Biologie reprodukce & Embryologie
Brno, Březen 2016
Gamety
• Meióza
• Struktura a vývoj
• Rozdíly mezi vývojem vajíčka a spermie
• Regulace gametogeneze
• Ovariální a menstruační cyklus – vzájemný vztah
• Transport gamet, kapacitace spermií, akrozomová reakce
Oplození and časná embryogeneze
• Kortikální reakce
• Rýhování, morula, blastocysta
• Aktivace embryonálního genomu
• Embryonální kmenové buňky, přenos jádra (klonování)
Přednáška 3
Zygota
Mnohobuněčné
embryo
Dynamický
mnohobuněčný
organismus
DIFERENCIACEBUNĚK
a
MORFOGEZE
STABILNÍ GENOM
Genomická ekvivalence
(= stejné množství DNA a stejná
nukleotidová sekvence ve všech
buňkách organismu – klonování)
VARIABILNÍ
TRANSKRiPTOM
Regulátory transkripce
X
Embryologie: co vše zahrnuje?
Embryonální x Fetální vývoj
Všechny orgány
jsou založeny
Embryo Fetus
8. týdenFertilizace Týden
39-40
Porod
Primitivní
srdce
začíná bít
ve
čtvrtém
týdnu. 7 weeks
Časné embryo
před implantací
K čemu je dobré pochopení principů reprodukce,
vývoje gamet a embryonálního/fetálního vývoje?
• Léčba neplodnosti
• Kontracepce
• Eliminace vývojových abnormalit
Genetický základ vývoje gamet
Vyšetření genetického stavu plodu (amniová tekutina)
Porozumění efektům teratogenních agens
Vyšetření uvnitř dělohy - sonografie
Chirurgické zákroky uvnitř dělohy
Další
Moderní přístroje
Kultivace buněk
in vitro
Molekulární biologie
a genetika
Proces rozmnožování
• zajišťuje kontinuální propagaci jedinců daného druhu
a tedy jeho trvalou existenci
• klíčové pro rozmnožování je přenesení duplikátu DNA
z rodičů na potomstvo
• u drtivé většiny druhů je tento přenos zajištěn pomocí
vysoce specializovaných buněk – gamet
Jedinci odlišného pohlaví produkují odlišné gamety
Základní předpoklad pohlavního rozmnožování
Pohlavní rozmnožování prostřednictvím gamet
se může jevit jako zbytečně komplikované a méně efektivní než rozmnožování nepohlavní, ale
má velmi významnou adaptační úlohu.
Tato adaptační úloha se realizuje díky unikátním genetickým procesům,
které se odehrávají během vývoje obou typů gamet – vajíček a spermií.
Přestože v mnoha morfogenetických detailech se vývoj
vajíček a spermií mezi sebou výrazně liší, podstata
klíčových genetických procesů je u obou shodná.
Genetické procesy klíčové pro gametogenezu se
odehrávají během meiotického buněčného dělení -
MEIÓZY
Tyto genetické procesy zahrnují:
• Redukci počtu chromozomů
• Nezávislou segregaci chromozomů
• „Crossing over“
Redukce počtu chromozomů
Proč?
Somatická buňka Somatická buňka
2n 2n
Potomek
4n
Gamety musí mít haploidní počet chromozomů (n), aby splynutí gamet
nevedlo u potomků ke znásobení počtu chromozomů nad diploidní počet (2n).
Principielně by se redukce počtu chromozómů mohla snadno odehrát v jednom kroku vynecháním
replikace DNA s následnou separací homologních chromozomů při jednom dělení buňky.
2n
1n
1n
Meióza – dvě dělení
místo jednoho
replikace DNA
tvorba bivalentů
„crossing over“
1. meiotické dělení
Nezávislá segregace chromozomů
2. meiotické dělení
Oddělení chromatid
2n
2C
2n
4C
1n
2C
1n
2C
1n
1C
1n
1C
Plně funkční
pohlavní buňky
• „Crossing over“
• Nezávislá segregace chromozomů
• Fertilizace
jsou zdrojem genetické diverzity, která
je základem adaptace živých organismů
včetně ČLOVĚKA
Spermie Vajíčka
Význam pro
vývoj embrya
(reprodukci)
Morfologické
a fyziologické
vlastnosti
Vývoj a mechanismy,
které jej řídí
Genetická funkce
O
D
L
I
Š
N
É
S
H
O
D
N
É
X
Primordiální zárodečné buňky – PGC
• kmenové buňky, které jsou společné spermiím i oocytům
• vznikají ve žloutkovém váčku (extraembryonálně)
• množí se mitotickým dělením a současně migrují do základu gonád
(díky signálům z okolního prostředí – laminin, kit-ligand, TGF-beta1, …)
• u člověka jsou pohlavně indiferentní až do ~6 týdne vývoje
+
• počet oocytů (folikulů) v
ováriu je v okamžiku narození
neměnně dán (u ženy ~500 000)
• pouze malý počet oocytů se
za život vyvine ve vajíčko
schopné oplození (u ženy ~400)
• v okamžiku menopauzy
zůstává v ováriu díky atresii
pouze malý počet oocytů
(u ženy ~100-1000)
• spermie se ve varlatech tvoří
nepřetržitě od dosažení
pohlavní dospělosti až do velmi
vysokého věku (dvě varlata muže
mohou každou sekundu vyprodukovat více
než 1000 spermatozoí)
VÝVOJOVÉ
PROCESY
~0,12 mm
Jedna z největších a „nejvzácnějších“
(počtem i významem) buněk v těle.
