Imunochemické techniky Miroslava Beňovská Obr 1: Antigeny – hapten, nosič, determinanty • Látky schopné vyvolat v živém organismu tvorbu specifických protilátek • Imunitní odpověď může vyvolat pouze kompletní antigen - imunogen • Nekompletní antigen – hapten (např. léky, nízkomolekulární peptidy, hormony, aj.) – vyvolá tvorbu protilátek pouze tehdy, je-li navázán na bílkovinný nosič skenování0007 Antigeny Protilátky •Bílkoviny vznikající v organizmu jako jeho odpověď na přítomnost antigenů •Vykazují specifickou vazebnou aktivitu k antigenu, proti kterému byly připraveny •Jsou to imunoglobuliny - v laboratorní praxi jsou obsaženy v tzv. antisérech • Specificita a senzitivita imunoanalytických metod jsou ovlivněny používanou protilátkou Protilátky: •Používají se protilátky monoklonální a polyklonální • •Monoklonální protilátky – produkovány hybridony, které se připravují fůzí imunizovaných slezinných buňek s nádorovými • - po vyčištění a selekci produkují jen jedinný typ protilátky • - dosahuje se vyšší specificity, kontinuální produkce • •Polyklonální protilátky – připravují se imunizací zvířete, jsou vždy směsí protilátek, jsou schopny rozeznat i izoformy antigenu • - mají proto vyšší citlivost • - závisí na imunizovaném zvířeti, získání může být neopakovatelné • •Pro výslednou senzitivitu stanovení je podstatný také způsob detekce – dostatečnou citlivost mají např. luminiscenční metody Epitopy (antigenní determinanty): q imunologicky aktivní oblasti imunogenu (antigenu) - přístupná místa na povrchu imunogenu q velikost epitopů je určena velikostí vazebného místa pro antigen na protilátkové molekule (velikostí paratopu) Vazba protilátky s epitopem zahrnuje slabé nekovalentní interakce (vodíkové můstky, disperzní síly, elektrostatické síly) • • fungují na krátké vzdálenosti, závisí na komplementaritě epitopu a paratopu, aby se tyto interakce maximalizovaly. • vliv ipntové síly Antigeny a vazebná místa protilátek Avidita •Antigeny obsahují několik determinantů, proto • se zavádí pojem avidita, který charakterizuje • vazebnou energii mezi komplexním antigenem • a protilátkou • •Avidita je závislá na afinitě, ale bere v úvahu • valenci antigenu a protilátky i nespecifické faktory, které ovlivňují vazby mezi antigenem a protilátkou Imunochemické techniky •používají se imunochemické metody •založeny na specifické reakci antigen – protilátka • •Dělení: • - dle uspořádání reakce – kompetitivní, nekompetivní (sendvičové) • • - dle prostředí •homogenní imunoanalýza (stanovení a detekce přímo v reakční • směsi – př. fluoroimunoanalýza, přístroj Kryptor, firma Brahms) •heterogenní imunoanalýza (po separaci vytvořeného imunokompl.) • • – dle techniky použité k měření signálu – radioimunoanalýza, enzymoimunoanalýza, luminiscenční imunoanalýza, fluoroimunoanalýza • • - dle použité značky (radioizotop, enzym, luminofory, fluorofory) • (neznačené metody – viz imunoturbidimetrie, imunonefelometrie) • - dle způsobu provedení: jednostupňové - dvoustupňové • manuální analýzy - automatizované analýzy METODY STANOVENÍ – •Imunoanalytické metody • • Detekce s vysokou citlivostí: • luminometrická (LIA, ILMA, CMIA, ECL) • fluorometrická ( MEIA, FPIA, TRACE, DELFIA) • fotometrická – enzymová (EIA,ELISA, EMIT) • radioaktivní (RIA, IRMA) • • Uplatnění pro analyty s nízkou koncentrací (nmol/l, pmol/l) • • Imunometody rozdělení •Homogenní analýzy • U této techniky není potřeba odstraňovat reaktanty - oddělovat nenavázanou