Přednášky koagulace - principy testů 7.4.2016-3 hod principy vyšetření hemostázy, preanalýza kalibrace a kontroly v koagulační laboratoři základní koagulační testy * 21.4.2016-2 hod rutinní koagulační testy, interpretace výsledků speciální koagulační testy I 28.4.2016-1 hod speciální koagulační testy II Praktika - koagulace 2016 21.4.2016-2 hod Skupina 1 • Kalibrace a praktické provedení základních koagulačních vyšetření - Protokol č.1 Skupina 2 • Interpretace výsledků rutinních koagulačních testů - Protokol č.2 • Monitorování antitrombotické léčby - Protokol č.4 28.4.2016 - 2 hod Skupina 1 • Vyšetření agregace trombocytů - Protokol č.3 Skupina 2 • Kalibrace a praktické provedení základních koagulačních vyšetření - Protokol č.1 -»5.5.2016 -2 hod Skupina 1 • Interpretace výsledků rutinních koagulačních testů - Protokol č.2 • Monitorování antitrombotické léčby - Protokol č.4 Skupina 2 • Vyšetření agregace trombocytů - Protokol č.3 Zápočet - koagulace Podmínky zápočtu ^ účast praktika odevzdání protokolů 1,2,3,4 Praktická zkouška koagulace Kalibrace rutinních a speciálních koagulačních vyšetření - kalibrační křivka, odečet Interpretace výsledků koagulačních testů PT, APTT, Fbg, TČ, AT, D-Di Zkušební otázka z laboratorní hematologie Principy vyšetření hemostázy, preanalýza Jiřina Zavřelové Dělení testů dle principu ■^Koagulační Fotometrické Imunochemické Turbidimetrické (jiné než koagulační, imunochemické) Sledování času rozpuštění koagula Sledování rozpustnosti koagula Jiné Dělení testů dle principu -^Koagulační sledování času srážení (srážlivá plná krev) • bez přídavku aktivátoru/aktivovaná doba srážení (ACT) • manuálně (kývání) • POCT (přenosné přístroje point-of-care) ^ sledování času vytvoření fibrinového vlákna • manuálně (háčkování) • koagulometr (poloautomat, automat) • mechanické • kuličkové (sledování změn pohybu kuličky) • optické • nefelometrie (sledování rozptylu světla) • turbidimetrie (sledování průchodnosti světla) Doba srážení- manuální metoda POCT -ACT (HEMOCHRON) Odkápnutí krve do testovací jamky jednorázové kyvety s reagencií (aktivátor) a vložení do pokusné komory Pohyb vzorku po smíchání vzorku s reagencií v pokusném kanálku předurčenou rychlostí Začátek tvorby koagula je detegován na základě zpomalení toku vzorku v pokusném kanálku mezi optickými detektory LED zobrazovací panel klávesnice pokusná komora Koagulometry Stago - princip Měření odchylky oscilační amplitudy kuličky Při stálé vizkozitě - stálé kyvadlové houpání kuličky díky dvěma zahnutým kolejničkám na dně kyvet a elektromagnetickému poli vytvářenému na obou stranách (cívky) Zmenšení amplitudy - nárůst vizkozity - jev koagulace. Na základě změny amplitudy se stanovuje koagulační čas. Koagulometry Benk - princip Sledování změny frekvence (f) průchodu rotující kuličky v kyvetě pomocí optického senzoru Optické koagulometry Detekce koagulačního času Procentuální detekce ^1 Derivace křivky ^1 Vyhodnocení počáteční rychlosti Procentuální detekce Intenzita rozptýleného světla po přidání reagencie před začátkem procesu koagulace je definována jako 0% Intenzita rozptýleného světla po ukončení procesu koagulace s maximálním zákalem jako 100% Koagulační čas pak odpovídá procentuálně definované intenzitě rozptýleného světla z koagulační křivky (např. 50 %) Intenzita rozptýleného světla 100% I 50% Změna v intenzitě rozptýleného světla 0% I Rozdíl a derivace 4 50% Počáteční rychlost Dělení testů dle principu Fotometrické sledování změn zbarvení v důsledku štěpení specifického chromogenního substrátu - detekce absorbance (A) • end point" (A) • kinetické (AA/min) limitace -hemolytické a ikterické vzorky ^Turbidimetrické (jiné než koagulační, imunochemické) sledování změn zakalení • detekce změn transmise (propustnosti T) • detekce změn absorbance limitace- chylózní vzorky Chromogeny Chromogenní substrát ^ uměle připravený velkoobjemová aminokyselinové bezbarvý koncovka raménko zakončené paranitroanilid Argininem Chromogeny Princip ^ enzymy štěpí substrát ^ měříme při 405 nm - vzniká žluté zbarvení pŕJľŕj/jj'íľDíJfjjJjrj Dělení testů dle principu Imunochemické ^ sledování reakce antigénu s protilátkou • aglutinace • LIA • EL1SA • EID Aglutinačni metody sledování aglutinace viditelných částic s navázanou protilátkou proti vyšetřovanému antigénu odečítání makroskopicky pozitivní( +, ++, +++)/negativní ^ semikvantitativní metody (udaná mez detekce) metody latexaglutinační (např. FDP, D-Di) hemaglutinační (např. FM) Příklad vyšetření D-Dimerů Mez detekce = 0,5 mg/l neředěný vzorek vzorek ředěný 1:6 výsledek aglutinace < 0,5 mg/l aglutinace + > 0,5 mg/l a < 3,0 mg/l aglutinace + + > 3,0 mg/l Liquid immunoassay - LIA metody Sledování aglutinace mikrolatexových částic s navázanou protilátkou proti vyšetřovanému antigénu Odečítání optickým systémem koagulometru ^ Změna zakalení (AA/min) Kvantitativní metody (např. D-Di, vWF:Ag...) ^ kalibrační křivka - polynom 3.