a poškození endotelu TF (tkáňový faktor)  exprimovaný na povrchu endotelu odráží stupeň jeho stimulace t-PA (tkáňový aktivátor plazminogenu, PAI-1 (plazminogen aktivátor inhibitor) trombomodulin VWF Uvolnění při poškození nebo aktivaci endotelu Poranění = poškození endotelu subendotel CÉVA TROMBOCYTY PLAZMAT.FF vasokonstrikce aktivace primární zátka Krevní destičky Funkce trombocytů při zástavě krvácení je dvojí:  tvorba primární krevní zátky,  tzv. prokoagulační  tj. poskytnutí povrchů = fosfolipidů pro průběh koagulačních dějů - PF3 (dest. faktor) vazba na vit. K závislých faktorů: FII, VII, IX, X vazba kofaktrů: FV, VIII vazba a aktivace: FXI, XII Účast destiček v hemostáze: adheze změna tvaru uvolňovací reakce agregace přesun negativně nabitých fosfolipidů na povrch retrakce Primární hemostáza Granula trombocytů -granula  DF4, TG (tromboglobulin)  neutralizace GAG (glykosaminoglykanů)  VWF – adheze, agregace  FV – prokoagulačně  PAI-1 – inhibice fibrinolýzy  PDGF – růst tkáně, hojení  trombospondin – agregace  fibrinogen – agregace  fibronectin – adheze  PS (protein S) – inhibice koagul. ff. denzní granula  ATP (adenosin trifosfát) ADP (adenisin difosfát) - agregace  Ca - agregace - vazba koagul. ff. - tvar-změna, retrakce  serotonin - vasokonstrikce  P-selektin – váže leukocyty Adheze  přilnutí krevních destiček na jakýkoliv povrch s výjimkou dalšího trombocytu  vedle trombocytů se na ni podílejí  struktury subendotelu: kolagen  plazmatické adhezivní proteiny: VWF, fibronectin  hemodynamické změny (smykové rychlosti, množství a viskozita krve, velikost a tvar cév).  adheze je přímo lineárně závislá na počtu trombocytů von Willebrandův faktor  je adhezivní protein  tvořen v endotelu a megakaryocytech  hraje klíčovou roli v primární hemostáze a koagulaci  zralý VWF představuje sérii multimerů od 500 kD až přes 10.000 kD, každý s komplexní strukturou  cirkulující VWF se váže s FVIII VWF - primární hemostáza Multimery o vysoké molekulové hmotnosti  adheze trombocytů k subendotelovým strukturám prostřednictvím GP (glykoprotein) Ib  agregace vazbou na aktivovaný GP IIb/IIIa SE GP Ib VWF trombo GP IIb/IIIa v trombo VWF VWF - funkce v koagulaci Multimery všech molekul. hmotností  váže a stabilizuje FVIII (ochrana před proteolytickou degradací)  lokalizuje FVIII v místě poruchy cévní stěny Adheze (ale i trombin) navodí s aktivací receptorů komplexní aktivaci trombocytů  ztráta diskoidního tvaru, tvorba pseudopodií (vývěžků)  centralizace granulí a přeměna cytoskeletonu  uvolnění působků z granulí (sekreční fáze): ADP, PDGF, PF4, TG, fibrinogen a další  metabolizmem kyseliny arachidonové vzniká TXA2 (tromboxanA2)  výrazný stimulátor agregace trombocytů  aktivace receptorů GP IIb/IIIa  přesun negativně nabitých fosfolipidů na povrch  umožňují vazbu koagulačních faktorů v místě krvácení Agregace  je vzájemné spojení destiček mezi sebou  probíhá s pomocí specifického komplexu závislém na Ca2+, GP IIb/IIIa a fibrinogenu  fibrinogen slouží jako můstek mezi