protilátku (send.) či imunokomplex (komp.) – vše mimo vázaný komplex je inaktivní, nedává signál - stanovení a detekce probíhá přímo v reakční směsi. Je to rychlejší a jednodušší technika. • •Heterogenní analýzy • Obě složky dávají signál, jednu nebo druhou je třeba oddělit Luminiscenční •Lumino Immuno Assay (LIA) •Chemiluminescent Magnetic Immuno Assay (CMIA) •Immuno Lumino Metric Assay (ILMA) •ElectroChemiLuminiscence (ECL) • Fluorescenční •Fluorescence Immuno Assay (FIA) •Fluorescence Polarization Immuno Assay (FPIA) •Dissociation Enhanced Lanthanide Fluoro Immuno Assay (DELFIA) •Time Resolved Aplified Cryptate Emission (TRACE) Enzymové - fotometrický princip •Enzymo Immuno Assay (EIA) •Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) •Enzyme Multiplied Immunoassay Technique (EMIT) •Immuno Enzyme Metric Assay (IEMA) Enzymoimunoanalýza • Enzymy křenová peroxidáza • substrát peroxid vodíku, uvolněný kyslík oxiduje bezbarvý chromogen (o-fenylendiamin) • alkalická fosfatáza substrát p-nitrofenylfosfát glukozooxidáza beta-galaktosidáza Radiometrické •Radio Immuno Assay (RIA) •Immuno Radio Metric Assay (IRMA) •Radio Enzymo Assay (REA) •Radio Receptor Assay (RRA) Citlivosti metod Metoda (g) EMIT 10-6 FIA, FPIA, EIA 10-9 RIA, REA, IRMA 10-12 LIA, ILMA 10-15 Základní postup při imunoanalýze: •smíchání komponent • inkubace – vznik kompexu antigen - protilátka • separace (v případě heterogenní imunoanalýzy, • časté využití magnetu) • reakce značenky komplexu antigen – protilátka • s chemickou látkou startující reakci • s detekovatelným efektem • detekce (př. chemiluminiscence) Kompetitivní stanovení: •Stanovovaný antigen soutěží se stejným antigenem, na který je navázána značenka o limitované množství protilátky •Velikost odezvy je nepřímo závislá na koncentraci stanovovaného analytu •Kalibrační křivka má hyperbolický tvar •Metoda je vhodná pro nízkomolekulární analyty s malou molekulou (př. B12, folát, teofylin, fenytoin T3, steroidní hormony) • S výhodou se u ní používají polyklonální protilátky Sendvičové stanovení: •Stanovovaný antigen ze vzorku reaguje a dvěma protilátkami, které jsou v reakční směsi v přebytku •Jedna protilátka bývá značená, druhá protilátka umožňuje separaci vznikajícího komplexu •Velikost měřeného signálu je přímo úměrná koncentraci stanovovaného antigenu • ( parabolický tvar kalibrační křivky) •Metoda se používá pro molekuly s vyšší molekulovou váhou, které umožňují vazbu protilátek na dvě determinanty – př. TSH, ferritin, nádorové antigeny, PSA, S100, srdeční troponiny, osteomarkery •Často se používájí monoklonální protilátky Můstkové uspořádání: • •Podobné jako sendvičové uspořádání, ale princip je používán ke stanovení protilátek (př. IgA) • •Protilátka reaguje s dvěma antigeny sejmout0001 Heterogenní imunoanalýza Radioimunoanalýza: •Patří mezi heterogenní, ruční metody • •Nejstarší imunoanalytická metoda • •Od roku 1959 • •Citlivá, náročná na ruční práci a na zachování předpisů při práci s radioizotopy • •Jako značka se používá izotop jódu 125I - c – zářič s poločasem rozpadu 60 dní (případně b - zářič tricium (3H) s poločasem rozpadu kolem 12 roků) • •Kompetitivní uspořádání (RIA) • •Sendvičová metoda (IRMA – Imunoradiometrická analýza) • •Nezastupitelné místo • •Metody pro nově používané analyty Schematické znázornění kompetitivního stanovení (RIA): smíchání komponent, inkubace (vznik komplexu antigen-protilátka), separace (ukotvení komplexu na pevném nosiči a