Imunofixace
ELFO sérových proteinů
- lze zachytit pouze hrubé změny:
hyper- nebo hypogamaglobulinémie,
případně paraproteinémie
Elektroforéza sérových proteinů
• Vzorek séra se nanese na agarózový gel
• Proteiny se rozdělí na jednotlivé zóny podle velikosti a náboje
• Může odhalit přítomnost paraproteinu, ale neurčí jeho typ
PARAPROTEIN
Obrázek převzat z http://www.sebia-usa.com/products/reagents.html (únor 2007)
Elektroforéza sérových proteinů
Imunofixace
- Metodou imunofixace lze identifikovat
PARAPROTEIN v séru, moči a likvoru
paraprotein = monoklonální imunoglobulin
(monoklonální gamaglobulin)
- je produkován 1 klonem B-lymfocytů
- může sestávat z těžkého řetězce IgG/A/M (vzácně i D a E)
a lehkého řetězce kappa / lambda
- stav, kdy má pacient v séru paraprotein se nazývá
paraproteinémie nebo monoklonální gamapatie
Imunofixace
• Paraprotein se vyskytuje např. u mnohočetného myelomu
a jiných hematoonkologických onemocnění
• 75 – 80% nemocných mnohočetným myelomem má v
moči přítomny monoklonální lehké řetězce (BenceJonesova
bílkovina). BJB poškozuje buňky proximálních
tubulů ledvin.
• U některých lidí je v séru přítomen paraprotein, aniž by
měli příznaky onemocnění, u některých z nich se nemoc
později rozvine
MGUS = monoklonální gamapatie neznámého významu
(monoclonal gammopathy of unknown significance)
Imunofixace - princip
• dvoustupňová metoda
• první fáze: směs bílkovin se rozdělí podle
elektroforetické pohyblivosti
• druhá fáze: identifikace typu bílkoviny pomocí
specifických protilátek - imunoprecipitace, barvení
• Imunofixace je pouze kvalitativní metoda
• kvantitu paraproteinu lze určit z ELFO sérových proteinů
podle intenzity zabarvení proužku
Imunofixace - postup
1. V gelu se zhotoví obvykle 6 startů, do nichž se
aplikuje vzorek téhož pacienta
2. Po skončení elektroforézy se na povrch gelu přiloží
šablona s vyříznutými okénky v místě
elektroforetických drah
3. První dráha je klasická ELFO sérových proteinů,
aplikuje se fixační roztok
4. Do ostatních drah se nanášejí specifické protilátky
proti těžkým řetězcům IgG, IgA, IgM a proti lehkým
řetězcům κ nebo λ
Imunofixace - postup
5. Protilátky difundují do gelu a v místě, kde reagují
s příslušným antigenem vytvářejí imunokomplexy
ve formě precipitátu
6. Promytím vhodným pufrem se odstraní jak
antigeny nereagující s aplikovanou protilátkou,
tak i nadbytek protilátky.
7. Po promytí v gelu zůstanou pouze nerozpuštěné
imunokomplexy, vytvářející ohraničný pruh, který
se zvýrazňuje obarvením
Imunofixace
Imunofixace
Imunofixace
Imunofixace
Imunofixace
Imunofixace
Imunofixace
Imunofixace
Pozn. 75 – 80% nemocných mnohočetným myelomem má v moči přítomny
monoklonální lehké řetězce (Bence-Jonesova bílkovina/paraprotein). BJB
poškozuje buňky proximálních tubulů ledvin.
MGUS monoklonální gamapatie nejasného původu
Imunofixace