Precipitace,
radioimunodifúze (RID),
nefelometrie, turbidimetrie
RNDr. Jana Nechvátalová, Ph.D.
Ústav klinické imunologie a alergologie
FN u sv. Anny v Brně
• primární fáze – rychlá; vznik vazby jednotlivých
epitopů s vazebnými místy protilátek; není
patrná okem
• sekundární fáze – vznik prostorového komplexu;
uplatňuje se multivalence Ag a polyvalence Ab
(IgM-pentamer=10 vazeb.míst, ovšem reálně je
k dispozici 5-6); patrné okem nebo koloidní
roztok → analyzátory
Reakce Ag - Ab
Klasické serologické reakce
AglutinaceAglutinace –– reakce mezi korpuskulárním Ag a Ab s následnoureakce mezi korpuskulárním Ag a Ab s následnou
aglutinací částic; proběhne 1.+ 2.fáze interakce Ag a Abaglutinací částic; proběhne 1.+ 2.fáze interakce Ag a Ab
PrecipitacePrecipitace –– reakce mezi solubilním Ag (nízkomolekulární) areakce mezi solubilním Ag (nízkomolekulární) a
Ab s následným vznikem precipitátuAb s následným vznikem precipitátu
proběhne 1.+ 2.fáze interakce Ag a Abproběhne 1.+ 2.fáze interakce Ag a Ab
ImunoesejeImunoeseje –– reakce mezi Ag a Ab vizualizována enzymem,reakce mezi Ag a Ab vizualizována enzymem,
fluorochromem n. radioaktivním zářičem (EIA, RIA n. FIA) ; většinoufluorochromem n. radioaktivním zářičem (EIA, RIA n. FIA) ; většinou
proběhne jen 1. fáze inter. Ag a Abproběhne jen 1. fáze inter. Ag a Ab
Metodiky využívající efektorového účinku Ab:Metodiky využívající efektorového účinku Ab:
Metodiky sMetodiky s aktivací komplementového systémuaktivací komplementového systému komplexemkomplexem
AgAg –– Ab, např. komplementAb, např. komplement--fixační reakce (KFR)fixační reakce (KFR)
Metodiky sMetodiky s inhibicí biologických účinkůinhibicí biologických účinků některých Ag, např.některých Ag, např.
neutralizační test, hemaglutinačně inhibiční test (HIT)neutralizační test, hemaglutinačně inhibiční test (HIT)
Aglutinace x precipitace
• Aglutinace
Ag + Ab Ag-Ab
aglutinogen aglutinin aglutinát
makromolekulární
korpuskulární
nerozpustný
Protilátky namířené proti epitopům antigenních částic vytváří mezi
korpuskulemi můstky, které vedou ke vzniku shluků – aglutinátů.
jako Ag slouží např. těla bakterií
• Precipitace
Ag + Ab Ag-Ab
precipitinogen precipitin precipitát
nízkomolekulární
nekorpuskulární
rozpustný
Reakce mezi solubilním antigenem a protilátkou s následným vznikem
precipitátu (hydrofobní vazby – nerozpustný komplex).