promytí) a detekce sejmout0012 Příklad - stanovení 17-OH Progesteronu: •Zvýšené hladiny 17-OHP v krvi nasvědčují vrozenému metabolickému onemocnění kongenitální adrenální hyperplasii (CAH) •Principem stanovení je kompetitivní RIA ve zkumavkách potažených protilátkou proti 17-OHP •Inkubace ve zkumavkách potažených protilátkou společně s 17-OHP značeným 125I (radioindikátor) •Odsátí obsahu zkumavek •Měření radioaktivity navázaného komplexu ve zkumavce •Koncentrace 17-OHP ve vzorcích se odečítá z kalibrační křivky Detekce - scintilační detektor: •Multidetektorový gama měřič LB 2104 •Kvantitativní měření radioaktivity gama záření radioaktivních nuklidů •Založen na vzniku luminiscence při průchodu ionizujícího záření vhodnou látkou - scintilátorem •Jako scintilační jednotka se používají krystaly NaJ/Tl , tj. jodidu sodného se stopami thalia •Systém je vybaven 12 scintilačními jednotkami (sondami) a fotonásobičem •Při průchodu záření gama scintilačním krystalem vznik fotoelektrického jevu a Comptonova rozptylu (foton vyráží elektron a ztrácí část energie) •Elektrony uvolněné z atomových obalů excitují atomy krystalu •Vzniká viditelné luminiscenční záření – scintilace •Fotonásobiče - mění scintilaci na elektrické impulsy •Lze měřit až 12 zkumavek současně ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) •Patří k enzymové heterogenní imunoanalýze - enzym jako značka ( křenová peroxidasa ), ruční technika •Enzymová imunoanalýza může být využívána také na imunoanalyzátorech (př. Immulite, Siemens, enzym ALP) •Kompetitivní nebo sendvičové uspořádání •Stanovení na mikrotitračních destičkách, potažených protilátkou •Fáze stanovení jako u radioimunoanalýzy •Pro usnadnění práce se využívají vícekanálové pipety a automatické promývací stanice •Detekce - ELISA reader Vysokoúčinná promývačka mikrotitračních destiček ( firma TECAN) sejmout0002 ELISA reader ELx800, firma BIO-TEKK vertikální fotometr pro mikrotitrační destičky, měří koncentrace v celé destičce současně sejmout0007 ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) •Nevýhodou stanovení je nutnost provedení vícebodové kalibrační závislosti při každém měření. Vzhledem k tomu, že metodika se v současnosti používá většinou pro vysoce speciální analyty, které nebyly dosud převedeny na automatické imunoanalyzátory, bývají vzorky skladovány, dokud se jich neshromáždí větší počet. Mikrotitrační destičky je možno rozložit na jednotlivé použky, takže není nutné zpracovat celou destičku. •Na pracovištích, kde se provádí větší počet ELISA stanovení je možno zakoupit také systém, kde je pipetování, promývání i měření automatizováno ( BRIO od firmy DRG). ELISA •Nevýhoda - provedení vícebodové kalibrační závislosti při každém měření • •Skladování vzorků,většinou se neprovádí denně • •Mikrotitrační destičky lze rozložit na jednotlivé proužky • •Možnost automatizace pipetování, promývání i měření ( BRIO od firmy DRG) Příklad ELISA - stanovení luteinačního hormonu: •Sendvičová technika • •Jamky v mikrotitrační destičce potaženy monoklonální protilátkou proti LH - vychytává LH ze vzorku • •Druhá protilátka je polyklonální, značena křenovou peroxidasou • •Inkubace 1 h při 37 oC, pětinásobné promytí • •Přidat substrát tetrametylbenzidin - reaguje s enzymem • •Zastavení reakce kyselinou sírovou • •Intenzita zbarvení se měří při 450 nm MEIA (Enzymová imunoanalýza na mikročásticích; Microparticle Enzyme Immunoassay) •Technika patří mezi heterogenní enzymovou