KOMPLEMENTOVÝ SYSTÉM KOMPLEMENT • humorální složka vrozené imunity • evolučně „starobylý“ systém – primitivní živočichové disponují podobnými proteiny • komplementový systém je tvořen desítkami složek (přítomny v séru nebo vázány na povrchu buněk) • kaskáda po sobě následujících kroků spojená s proteolytickým štěpením jednotlivých složek • amplifikace původního signálu Aktivace komplementu membranolytický komplex (MAC) klasická cesta patogen + Ig / CRP C1q,r,s lektinová cesta patogen + MBL MASP 1, 2 alternativní cesta patogen + C3b C3 konvertáza = C2a+C4b / C3b+Bb C3 C3b C5 C5b C5b C6, C7, C8 poly C9 C2, C4 C2, C4 C5 konvertáza = C2a+C4b+C3b / C3b+Bb+C3b KOMPLEMENT - funkce • Lýza buněk, mikroorganismů (MAC) • Opsonizace – označení cizích buněk a částic, podpora fagocytózy (C3b) • Chemotaxe – přivolání dalších složek imun. sys. (C3a, C5a) • Propagace imunitní reakce - prozánětlivá aktivita (C3a, C5a) • Immune clearance – odstraňování imunokomplexů z cirkulace (C3b, C4b) Regulace komplementové kaskády Regulátory • Pozitivní: properdin (faktor P) • Negativní (inhibitory): C1 INH, CR1, MCP, DAF, faktor H, faktor I, CD59, C4bp Deficity komplementového systému • C1-C4 – deficit způsobuje častější výskyt pneumonií, pyogenních infekcí, častý vývoj systémových imunokoplexových chorob (SLE-like) • C3-C9 - zejména náchylnost k pyogenním infekcím; u deficitu C9 jsou typické opakované meningokové meningitidy • C1 INH - hereditární angioedém Hereditární angioedém (HAE) • způsoben deficitem inhibitoru C1 INH – inhibuje serinové proteázy C1r a C1s • dochází k nekontrolované aktivaci komplementového systému při traumatech, stomatologických výkonech, infekcích, menstruaci • vazoaktivní peptidy (bradykinin aj.) způsobují zvýšenou cévní permeabilitu se vznikem edému • klinické příznaky: nesvědivé kožní otoky, dechové obtíže, průjmy, křeče v břiše • lab. obraz: většinou snížená hladina nebo funkce C1 INH, někdy snížené hladiny C2, C4 • několik typů • dominantní dědičnost - mutace v genu pro C1INH Vyšetření komplementu INDIKACE: • podezření na deficit některé ze složek - vyšetří se funkce celého systému, v případě defektu se testují hladiny jednotlivých složek • podezření na hereditární angioedém - vyšetří se hladina a funkce C1 INH a hladiny jednotlivých složek • monitorování zánětlivého procesu - složky komplementu se chovají jako proteiny akutní fáze, jejich hladina vzrůstá při zánětu • diagnostika a monitorování imunokomplexových chorob - při silné aktivaci komplementu dochází ke spotřebě složek a poklesu jejich hladin v séru Vyšetření komplementu LAB. METODY: • funkční vyšetření celého systému (jednotlivých aktivačních cest)  založeno na hemolytické funkci komplementu (CH50, AH50)  nebo detekci konečných složek kaskády (MAC) pomocí specifických protilátek (ELISA) • funkční vyšetření C1 INH  ELISA • stanovení koncentrace jednotlivých složek  nefelometrie, turbidimetrie, radiální imunodifůze, ELISA Test CH50 • funkční test klasické cesty aktivace komplementu • sérum se zmrazí co nejdříve po odběru, rozmrazí těsně před vyšetřením – složky komplementu jsou termolabilní • princip testu: beraní erytrocyty + amboceptor (antierytrocytární protilátky) + sérum pacienta  amboceptorem označené erytrocyty jsou cílem pro komplement obsažený v séru  hemolýza  měření absorbance hemoglobinu spektrofotometricky • tímto testem se ověří funkčnost kaskády jako celku • pro vyšetření hladiny a funkce jednotlivých složek se provádí jiné testy Jednotka CH50 aktivita komplementu je vyjádřena v jednotkách CH50  množství komplementu v 1ml séra, které za standardních podmínek způsobí 50% lýzu definované suspenze beraních erytrocytů CH50 Technical Bulletin, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. beraní erytrocyt složky komplementu králičí protilátky (amboceptor) C1 C4bC2b C4bC2aC3b C5b MAC-lytický komplex lýza & uvolnění hemoglobinu měření absorbance centrifugace, přepipetování Schéma testu CH50 fyz.roz. fyz.roz. fyz.roz. fyz.roz. fyz.roz. 1) 2) sérum 1:40 sérum 1:60 sérum 1:40 odstranit 100ul odstranit 100ul promíchání a přenos 100ul promíchání a přenos 100ul promíchání a přenos 100ul A B C D E F G H1 1:160 1:320 1:60 1:40 1:120 1:240 1:80 sérum 1:60 H2fyz.roz. x H O2100ul lýza 0% lýza 100% 3) 100ul hemol.sys. 100ul hemol.sys. 100ul hemol.sys. 100ul hemol.sys. 100ul hemol.sys. 100ul hemol.sys. 100ul hemol.sys. 100ul hemol.sys.