destičkami; nereaguje s klidovými destičkami  za vysokých smykových rychlostí je adheze a agregace trombocytů zprostředkována vazbou VWF na GPIIb/IIIa a to i v nepřítomnosti fibrinogenu  primární agregace  ADP z porušených buněk a tkání - reverzibilní  sekundární agregace  ADP a TXA2 z trombocytů – ireverzibilní  vznik bílého destičkového trombu Retrakce  = smrštění vytvořené krevní zátky  jedná se o destičkovou funkci, která je analogní kontrakci svalů  slouží k podpoře uzavření rány  pro retrakci jsou destičky nezbytné  pseudopódia destiček přilnou k fibrinovým vláknům a retrakce kontraktilních bílkovin destiček (tj. „zatažení“ pseudopódií) vyvolá retrakci sraženiny Hemokoagulace subendotel CÉVA TROMBOCYTY PLAZMAT.FF vasokonstrikce aktivace aktivace koagulace primární zátka definitivní zátka + FIBRIN Plazmatický koagulační systém Proenzymy  serinové proteázy: FII, VII, IX, X, XI, XII, PK (prekalikrein) PLG (plazminogen), tPA, uPA(urokinázový aktivátor plazminogenu), PC (protein C)  transglutaminázy: FXIII Kofaktory:  plazmatické: FV, VIII, HMWK (high molecular weight kininogen) PS (protein S)  buněčné: TF TM (trombomodulin), EPCR (endotelový receptor PC) Substrát: fibrinogen Regulační proteiny: AT III (antitrombin), HC II (heparin kofaktor), C1inhibitor, 2AP (antiplazmin), PAI-1,2,3 PC, TFPI (tissue factor pathway inhibitor), 2MG (makroglobulin) Fosfolipidy (negativně nabité): fosfatidylserin, fosfatidyletanolamin Ca2+ Původní schéma koagulačních dějů Koagulační faktory vitamín K dependentní • FII, FVII, FIX, FX, PC, PS • karboxylaxe glutamové kyseliny • nutná k vazbě na fosfolipidy přes Ca můstky • koagulační faktory jsou tvořeny, ale nejsou koagulačně aktivní - PIVKA formy (Protein Induced by Vitamin K Absence / Antagonist) Současný model koagulace TF X Xa Va II IIa fibroblast VIII/vWF VIIIa V Va platelet activated platelet VIIa VIIa IX IXa VaIXa X Xa II IIaIIa TF Monroe et al. (1994) Br J Haematol 88, 364-371, Hoffman et al. (1995) Blood 86, 1794-1801 VIIIa V XI XIa  transmembránový glykoprotein v subendotelu na fibroblastech a svalových buňkách fyziologicky na všech buňkách mimo cévní řečiště za patologických stavů i na monocytech a endotelu  tkáňový faktor není za normálních okolností vystaven působení cirkulující krve  hemostázu zahajuje tvorba komplexu mezi TF a FVIIa  tvorba komplexů TF-FVIIa na povrchu buněk nesoucích TF vede k aktivaci FIX a FX Hemostáza a tkáňový faktor (TF) Roberts H, et al. Williams Haematology 2001 Zahájení (iniciace) koagulace Fibroblast Trombocyt TF TF X Xa Va Protrombin VIIa VIIa Trombin TF TF Fibroblast Trombocyt Zahájení (iniciace) koagulace V X Xa Va Protrombin Aktivovaný trombocyt VIIa VIIa Trombin TF TF VIII/vWF VIIIa V Va XI XIa Trombocyt Fibroblast Fáze aplifikace koagulace (priming= narůstání) XIa VIIIa Va V X Xa Va Protrombin VIIa VIIa IX IXa VIIIa Va IXa X Xa Protrombin Trombin Trombin Fibrinogen Fibrin TF TF XIa Fibroblast Trombocyt Aktivovaný trombocyt Propagace (šíření, rozmnožení) koagulace Va VIIIa XIa IX