imunoanalýzu na mikročásticích •Imunokomplex značený enzymem (ALP) •Jako fluorogenní substrát např. • 4-metylumbelliferylfosfát (MUP) - s ním reaguje enzym (ALP) - vzniká 4-metylumbelliferon (MU) a po jeho excitaci vzniká fluoroscenční záření •Jako světelný zdroj se používá Hg-výbojka ((l = 365 nm), MU emituje fluorescenční záření((l = 448 nm) Luminiscenční imunoanalýza (heterogenní) – automatické imunoanalyzátory: •Analyzátory s přímou chemiluminiscenční detekcí rozšířené •Vysoká citlivost - vhodné pro stanovení hormonů •Luminofory používané ke značení nemají interference v biologických materiálech •Zavedení nové metody časově i finančně náročné, trvá několik let •Nabídka metod bývá proto pozadu za technikou RIA a ELISA •Výhodou je automatizace, případně provedení klinických a imunoanalytických metod z jedné zkumavky •LIA - kompetitivní •ILMA – nekompetitivní (sendvič) Cheminiluminiscence – Centaur, firma Siemens (Bayer) •Princip měření: •Systém měří kvantitativní množství světla emitovaného během chemiluminiscenční reakce •Pevná fáze jsou paramagnetické částice •Značka - AE (acridinium ester) - chemiluminiscenční látka, která emituje světlo při oxidaci H2O2 v alkalickém prostředí •Reakce probíhá během jedné sekundy, je velice citlivá ( 10-15 ) LIA - kompetitivní – př. stanovení estradiolu •Estradiol ve vzorku soutěží s estradiolem označeným akridinium esterem o limitované množství králičí protilátky proti estradiolu •Králičí antiestradiolová protilátka je navázána na myší protilátku proti králičímu IgG, která je spojena s paramagnetickými částicemi • sejmout0005 LIA kompetitivní – př. stanovení estradiolu •Po inkubaci systém magneticky odseparuje komplex antigen – • protilátky s paramagnetickými částicemi a promyje částice •Dále se přidá peroxid vodíku a v luminometru NaOH, který inicializuje chemiluminiscenční reakci • sejmout0006 ILMA sendvičová – př.stanovení hCG •Konstantní množství dvou protilátek. •První polyklonální kozí protilátka proti hCG, označená acridinium esterem •Druhá, monoklonální myší protilátka proti hCG kovalentně vázaná s paramagnetickými částicemi •Obě protilátky specifické pro odlišné přítomné epitopy, free betasubjednotku a betasubjednotku intaktní molekuly • sejmout0003 sejmout0013 LIA sendvičová – př.stanovení hCG •Po separaci, odsátí a promytí se opět dávkuje reagent a proběhne chemiluminiscenční reakce • sejmout0004 Elektrochemiluminiscence – přístroj Elecsys nebo Modular s modulem E 170 (Roche Diagnostic) •Uspořádání metody – kompetitivní nebo sendvičové •Protilátka nebo antigen biotynilovány • Další specifická protilátka je značená rutheniovým komplexem • sejmout0008 Rutenium(II) tris-bipyridylovým komplexem Elektrochemiluminiscence – přístroj Elecsys, Cobas nebo Modular s modulem e (Roche Diagnostic) •Sendvičové uspořádání •Protilátky reagují s antigenem ve vzorku (např. TSH) za tvorby sendvičového komplexu •Firma využívá většinou monoklonální protilátky •Po přidání mikročástic potažených streptavidinem se komplex váže na pevnou fázi interakcí biotinu se streptavidinem •Mikročástice se zachycují magnetickým polem na povrchu elektrody •Po přidání substrátu tripropylaminu (TPA) a přivedení napětí na elektrody vzniká elektrochemiluminiscenční emise – ruthéniový komplex uvolní na elektrodě elektron za vzniku Ru(bpy)3 3+ kationtu •Ruthéniový marker se po luminiscenční reakci regeneruje Elektrochemiluminiscence – přístroj Elecsys nebo Modular s modulem E 170 (Roche