Paradoxní buňka
Vysoce specializovaná buňka
Jediná buňka v těle ženy, která je
schopna projít meiózou a oplozením,
a dát tak vznik novému individuu.
„Totipotentní“ buňka
Je schopna generovat buněčnou
různorodost mnohobuněčného
organismu.
&
Ani éra klonování nedokázala vzít vajíčku jeho nenahraditelnou úlohu !
Oocyt
G2/M zástava
mitotické
dělení
růst
(měsíce až rok)
meiotické zrání
(hodiny)
PGC & oogonie
MI MII
Znovuzahájení
meiózy
Zastavení meiózy v diplotene
1. meiotického dělení
Vajíčko schopné
oplození a podpory
embryonálního vývoje
Klíčová období vývoje vajíčka
Kde a jak se vývoj vajíčka odehrává ? (1)
DiploteneI.meiotickéhodělení
Uvnitř ovária
30 mm
20 mm
Výběr dominantního folikulu
(nejcitlivější k FSH)
Preantrální folikul
(časné stádium)
Rekrutovaný folikul
Antrální folikul
(střední velikost)
Preovulační fol.
(velký)
Primordiální folikul
~14 dní
Růst
FSH-
independentní
Masivní produkce
hormonů
Androstendion
Theca folliculi interna
Estradiol
Granulózní buňky
Odehrává se v ováriu (současně s růstem folikulu)
Je plně závislý na kontaktu oocytu s granulózními buňkami folikulu
(např. protein „gap junctions“ connexin-37)
Signál, který iniciuje růst není znám
(není to FSH - hypofyzektomie nezabrání iniciaci růstu)
Komunikace mezi oocytem a granulózními buňkami je obousměrná
&
&
&
kit-
ligand
GDF-9
Kde a jak se vývoj vajíčka odehrává ? (2)
Růst oocytu
Pomalý, u člověka několikaměsíční proces
100x zvětšení objemu – akumulace organel a molekul dávajících vajíčku
schopnost podporovat vývoj embrya až do okamžiku získání autonomie
(asi 105 mitochondrií oocytu podporuje vývoj embrya až do stádia blastocysty)
Intenzívní transkripce akumulace
mRNA v dormantním
stavu (regulováno polyadenylací a ???)
růst oocytu
transkripce
Plně vyrostlý oocyt – ~2,5 ng RNA
Intenzívní translace – mnoho proteinů (velmi omezené znalosti)
Příklad: ZP1, ZP2, ZP3 – proteiny zona pellucida
Plně vyrostlý oocyt – ~120 ng proteinu
Transkriptom
a proteom –
podmiňují
unikátní
vlastnosti
oocytu
Kde a jak se vývoj vajíčka odehrává ? (3)
Růst oocytu
Reaktivace X chromozomu
• somatické buňky – jeden X chromozom inaktivován hypermetylací cytozinů
v molekule DNA
• rostoucí oocyt – oba X chromozomy aktivní (nutné pro vývoj oocytu – karyotyp
45, X0 má za následek abnormální vývoj ovária)
Genomický imprinting
• epigenetická modifikace autozomálních chromozomů vedoucí
k monoalelické expresi genů - umožněna aktivitou enzymu DNA
metyltransferázy
• PGC jsou globálně demetylovány
• během růstu oocytu dochází k novému ustavení imprintingu (asi 40 genů)
&
Abnormality v imprintingu mohou být důvodem
spontánních abortů při asistované reprodukci !!!