V VIII XI V Propagace koagulace klíčové enzymatické komplexy Tenáza (vnitřní)  FIXa  FVIIIa  fosfolipidy  Ca Protrombináza FXa FVa fosfolipidy Ca  Vytvoření iniciálního malého množství trombinu se následně podílí na aktivaci dějů, které zvyšují tvorbu trombinu více než 1000-násobně Aktivuje koagulační faktory V, VIII, XI  Pomáhá aktivovat trombocyty v místě poranění, které následně poskytují negativně nabitý fosfolipidový povrch nutný pro další aktivaci koagulačních faktorů Zahájení tvorby trombinu Množství trombinu je rozhodující pro: Tvorbu dostatečné a pevné fibrinové zátky Aktivaci FXIII, vedoucí ke stabilizaci fibrinové sítě Aktivaci TAFI (trombin activated fibrinolysis inhibitor), zajištující rezistenci fibrinové zátky k fibrinolýze TROMBIN Trombocyty FVIII a FV FXIII (plně stabilizovaná fibrinová zátka) FXI TAFI Trombomodulin a protein C (zpětnovazebné zesílení) (trombinem aktivovaný inhibitor fybrinolýzy) (PAR receptory) Protease-activated Receptors  Receptory spojené s G-proteinem  Jsou schopné přeměnit extracelulární probíhající proteolytické štěpení v transmembránový signál  Prototypem skupiny je PAR1  Je aktivován, když trombin odštěpí jeho N-konec  Při této aktivaci se objeví nové N-zakončení, které slouží jako liganda – váže se intracelulárně na „tělo“ receptoru a slouží jako transmembránový signál PAR trombin PAR1 PAR1* D doménaD doména Původní schéma koagulačních dějů Poranění = poškození endotelu subendotel CÉVA TROMBOCYTY PLAZMAT.FF vasokonstrikce aktivace aktivace koagulace aktivace fibrinolýzy přiroz.inhibitory primární zátka definitivní zátka + FIBRIN Poranění = poškození endotelu subendotel CÉVA TROMBOCYTY PLAZMAT.FF vasokonstrikce aktivace aktivace koagulace aktivace fibrinolýzy přiroz.inhibitory primární zátka definitivní zátka + FIBRIN definitivní zátka Fibrinolýza patří k základním fyziologickým mechanizmům má dvě funkce v procesu hemostázy  odstraňuje fibrinová koagula po té, co naplnily svou funkci  limituje tvorbu koagula hraje dále roli v procesech zánětu, metastazování nádorů, ateroskleróze, odlučování placenty a embryogenezi Fibrinolýza Vnitřní cesta (krevní) Zevní cesta (tkáňová aktivace) kalikrein, (FXIIa, FXIa) tPA, uPA C1INH, ATIII PAI-1, PAI-2 Plazminogen PLAZMIN Plazminogen 2-antiplazmin fibrinogen fibrin Aktivace fibrinolýzy silné aktivátory tkáňový aktivátor plazminogenu - tPA urokinázový aktivátor plazminogenu - uPA slabé aktivátory kalikrein fXIIa, f XIa Plazminogen Plazmin Aktivace fibrinolýzy - přeměna plazminogenu na plazmin  Fibrinolýza - po formaci fibrinu dojde k navázání jak plazminogenu tak t-PA na jeho povrch  Následkem této vazby je tvorba komplexu, který výrazně urychluje formaci plazminu  Na fibrin navázaný plg je výrazně lepším substrátem pro t-PA než volný plg  Navíc – navázaný plazmin je chráněn před inaktivací 2AP Formy plazminogenu, plazminu aktivátor plg Lyz - plazminogen (mol.hmot.82 000) Glu - plazmin Glu aktivátor plg lyz - plazmin vazebné místo pro lyzin - S - S - disulfidové můstky Glu - plazminogen (mol.hmot. 90 000) Glu S -- S S -- S S S S S Fibrinolýza Vnitřní cesta (krevní) Zevní cesta (tkáňová aktivace) kalikrein, (FXIIa, FXIa) tPA, uPA C1INH, ATIII PAI-1, PAI-2 Plazminogen PLAZMIN Plazminogen 2-antiplazmin fibrinogen fibrin FV, VIII Štěpení fibrinogenu plazminem A-řetězec D-doména E-doména D-doména plazmin Fragment X A-řetězec, B 1-42 Fragment Y + + Fragment D Fragment D + Fragment E Štěpení fibrinu plazminem DD 195kDa DY 247kDa YY 285kDa XD 334kDa..... D D D D D D D D D E E E E Vznikají fibrin degradační produkty, obsahující zkříženou vazbu Inhibitory fibrinolýzy inhibitory plazminu:  alfa2-antiplazmin  TAFI - Trombin Activated Fibrinolysis Inhibitor inhibitory aktivátorů plazminu:  PAI-1 (endotel)  PAI-2 (placenta)  PAI-3 (úloha v patofyziologii fibrinolýzy je nejasná) Nespecifické inhibitory fibrinolýzy přirozené inhibitory serinových proteáz:  svůj inhibiční vliv uplatňují zejména proti plazminu  patří sem: 2-makroglobulin 1-antitrypsin C1- esterase inhibitor ATIII  jde za fyziologických stavů o slabé inhibitory Jiné mechanismy inhibice fibrinolýzy: HRGP (histidin rich glycoprotein):  Inhibice vazby plazminogenu na fibrin obsazením lyzinových zbytků fibrinu Trombospondin:  Vazbou na plazminogen působí jako inhibitor aktivace plazminogenu tPA Lipoprotein (a):  Vazbou na endotel snižuje koncentraci plazminogenu na endotelu TAFI Thrombin-Activated Fibrinolysis Inhibitor  glykoprotein syntetizovaný v játrech  pravděpodobně koluje v plazmě v komplexu s plazminogenem  odštěpuje z fibrinu lyzinové zbytky  odstraní tak vazebná místa pro plazminogen a t-PA  tím snižuje vznik plazminu  inhibuje aktivaci glu-plg (glu-plazminogen) a jeho konverzi na lyz-plg  uvolňuje PAI-1 z trombocytů Aktivace TAFI  Pouze trombinem – neefektivní – potřebná velká množství IIa  V přítomnosti trombomodulinu probíhá reakce 1250x rychleji  Aktivace plazminem pomalejší  Vyžaduje přítomnost glykoasaminoglykanů endotelu  Úloha plazminu v aktivaci TAFI zatím není jasná  Fyziologicky IIa předchází plazmin a je účinnější TAFI a trombomodulin  Při nízké koncentraci TM je stimulována aktivace TAFI na TAFIa (antifibrinolytické působení TM)  Při vysoké koncentraci TM je aktivace potlačována (zvyšována aktivace PC – profibrinolytické působení TM)  Navíc je zřejmě důležitá i velikost cév – koncentrace TM na endotelu stoupá směrem ke kapilárám Dvojí úloha trombomodulinu FBG Fibrin FDP IIa-TM II IIa Plg APC PC TAFIa TAFI Pln _ + + _ Fibrinolýza a koagulace  Aktivace TAFI trombinem indikuje důležitost koagulačního systému v regulaci fibrinolýzy  Veškeré poruchy generace trombinu mají za následek i zvýšenou rychlost fibrinolýzy  Toto bylo jako první potvrzeno pro defekty FXI – krvácení z tkání s bohatou lokální fibrinolýzou  Naopak – zvýšená aktivita TAFI je trombofilní stav  buď v důsledku zvýšené aktivity koagulačních faktorů  nebo samotného TAFI  serpiny (inhibitory proteáz): Inhibovaná proteáza: Antitrombin (IIa, Xa)  HC II (IIa, Xa)  -1-antitrypsinm (Xa, aPC)  C-1inhibitor (kalikrein, plazmin) systém proteinu C: (FVa, FVIIIa)  protein C, S  C4bBP (binding protein)  TM  inhibitor akt.proteinu C  EPCR (endotelový receptor PC) TFPI (inhibitor zevní koagulační cesty) (TF/FVIIa/FXa)  nespecifické inhibitory:  alfa2 MG (IIa, kalikrein, plazmin) Přirozené inhibitory koagulace Monocyt TF TF VIIa IXa VIIIa IX VIIa Xa Va X V IIa II II Xa Va Aktivovaný trombocyt Fibrin Fibrinogen ATTFPI APC trombo Plazminogen Plazmin 2AP tPA, uPAPAI TAFI Antitrombin Přirozeně se vyskytující inhibitor proteáz Další serpiny: heparin kofaktor II, 2-antiplazmin, PAI-1, PAI-2, protein C inhibitor, 1-proteinase inhibitor (antitrypsin), 1-antichymotrypsin, C1inhibitor Serpiny tvoří s cílovými proteinázami ireversibilní 1:1 komplex Antitrombin Je hlavní fyziologický inhibitor trombinu (IIa) a faktoru Xa  inhibuje i IXa, XIa, XIIa a fragmenty, kalikrein, plazmin, TF-FVIIa přítomnost heparinu a heparinu podobných látek (glykosaminoglykanů - GAG) urychluje tuto reakci 1000 – 2 000x - vazba na AT je reverzibilní GAG mají úlohu kofaktoru v této reakci Antitrombin Rozdíl mechanismu reakce AT III s UFH a LMWH Antitrombin Protizánětlivé působení - schopnost AT stimulovat tvorbu prostacyklinu v buňkách endotelu  prostacyklin působí vazodilataci inhibičně na destičky inhibičně na aktivaci mononukleárů indukci rezistence na endotoxin Heparin inhibuje tuto funkci AT Systém proteinu C Systém proteinu C XIIa FVIIa-TF XIa FVIIIi FIX FVIIIa FVIII FX FXa FIXa FVi FVa FV FII FIIa fibrinogen FIBRIN Ca2+ TM PC APC PS Protein C  K-dependentní glykoprotein, serin. proteáza  syntetizován v játrech aktivován na endotelu komplexem IIa/TM  EPCR - receptor endotel. buněk pro PC  podporuje aktivaci PC na endotelu za přítomnosti kofaktoru proteinu S:  štěpí FVa, FVIIIa Protein S K-dependentní protein syntetizován v játrech, cévním endotelu, megakaryocytech a d. uložen v alfa-granulích trombocytů kofaktor APC (aktivovaný PC) při enzymatickém štěpení kofaktorů Va a VIIIa nezávisle na APC přímo inhibuje faktory Va a Xa Protein S v plazmě je asi 60% nekovalentně vázáno (komplex 1:1) na C4BP:  regulační protein cesty komplementu vazba je reverzibilní vázaný PS již nemá funkci kofaktoru Trombomodulin transmembránový protein trombin vázaný na TM ztrácí koagulační aktivitu v komplexu s trombinem aktivuje PC v komplexu s trombinem aktivuje TAFI (thrombin activatable fibrinolysis inhibitor) urychluje inhibici trombinu antitrombinem TFPI - inhibitor zevní koagulační cesty V iniciační fázi koagulace inhibuje: - uvolněný FXa - komplex TF/FVIIa - až po vazbě na FXa Je tvořen: - v endotelu Je uvolňován: - heparinem - současně s TF Monocyt TF TF VIIa IXa VIIIa IX VIIa Xa Va X V IIa II II Xa Va Aktivovaný trombocyt Fibrin Fibrinogen ATTFPI APC trombo Plazminogen Plazmin 2AP tPA, uPAPAI TAFI Poranění = poškození endotelu subendotel CÉVA TROMBOCYTY PLAZMAT.FF vasokonstrikce aktivace aktivace koagulace aktivace fibrinolýzy přiroz.inhibitory primární zátka definitivní zátka + FIBRIN definitivní zátka