Diagnostic) sejmout0009 sejmout0011 Elektrochemiluminiscence – přístroj Elecsys nebo Modular s modulem E 170 (Roche Diagnostic) •Kompetitivní uspořádání (např. stanovení fT4) •soutěží stanovovaný antigen s biotynilovaným antigenem o limitované množství značené protilátky (polyklonální) •Pouze komplex biotynilovaný antigen – protilátka se může vázat na paramagnetické částice •Komplex stanovovaný analyt – protilátka je při separaci odstraněn •Dále probíhá reakce stejně jako v předchozím případě • Velikost signálu je nepřímo úměrná koncentraci stanovovaného analytu sejmout0010 Technologie ChemiFlex CMIA (Abbott) •CMIA (Chemiluminescent Microparticle Immunoassay) chemiluminiscenční imunoanalýza na paramagnetických mikročásticích •Značení patentovaným akridiniem •Možnost dvou promývacích kroků (One Step, Two Step) • • CMIA - princip •Mikročástice (microparticles): mikročástice potažené rekombinantním antigenem ve fyziologickém roztoku s TRIS pufrem • •• Konjugát :konjugát rekombinantních antigenů s akridiniem a monoklonální protilátkou proti příslušnému antigenu s akridiniem CMIA - princip • • •1. Dávkování paramagnetických mikročástic obalených záchytovými molekulami do reakční nádobky se vzorkem • • •2. Inkubace v třepačce, analyt ze vzorku se naváže na záchytové molekuly na mikročásticích – vznik imunokomplexu • • • • • • N:\OKBH\_APPS\SLP_WIN\tmp\HVEZDAKAEI_soubory\image002.gif CMIA - princip • •3. Po inkubaci přitáhne magnet paramagnetické mikročástice (navázané na specifický analyt) ke stěně reakční nádobky • Následuje proplach reakční směsi a odstranění nenavázané látky • • • • • • • • Přitažení paramagnetických mikročástic magnetem • N:\OKBH\_APPS\SLP_WIN\tmp\HVEZDAKAEI_soubory\image003.jpg CMIA - princip • 4. Přídavek konjugátu značeného chemiluminiscenčním akridiniem • Konjugát se naváže na imunokomplex • • • • • • • • • Přidání akridiniového konjugátu • • • 5. Inkubace • • 6. Promytí a odstranění nenavázaného analytu • N:\OKBH\_APPS\SLP_WIN\tmp\HVEZDAKAEI_soubory\image004.jpg CMIA - princip •7. Nadávkuje se Pre-Trigger (peroxid vodíku) a optický systém CMIA provede čtení pozadí • Pre-Trigger plní následující funkce: • – vytváří kyselé prostředí, které zabraňuje předčasnému uvolnění • emise světla • – pomáhá předcházet shlukování mikročástic • – slouží k odštěpení akridiniového barviva z konjugátu navázaného na komplex mikročástice • Akridiniové barvivo je připraveno pro další krok. • •8. Do reakční směsi se nadávkuje Trigger (hydroxid sodný). Dojde k oxidační reakcí a vzniku chemiluminiscence • Vzniká N-methylakridon a při návratu do základního energetického stavu uvolní energii ve formě emise světla • •9. Obsah analytu je zjišt’ován na základě měření chemiluminiscenční emise CMIA – stanovení kortisolu •Jednokroková imunoanalýza, kompetitivní •Vzorek se smíchá s paramagnetickými mikročásticemi potaženými protilátkami proti kortizolu •Kortizol ze vzorku se naváže na protilátky proti kortizolu na mikročasticích •Po inkubaci se do reakční směsi přidá konjugát kortizolu s akridiniem •Konjugát soutěží o dostupná vazebná místa na mikročasticích potažených protilátkami proti kortizolu •Po druhé inkubaci se mikročástice promyjí a do reakční směsi se přidají roztoky Pre-Trigger a Trigger •Množstvi kortizolu ve vzorku je nepřímo úměrné jednotkám RLU (Relative Light Units), ve kterých se měří výsledná chemiluminiscenční reakce • Fluorescenční imunoanalýza Fluorescenční enzymová imunoanalýza – RAD 