(in vitro manipulace s gametami a embryi může vést
k abnormalitám v imprintingu)
Kde a jak se vývoj vajíčka odehrává ? (4)
Epigenetické změny odehrávající-se během růstu
plně vyrostlý
oocyt (G2/MI) oocyt v MI
oocyt
v interfázi vajíčko v MII
zygota
Penetrace
spermie
GVBD
člověk ~ 25 hodin
aktivitaMPF
LH Transkripce inhibována Translace aktivníX
pokles
cAMP
Kde a jak se vývoj vajíčka odehrává ? (5)
Poslední hodiny před ovulací – meiotická maturace
Poslední pohled na ovárium
Hormonální regulace
ovariálního cyklu
Hypotalamus
Hypofýza
Gonadotropin-releasing
hormon
(pulzy)
Růst folikulů
Meiotická maturace
+ Ovulace
Corpus luteum
Gonadotropiny
FSH LH
Menstruační f. Proliferační fáze Sekreční (luteální) fáze Ischemická Menstruační f.
0 5 14 28 527
Estrogen Progesteron
+ Estrogen
Kde a jak se vývoj vajíčka odehrává ? (6)
Vývoj spermií - Spermatogeneze (1)
Minimální ejakulát (WHO)
• Objem - 1.5 ml
• Koncentrace spermií - 15.1 millions/ml
• Motilita - 40%
Spermie na vajíčku
~4 mm ~60 mm
~0.5 mm
Vývoj spermií (2)
Před
pubertou
Mitotické dělení spermatogonií
v zárodečných pruzích
Po dosažení
puberty
~0.25 mm
~0.5 km
Lumen
Spermatocytogeneze (mitotická f.) Meiotická fáze Spermiogeneze
Vývoj spermií (3)
A0 Spermatogonie – Kmenové b.
A1 Spermatogonie
A2 Spermatogonie
A3 Spermatogonie
B Spermatogonie
• Mitotické dělení
• Spojení s bazální membránou
• 2N, 4C
Primární spermatocyty
Sekundární spermatocyty - 1N, 2C
1. Meiotické dělení
2. Meiotické dělení
Spermatidy – 1N, 1C
Spermiogenize
• Bez dělení !!!
• Diferenciace
Vývoj spermií (4) - Spermiogeneze
Histony na Protaminy
Inaktivace genomu
Ztráta cytoplasmy
Produkce spermií
• 1 milion spermií každou hodinu
• Spermatogeneze trvá ~70 dní
• Transport nadvarletem trvá ~8-17 dní
• Cyklický charakter
(Cyklus semenotvorného epitelu – 16 dní
– stejné vývojové stádium na stejném místě)
Vývoj spermií (5) - Regulace
Sertoliho buňky
•Podpora , ochrana, výživa
•Fagocytóza
•Bariéra krev-varle (zon. occlud.)
•Anti-mullerian hormon
•Produkce fruktózy
•Produkce inhibinu (inh. FSH prod.)
Leydigovy buňky
•V intersticiu
•10 % hmoty varlete
•Produkce testosteronu
Oplození (1)
= proces, který kulminuje spojením jádra spermie
s jádrem vajíčka v jeho aktivované cytoplazmě
Kde se gamety potkají ?
Ovárium
Uterus
Ovidukt
Ampula
Oplození (2) Oocyt se připravuje na penetraci spermií
LH
„peak“
Gráfův folikul
35-40 h
Preovulační stádium
Ovulace
Oplození
Fimbriae
Infundibulum
Oocyt je schopen oplození
pouze 12 až 16 hodin
Oplození (3) Cesta spermií do místa oplození
Varle
Semenné
váčky
Ductus
deferens
Nadvarle
Bulbouretrální
žláza
Prostata
Urin. bladder
Uretra
EJAKULÁT
(2-6 ml)
Spermie
200 – 600 milionů
Producty přídatných
pohlavních žláz
• Cholesterol (v prostasomech)
• Prostaglandin
• Fruktóza
• Vesikuláza (koaguluje ejakulát)
Oplození (4) Cesta spermií do místa oplození
Vagina
200-600 milionů spermií
Vejcovod
100-1000 spermií
Děložní krček Děloha
2 – 7 hodin
• Čistí spermie
• Cervikální hlen
stabilizuje spermie
• Zahajuje kapacitaci
• Kyselé prostředí
• Aktivní pohyb spermií
• Odstranění glykoproteinů z hlavičky
• Změna složení buněčné membrány
• Vzrůst pohyblivosti
Oplození (5) Proniknutí spermie do vajíčka
Akrozomální reakce
Zahájena kontaktem se ZP proteiny
Uvolnění akrozinu, neuraminidázy, esteráz
Zona pelucida
Perivitelinní prostor
Vstup do ooplazmy
Fůze s oolemou
Uvolnění hyaluronidázy
Penetrace ZP
Uvolnění lyzosomálních enzymů
z kortikálních granul
Modifikace ZP
Blok