řádu (vícebodová) Limitace Chylozita vzorku ^1 Hookův jev (vysycení protilátky antigenem) ELISA metody -^Stanovení antigenu(Ag)pomocí protilátky (Ab) značené enzymem (AbE) - kvantitativní inkubace vzorku v mikrotitračních jamkách s navázanou Ab proti vyš. Ag - vazba Ag na Ab odsátí vzorku + promytí ^ inkubace AbE v jamkách - vazba na Ag ^ odsátí AbE a promytí detekce enzymatické aktivity komplexu Ab-Ag -AbE po přídavku chromogenního substrátu (A) • přímá úměra: enzym, aktivita x množství Ag Elektroimunodifúze - El D metody vyšetřovaný antigén reaguje s protilátkou přítomnou v agarózovém gelu při elektroforéze za vzniku precipitačního píku ■Adélka píku je přímo úměrná koncentraci antigénu kvantitativní metoda Princip EID 1 I A A O O DO D D O D C i 1 kalibrace vzorky pacientů Vyšetření plazmatických proteinů Vyšetření funkční aktivity ^ koagulační metody ^ fotometrické metody Vyšetření antigénu imunochemické metody ^ umožňují odlišení defektů • kvalitativních • kvantitativních Správnost laboratorních výsledků Faktory objektivní subjektivní Faktory preanalytické analytické postanalytické Preanalytické faktory Příprava pacienta Odběr vzorku Transport vzorku Zpracování vzorku Skladování vzorku Příprava pacienta Odběr na lačno nebo po lehké snídani bez tuků Dostatečný příjem tekutin Uvedení času odběru Uvedení léčby Uvedení komplikace při odběru Odběr vzorku Minimální zatažení paže Do plastikových nebo silikonovaných skleněných zkumavek První 2-3 ml nelze použít ■^Antikoagulační roztok pro nesrážlivou krev-citrát sodný v ředění 1:10 Šetrné promíchání krve s citrátem (5-1 Ox) Antikoagulancia Citrát sodný 0,109 mol/l (3,2 %) doporučeno 1,129 mol/l (3,8%) ■*CTAD zkumavky ^ brání aktivaci trombocytů doporučeno pro testy PAI-1, heparin, PF4... Správný odběr vzorku Vyřadit vzorky Sražené ->S chybným objemem krve (rozdíl 10%) méně krve • prodloužení koagulačních časů • APTT citlivé od 90 % objemu • PT citlivé od 80 % objemu ^ více krve • zkrácení koagulačních časů?? Správný odběr vzorku -^Hemolytické, ikterické a chylózní hemolytický a ikterický vzorek • ovlivňuje výrazně fotometrická stanovení • při výrazné hemolýze i koagulační stanovení • aktivace krevního srážení uvolněním TF chylózní vzorek • ovlivňuje výrazně koagulační stanovení na optických koagulometrech • a imunochemická stanovení vyhodnocovaná opticky Správný odběr vzorku Hematokrit < 30 % nebo >60 % upravit objem citrátu 100 - hematokrit ml citrátu = ------------------x ml plné krve 595 - hematokrit Transport vzorku -*Čas (max 2 hod) Teplota (18-25°C) Mechanické vlivy (potrubní pošta) Zpracování vzorku Odstranění krevních buněk centrifugací Stažení plazmy Většina testů do 1 - 4 hod po odběru * Výjimka EGT, EF (15-30 min), heparin, PAI-1, LA, vyšetření funkcí trombocytů Vyšetřovaný materiál Plazma ^ plazma bohatá na trombocyty • centrifugace 10 minut 150 - 250 g, sedimentace plazma chudá na trombocyty • centrifugace 15 minut 2500 g ^ bezdestičková plazma • dvojnásobná centrifugace (filtrace ne) ->Plná krev Sérum Centrifugace Výpočet otáček pro danou centrifugu *g = 1,118 x 10"5 x r x N2 r = poloměr otáčení v cm, N = otáčky/min Příklad: r = 15 cm, 2500g 3860 otáček/min Skladování primárních vzorků * Laboratorní teplota 18 - 25 °C PT 6 hodin APTT 4 hodiny ^ APTT (léčba heparinem) 1 hodinu ^ Ostatní vyšetření: 4 hod Vyšší teplota ne Uložení v lednici (aktivace FF VII a XII) ne Zamrazování vzorků Plazma chudá na destičky/bezdestičková ^ Objem > 500 ul Zkumavka se zátkou Správná velikost zkumavky ^ naplněná do 3/4 Rychlé zamrazení (-70 °C, -196 °C) Skladování zamrazených vzorků ^1 krátkodobé -20 °C, dlouhodobé: - 70 °C Rozmrazování vzorků Při 37 °C min 5 minut Dobře promíchat Opakované zamrazení není možné Analytické faktory Dodržování metodických postupů Správné pracovní návyky Správná funkce a kalibrace přístrojů Výběr diagnostických setů a reagencií Správná volba kalibračních a kontrolních materiálů Správně provedená kalibrace a kontroly kvality Postanalytické faktory Rozmezí fyziologických hodnot Terapeutické rozmezí Vyjadřování výsledků Vyhodnocení výsledků Interpretace výsledků