120 (Radim) •např. Stanovení prolaktinu (sendvič) •ke vzorku a přidá polyklonální protilátka navázaná na magnetizovatelné částice •a monoklonální protilátka proti prolaktinu značená alkalickou fosfatasou •inkubace, promytí •přidá se substrát – 4-methylumbelliferyl fosfát •při další inkubaci vznik 4- methylumbelliferon •fluorescence při 450 nm DELFIA Dissociation-Enhanced Lanthanide Fluorescent ImmunoAssay •Fluoroimunoanalytická heterogenní metoda vyvinutá (finskou firmou Wallac Oy) •Velmi citlivá a specifická metoda pro stanovení nízko- i vysokomolekulárních analytů. •využívá časově modulované měření fluorescence chelátu lanthanidů - Europium, Terbium, Sammarium.. delfiaassayprinciple periodická tabulka2 DELFIA - princip •Protilátka nebo antigen jsou označeny fluorescenční sondou – chelátem lanthanoidu, nejčastěji Europia •Po proběhlé imunochemické reakci se ke vzniklému komplexu přidává „zesilovací“ roztok, který odtrhne Eu z komplexu a přemění jej na nový intenzivně fluoreskující chelát - fluorescence s velkým Stokesovým posunem fluorescenčního spektra (rozdíl mezi vlnovou délkou excitace a fluorescence) –Vzorek je pulsně excitován zářením o vlnové délce 340 nm –Fluorescence se měří v dlouhovlnné části viditelného spektra (Europium 620 nm ). delfiaassayprinciple Fluo2 DELFIA Uspořádání imunochemické reakce: - kompetitivní: - fluorescenční sondou značený antigen - intenzita fluorescence nepřímo úměrná koncentraci analytu ve vzorku - nekompetitivní (sendvičové): - fluorescenční sondou značená protilátka - intenzita fluorescence přímo úměrná koncentraci analytu ve vzorku a4 DELFIA - současné stanovení více analytů Fluorescence lanthanidů: §Úzké emisní píky při různých vlnových délkách (Eu 613 nm, Sm 643 nm) §Různá doba trvání fluorescence europia a sammaria - Při měření se nepřekrývají vlnové délky ani časy odečtu fluorescence Eu a Sm - umožňuje současné stanovení dvou analytů a2 Simultánní analýza2 DELFIA - využití DELFIA lze použít pro široké spektrum analytů (v principu lze lanthanidem označit každou stabilní sloučeninu obsahující aminoskupinu): -Proteiny -Peptidy -Oligonukleotidy -Malé organické molekuly (steroidy, aminokyseliny, léky,…) Novorozenecký screening (stanovení ze suché krevní skvrny): -TSH (kongenitální hypotyreóza) -17-hydroxy-progesteron (kongenitální adrenální hyperplázie) -Imunoreaktivní trypsinogen IRT (cystická fibróza) DELFIA praktické provedení -Pracuje se v mikrotitračních destičkách v uspořádání 8x12 jamek se specifickou protilátkou (obvykle monoklonální) vázanou na pevné fázi mikrotitr destičky postup DELFIA - linka Autodelfia HOMOGENNÍ IMUNOANALÝZA FPIA (Fluorescenční polarizační imunoanalýza; Fluorescence Polarization Immunoassay) • •Patří mezi homogenní kompetitivní immunoanalýzu •Stanovovaný analyt a analyt značený fluoresceinem soutěží o vazebná místa na specifické protilátce • K excitaci se používá lineárně polarizované světlo (l = 485 nm - zdroj wolframová lampa + polarizační filtr) •Při návratu molekuly fluoroforu do základní stavu se měří emise zeleného světla přes polarizační filtr •Intenzita polarizovaného světla je nepřímo úměrná koncentraci stanovovaného antigenu FPIA (Fluorescenční polarizační imunoanalýza; Fluorescence Polarization Immunoassay) • •Využívá různé rychlosti rotace velkých a malých molekul (imunokompl. a antigenu)- změna polarizace • •Malé molekuly (stanovovaný analyt a značený analyt) se otáčejí rychle, po excitaci polarizovaným světlem