polyspermie
Ukončení II. meiózy
Oplození (6)
Vznik zygoty a první buněčná dělení
Gap junctionsZygota
Prvojádra fůzována
(Syngamie)
DNA
syntéza
Spermie
• DNA
• Cenriol
• „Oocyte-activating
factor“
Ooocyt
• DNA
• Mitochondrie
• Cytoplasma
~6-8 h ~12-14 h ~3-4 dny~8-12 h
O v i d u k t D ě l o h a
Vývoj blastocysty
Kompaktovaná
morula
„Hatched“
blastocysta
„Hatching“
blastocysta
Expandovaná
blastocysta
220-280 mm
Trofoblast
Blastocoel
Embryoblast
Den 5 – 6
(60 až 8O buněk)
Vajíčko – výkonný regulátor exprese genů
PB PN 20 44
G1 S G2/M G1 S G2/M
Translace maternální mRNA
Translace zygotické mRNA
Zygotická transkripce
Represe transkripce
Význam „enhancerů“
Aktivace embryonálního
genomu
Aktivace embryonálního genomu
Nepředstavuje jednu diskrétní událost
(první známky již v zygotě, u člověka maximum ve
4- až 8-buněčném embryu)
Transkripty nahrazující
degradované maternální
mRNA
Nové transkripty určující
zcela nový vzor genové
exprese
Dva typy transkriptů
Je „zodpovědný“ za ustavení stavu totipotence blastomer
Představuje fenomem označovaný REPROGRAMACE genomu
&
Přenos jádra (klonování) - princip
Vajíčko
Somatická buňka
Reprogramace „Normální“ vývoj
Klonování má nízkou efektivitu (1-3%)
Reprogramace je pomalá a nejspíš
nekompletní (výsledkem je abnormální exprese
genů, )
Účinnost reprogamace je závislá na
mnoha faktorech (typ somatické buňky,
stadium buněčného cyklu, …)
Aktivace
Implantace blastocysty
0 5 14 28
Menstruační
fáze
Proliferační
fáze
(estrogeny)
Sekreční
fáze
(progesteron)
Ovulace
následovaná
Oplozením
Funkční zóna
endometria
kompaktní
+
spongiózní
+
bazální
Stroma
Syncytiotrofoblast
Embryoblast
Epitel
Trofoblast
Molekulární hráči
Selektin na trofoblastu + glykoproteiny na epitelu
Integriny + Laminin, Fibronektin
IGF1, IGF2, VEGF
Metaloproteinázy + jejich tkáňové inhibitory
Progesteron
hCH
Prostaglandiny
Časná embryogeneza – Druhý týden (1)
Ukončení implantace + Další embryonální vývoj
• Pokračující invaze do endometria
• Destrukce kapilár a žlázek
• Pohlcování apoptotických buněk (Fas/Fas ligand)
Trofoblast
Cytotrofoblast
• Mitoticky se dělící buňky (jedna vrstva)
• Zdroj buněk syncytiotrofoblastu
Syncytiotrofoblast
• Fůzované buňky (nědělící se, mnohojaderné)
• Produkce hCG (stimuluje CL)Lakuny
trofoblastu
Syncytiotrofoblast
Děložní žlázka
Endometriální
kapilára
Cytotrofoblast
Amniová dutina
Hypoblast
Blastocoel
Embryonální pól
Abembryonální pól
Stav ve dni 8
Epiblast
Rozrůstání kapilár
Diferenciace fibroblastů,
akumulace glykogenu a lipidů
Deciduální reakce endometria
Stav ve dni 10 Stav ve dni 12
Syncytiotrofoblast
Cytotrofoblast
Epitelizace
místa implantace
2-3 mm
Houbovitá struktura
Arteriální větev
Venózní větev
Lacuna
Eroze endometr. kapilár
Fůze lakun – vznik sítě dutin
+
Uteroplacentární
cirkulace
Časná embryogeneza – Druhý týden (2)
Lidské embryonální kmenové (hES)
buňky
(Thompson et al, 1998)
Časné embryo ve stadiu blastocysty
Izolace embryoblastu (ICM - Inner Cell Mass)
Přenesení izolovaného embryoblastu do
in vitro podmínek (+ podpůrné buňky + FGF-2)
Propagace v kultuře mechanickou či enzymatickou
disagregací (opakovaným pasážováním)
Derivace postmeiotických zárodečných buněk
z lidských ES buněk
Prof. Harry Moore, University of Sheffield, 2009
B) C-KIT
C) I-97 antigen
D) Buňky s kondenzovaným
chromatinem a náznakem bičíku
Struktury velmi podobné komplexům
oocyt-granulózní buňky (zóna
pellucida nevyvinuta)
Děkuji za pozornost !
Otázky a komentáře na:
ahampl@med.muni.cz