IMUNOANALÝZA
ELISA, RIA, FIA, LIA
http://www.biology.arizona.edu/immunology/activities/elisa/elisa_intro.html
Mgr. Petr Bejdák
Ústav klinické imunologie a alergologie
Fakultní nemocnice u sv. Anny a Lékařská fakulta MU
www.bosterbio.com
www.lsbio.com
IMUNOANALÝZA, IMUNOASSAY (IA)
Rozdělení IA podle druhu značky:
EIA - enzymová
RIA - radioaktivní
LIA - luminiscenční
FIA - fluorescenční
Rozdělení IA podle uspořádání:
 vizualizace sekundární fáze reakce antigen x protilátka pomocí značky
KOMPETITIVNÍ
NEKOMPETITIVNÍ
HOMOGENNÍ
HETEROGENNÍ
https://en.wikipedia.org/wiki/Immunoassay
Kompetitivní IA
- v reakci je omezené množství detekční protilátky a známé množství
značeného ligandu (antigenu)
- přidá se vzorek s neznámým obsahem neznačeného ligandu
- oba typy ligandu soutěží o vazebná místa detekční protilátky
- síla signálu je nepřímo úměrná koncentraci neznačeného ligandu - čím víc
se naváže neznačeného ligandu, tím méně značeného
Nekompetitvní IA
- detekční protilátka je v nadbytku
- všechen stanovovaný antigen je vyvázán
a následně označen druhou protilátkou,
která nese značku
- síla signálu je přímo úměrná
koncentraci antigenu v testovaném vzorku
http://imunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/imunoreakce.pdf
Homogenní IA
- není potřeba oddělovat navázané a nenávázané složky reakce
- jen kompetitivní uspořádání
- méně citlivé než heterogenní
Heterogenní IA
- nutnost separace navázaných a volných reaktantů (analyt,
detekční protilátka) – po přidání reaktantu a inkubaci následuje
krok promytí
- může být kompetitivní i nekompetitivní
ELISA
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
- heterogenní IA
- vysoká citlivost - umožňuje stanovit analyt v množství 10-9 až 10-12 g
- jedna z reakčních složek (Ag nebo Ab) je navázána na pevnou fázi
(stěnu mikrotitrační destičky)
- detekce založena na enzymatické přeměně bezbarvého substrátu
na barevný produkt
- čím ↑ intenzita zbarvení (absorbance, optická denzita),
tím ↑ koncentrace zjišťovaného analytu ve vzorku
- měří se pomocí spektrofotometru
Často používané enzymy a chromogenní substráty:
alkalická fosfatáza (alkaline phosphatase)
p-nitrofenylfosfát  p-nitrofenol (absorbance 405nm)
křenová peroxidáza (horseradish peroxidase)
tetramethylbenzidin  tetramethylbenzidindiimin (absorbance 450nm)
ELISA
Mnoho možných uspořádání:
přímá
nekompetitivní
nepřímá
přímá
kompetitivní
nepřímá
kvantitativní – kalibrační křivka, výsledkem je koncentrace
semikvantitativní - absorbance vzorku / absorbance kalibrátoru
- výsledkem je index pozitivity (IP)
detekce
protilátky
detekce
antigenu
(sendvičové
uspořádání)
http://www.bosterbio.com/protocol-and-troubleshooting/elisa-principle
www.mabtech.com
ELISA
Přímá kompetitivní ELISA
Nepřímá kompetitivní ELISA
old.vscht.cz/anl/oppa-sem-bio/PDFs
ELISA
 v klinické imunologii se nejčastěji používá nekompetitivní uspořádání
Příklad – stanovení koncentrace protilátky:
http://virus.usal.es/web/demo_microali/enterotoxina/set.html
1. Potažení jamek
antigenem („kautování“)
2. Přidání vzorku séra,
navázání stanovované
protilátky (analyt)
3. Promytí
4. Přídání enzymem
značené protilátky
(konjugát) specifické
např. k lidskému IgG
5. Promytí
6. Přidání substrátu
7. Odečtení barevné
reakce
ELISA
Systém avidin – biotin (zesilující efekt)
Avidin je glykoprotein (MW 66-69 kDa), který má vysokou afinitu k malé
molekule vitaminu biotinu (MW 0,24 kDa). Na jednu molekulu protilátky může
být navázáno mnoho molekul biotinu. Biotinylovaná protilátka potom může
vázat několik molekul avidinu. Podobné vlastnosti jako avidin má také
streptavidin (MW 53 kDa) izolovaný z bakterie Streptomyces avidinii.
www.lsbio.com
Využití metod ELISA v klinické imunologii
• Stanovení protilátek i antigenů
• vyšetření komplementu, včetně funkčních testů
• vyšetření imunokoplexů
Autoprotilátky
ANA – proti jaderným antigenům (DNA, nukleozómy, histony)
ENA – proti extrahovatelným jaderným antigenům
(SS-A, SS-B, Scl-70, Sm/RNP, Jo1)
AMA – proti mitochondriím (primární biliární cirhóza)
ASMA, LKM, LC (autoimunitní hepatitidy)
ANCA - proti cytoplazmě neutrofilů – anti-MPO, anti-PR3 (vaskulitidy)
anti-TTG – tkáňová transglutamináza (celiakie)
anti-TG - tyreoglobulin, anti-TPO – tyroidální peroxidáza (tyreoiditidy)
antiGAD, IA-2 (diabetes 1. typu)
RF(anti IgG), anti-CCP - revmatoidní artritida:
AFL – proti fosfolipidům, ACLA, B2GP (fosfolipidový syndrom)
AIGA (anti IgA)
Využití metod ELISA v klinické imunologii
Protilátky proti patogenům
Rozsáhlé uplatnění v infekční serologii
např: protilátky proti tetanickému toxoidu,
anti-PCP (pneumokokový kapsulární polysacharid)
(titr Ab stoupá po očkování, uplatnění v diagnostice imunodeficitů)
ASLO – anti-streptolysin O (streptokokové infekce)
Další protilátky:
ASCA – anti-Saccharomyces cerevisiae (Crohnova nemoc)
GLIA – deamidovaný gliadin (celiakie)
proti proteinům kravského mléko
Jiné:
imunokomplexy obsahující C1q
MBL (manózu vázající lektin)
RIA (Radio Immuno Assay)
- oddělení nukleární medicíny
- práce s radioaktivním materiálem vyžaduje přísnější pravidla
bezpečnosti práce
- detekce reakce Ag-Ab pomocí radioaktivního izotopu jako značky
navázané na jednu ze složek reakce , nejčastěji 125I
- měří se intenzita radioaktivního zářiče – není třeba přidávat substrát
- vyšetřování hladin různých hormonů a jejich metabolitů, vitamínů a
jejich metabolitů, specifického IgE, některých autoprotilátek – např.
vyšetření Ab proti acetylcholinovému rec. při myastenia gravis
FIA (Fluorescence IA)
– jako značka se používá molekula fluorochromu
– detekce signálu se provádí fluorimetricky
LIA (CLIA – ChemiLuminiscence IA)
– excitace elektronů a emise fotonů jako následek chemické
reakce
– značka – chemiluminofor:
luminol, izoluminol (aktivace přidáním H2O2),
luciferáza-luciferin
– citlivost je vyšší než u RIA