značený analyt emituje fluorescenční záření do mnoha směrů - naměří se pouze nízká intenzita tohoto záření • •Po vzniku velké molekuly (imunokomplex)-dojde ke snížení rychlosti rotace - emitované světlo kmitá ve stejné rovině jako excitující – naměří se vysoká intenzita záření • •Pro stanovení malých antigenů (např. léků,…) FPIA 1 2 Homogenní fluorescenční imunoanalýza – TRACE (Time Resolved Amplified Cryptate Emission) - Kryptor (Brahms) •Princip měření: •Neradioaktivní přenos energie z donoru (kryptátová struktura s iontem europia v centru) na akceptor (chem. modif. protein) • •Měření signálu emitovaného z imunokomplexu s časovým zpožděním • •Měřený vzorek je ozářen dusíkovým laserem, následně donor (kryptát) emituje fluorescenční signál, po něm emituje signál akceptor • •Odpadají promývací a separační kroky Technologie LOCI - Siemens •Technologie založena na přenosu kyslíku • •První homogenní imunoanalytická metoda s chemiluminiscenční detekcí – novinka • •Vysoká citlivost • •Přístroj Dimension Vista 1500 Intelligent Lab Systém Technologie LOCI - Siemens •Princip: •Dvě latexové kuličky • – jedna obsahuje olefinové barvivo a protilátku specifickou pro • analyzovanou metodu (chemibead) • - druhá je potažená streptavidinem a obsahuje barvivo, které • generuje singletový kyslík (sensibead) •Do reakce dále vstupuje • - stanovovaný analyt • - biotinylovaná protilátka specifická pro analyt. •Vytvoří se imunokomplex ze všech popsaných komponent. •Po osvětlení komplexu se z sensibead uvolní singletový kyslík, pronikne do chemibead a uvolní chemiluminiscenční záření • Technologie LOCI - Siemens EMIT •Homogenní, kompetitivní EIA •Měří se aktivita volného enzymu AgE •Enzym v imunokomplexu AgE –Ab je inhibován •Aktivita enzymu klesá při vazbě na protilátku, proto lze koncentraci látky ve vzorku měřit podle změny aktivity enzymu •Test založen na kompetici mezi látkou ve vzorku a látkou značenou enzymem glukoso-6-fosfát dehydrogenázou (G6PDH) o vazebná místa na protilátce •Aktivní enzym mění nikotinamidadenindinukleotid (NAD) na NADH --} změna absorbance (spektrofotometricky) •AgE a AgE –Ab není třeba oddělovat •Vhodné pro malé molekuly - léky,drogy, mykofenolát •Rychlost, jednoduchost provedení práce v jedné kyvetě, automatizace, přímá úměra •Příklad – stanovení drog na přístroji Viva-E, Siemens •Metoda je semikvantitativní – skupinový test • • • MULTIPLEXOVÉ METODY Princip xMAP technologie (microarraye partical): •100 druhů mikrokuliček (magnetické) rozlišených kombinací dvou fluorescenčních barev •Na každém druhu je navázána molekula vázající specificky jeden analyt •Na kuličku se naváže analyt a druhá protilátka. Kuličky protékají přístrojem (Luminex 100 IS, Luminex Corp.) - princip flow cytometrie •Měří se fluorescence vzniklé po excitaci dvěma lasery – z nich se vyhodnotí – druh a množství analytu MULTIPLEXOVÉ METODY- vlastnosti •xMAP technologie poskytuje možnost simultanního měření až 100 analytů v jedné jamce mikrotitrační destičky •Analýzu je možné provádět pro předem připravené panely vyšetření – př. cytokiny •Potřeba velmi malého objemu •Nižší cena za vyšetření •Dlouhá inkubace a nutnost práce ve větších sériích •Metodika je vhodná pro měření imunochemických metod, mukleových kyselin, enzymů • Biočipová array technologie: •Imunoanalýza založená na simultánní multianalýze • •Na jednom biočipu se analyzují celé panely příbuzných testů • •Principem stanovení je ELISA (přístroj Evidence, Randox)