Precipitace
v tekutém prostředí
- využívá se efekt, že při reakci Ag-Ab vzniká zákal
– precipitát, jehož intenzita je při konstantním
množství přidané protilátky úměrná přidané
koncentraci vyšetřovaného antigenu
- měření intenzity zákalu – nefelometrie,
turbidimetrie
- obě metodiky umožňují kvantitativní stanovení
obsahu proteinů ve vzorku odečtem z kalibrační
křivky
Nefelometrie a turbidimetrie
• reakce založené na měření množství imunitních
komplexů vytvořených interakcí specifických
protilátek s antigenem
• stanovení sérových bílkovin
• měření probíhá v tekutém prostředí v měřící
kyvetě (pufr, látka urychlující reakci, Ag, Ab)
• množství vytvořených komplexů je p.ú.konc. Ag
Nefelometrie
-hodí se pro nižší koncentrace
Turbidimetrie
- hodí se pro koncentrovanější roztoky
viditelné světlo
viditelné světlo
detektor je ve směru
kolmém na vstupující
paprsek
měří množství světla
rozptýleného při průchodu
paprsku
(množství světla odraženého od
vznikajících komplexů)
detektor je v
ose paprsku
měří množství
procházejícího světla
(úbytek intenzity světla,
které prošlo roztokem v
kyvetě)
Precipitace v tekutém prostředí:
nefelometrie je 5-10x citlivější
a nákladnější než turbidimetrie
Precipitace
v gelu
- agaróza, agar umožňují detekci precipitačních linií
- je založena na pasivní difuzi látek v prostředí koncentračního gradientu
- Ag i Ab difundují v prostředí gelu a v místě, kde konc. Ag i Ab dosáhnou
optimílního (ekvimolárního) poměru vzniká precipitát
Dynamika tvorby imunokomplexů
Malé rozpustné imunokomplexy Malé rozpustné imunokomplexy
Velké nerozpustné
imunokomplexy
Radiální imunodifuze
• pomocí RID je možno stanovit koncentrace
mnohých bílkovinných součástí séra
• metodika se dříve používala při měření hladin
celkového IgG, IgA, IgM, složek komplementu
nebo různých proteinů akutní fáze - většina těchto
vyšetření je však v dnešní době automatizována a
provádí se na principu nefelometrie
• v naší laboratoři metodou RID ale stále měříme
koncentrace C2, C5 složek komplementu
Podle počtu difundujících
reaktantů:
• jednoduchá radiální
imunodifúze
- koncetrační gradient jednoho z reaktantů
(většinou Ag)
- druhý reaktant (většinou Ab) - rovnoměrně
rozptýlen ve struktuře gelu
- výsledkem jsou ostře ohraničené kroužky
precipitátu
- plocha prstence - úměrná konc.
vyšetřovaného Ag
- podle konc. standardu – kalibr. křivka
Kalibrační křivkaKalibrační křivka ––
charakterizuje vztah mezicharakterizuje vztah mezi
koncentrací vyšetřované látkykoncentrací vyšetřované látky
a např. průměrem kruhů naa např. průměrem kruhů na
příslušné vyšetřovací descepříslušné vyšetřovací desce
• dvojitá radiální imunodifúze
(podle Ouchterlonyho)
- sledujeme antigenní příbuznost antigenů
- gradient vytváří jak Ag, tak Ab a dochází
k protisměrné difúzi obou reaktantů
(radiálně)
- v zóně ekvivalence – precipitační linie,
která ukazuje na pozitivitu reakce
- hodnocení - kvalitativní
Komplementfixační reakce (KFR)
• imunologická metoda patřící mezi základní serologické metody, jež
fungují na principu reakce protilátky s antigenem, využívá
schopnosti komplementu vázat se na komplex antigenu s protilátkou
• využívá se např. k průkazu protilátek proti původcům
respiračních infekcí a řady virových onemocnění ; zjištění
ochranných protilátek po očkování
• lze použit k identifikaci jak specifických protilátek tak antigenu
• reakce se hodnotí v několika ředěních séra, jako výsledek se udává
nejvyšší ředění séra (titr), při kterém ještě nedošlo k hemolýze
Další serologické reakce
ovčí erytrocyty
+
králičí protilátky proti ovčím ery
(=amboceptor)
http://www.virion-serion.de/uploads/mit_download/CFT-V9-CZ.pdf
morčecí komplement
inaktivovat pacientův vlastní
komplement!
56 C, 30minut
Neutralizační reakce
obsahuje-li testované sérum protilátky
proti tomuto viru, dojde k vazbě
protilátek na receptory viru a jeho
inaktivaci
neobsahuje-li sérum protilátky
virus zůstane aktivní
testované sérum se smíchá s kulturou konkrétního viru a nechá se inkubovat
inkubovaným roztokem se poté naočkuje buněčná kultura
inaktivovaný virus není schopen
napadnout buňky a nedojde k vytvoření
cytopatického efektu
na buněčné kultuře je pod
mikroskopem patrný cytopatický
efekt
metoda se obvykle provádí v několika ředěních séra, jako výsledek se udává nejvyšší ředění
séra (tzv. titr, tradičně ve formě 1:xxx) při kterém ještě nedošlo k cytopatickému efektu či
onemocnění (uhynutí) zvířete