Izolácie buniek a funkčné testy lymfocytov Izolácia PBMC PBMC = Peripheral Blood Mononuclear Cells = lymfocyty+monocyty • Izolácia PBMC pomocou gradientovej centrifugácie Krv sa navrství na separačné médium Pri centrifugácii sa oddelia jednotlivé vrstvy na základe odlišnej vznášivej hustoty – hore je plazma, medzi plazmou a médiom je vrstva PBMC, na dno klesnú erytrocyty a granulocyty Izolácia PBMC • Odoberie sa plazma • Naberie sa vrstva PBMC pozorovateľná ako biely prstenec na rozhraní plazmy a média • PBMC sa premyje v PBS (opakované stočenie, odliatie supernatantu, rozsuspendovanie peletu v PBS) • Získavame koncentrovanú suspenziu mononukleárov Ďalšie typy izolácií buniek • IMUNOMAGNETICKÁ SELEKCIA – Využíva magnetické guličky s naviazanou monoklonálnou protilátkou proti určitému CD znaku hľadaného typu buniek – Bunky sa naviažu na tieto guličky a sú silným magnetom prichytené k stene skúmavky, ostatné bunky sa odmyjú (pozitívna selekcia) – Postup je možné využiť aj obrátene – zbaviť sa určitého typu buniek a získať všetky ostatné (negatívna selekcia) • FACS CELL SORTER- modifikácie prietokového cytometra Funkčné testy lymfocytov • test PROLIFERÁCIE lymfocytov – sleduje sa schopnosť delenia lymfocytov po stimulácii Definícia: nárast počtu buniek ako výsledok bunečného rastu a bunečného delenia • bujnenie, novo-tvorenie, rast • lat. prolifero prinášať potomstvo: proles deti; fero niesť • dve významné úlohy (role) – embryonálny vývoj – dospelé telo (napr. krvotvorba, obnova tkanív) • typy: symetricky, asymetricky, diferenciačné delenie Kedy indikovať test proliferácie??? • podozrenie na SCID • vývoj ochorenia – zástava proliferácie? • odpoveď na liečbu (farmaceutika) SCID Severe Combined Imunodeficiency • skupina ochorení, ktoré vykazujú poruchu vo vývoji lymfoidnej rady – niekedy iba porucha vývoja T-lymf., niekedy kombinácia s B-lymf. a s NK bunkami (záleží na genetickej poruche) • klinické prejavy - thymus se nevyvíja normálne (úplne/redukcia), veľmi nízke počty cirkulujúcich lymfocytov (lymfopénia) a T-lymfocytov • lymfocyty nereagujú na stimuláciu mitogénmi – tzn. nemôžu proliferovať v odpovedi na antigeny (myeloidná a erytroidná rada je v počtoch a funkcii neovplyvnená) SCID • existuje asi 7 variant, ktoré sú AR, jedna X viazaná • väčšinou ide o defekt v gama reťazci IL-2R (X-viazaná forma), tento reťazec je aj súčasťou receptorov IL-4, -7, -9, 15 Syndrom T-bb B-bb NK-bb Dědičnost Retikulární dysgeneze - - - AR ADA deficit - - - AR RAG 1,2 deficit - - + AR CgC deficit - + - XL JAK3 deficit - + - AR IL-7Ra deficit - + + AR Omennův syndrom + - + AR ZAP-70 deficit CD4+ + + AR SCID • Predĺženie života vyhnutím sa kontaktu s potenciálne nebezpečnými patogénmi – musia žiť v sterilním prostředí!!! • Musia sa vyhýbať kontaktu s ľuďmi a nefiltrovaným vzduchom, všetkým s čím prídu tieto deti do styku – vrátane jedla! Metódy • Proliferačný set DELFIA (BrDU) • Detekcia proteínu Ki-67 Metódy • Detekcia novo syntetizovanej DNA pomocou thymidínu značeného radioaktívne (tríciom)meranie na beta-counteru • Cytometrická detekcia pomocou fluorescenčného farbiva CFSE (karboxyfluoresceinsukcinimidylester), ktoré sa viaže nešpecificky na rôzne štruktúry v bunkách, sleduje sa nárast fluorescencie po delení buniek Príprava vzorky • cca 2,5 hod Stimulancia • rastlinné - PHA (phytohaemagglutinin), ConA (Concanavalin A) • monoklonálne protilátky proti receptorom a koreceptorom (antiCD3,+ anti-CD28) • bakteriálne antigény – tetanický toxoid Kultivácia lymfocytov in vitro • Pestovanie prebieha v definovanom bazálnom médiu – obsahuje cukry, AMK, vitamíny, stopové prvky atd. (+ ATB – penicilín, streptomycín) pri 37°C, 5% CO2, 95% vlhkosť • Normálne bunky majú obmedzenú dĺžku života- obmedzený počet delení • Pomocou karcinogénnych látok alebo vírov (SV40, EBV)môžeme dosiahnuť transformáciu buniek na nesmrteľné a vytvoriť tzv. bunkové línie Jurkat- ľudské leukemické bunky produkúce IL-2 HL-60- ľudské bunky odvodené od myeloidných leukemických buniek • Cesta, ktorou bolo objavených mnoho funkcií cytokínov a rast.faktorov DELFIA (PerkinElmer) • BrDU- BromoDeoxyUridin – analóg Tymidínu • Eu- Európium • Detekcia novo syntetizovanej DNA pomocou BrDU, začlení sa do novo vznikajúcej DNA, BrdU je potom detekované pomocou protilátky anti-BrdU značenej Eu • jednotlivé stimulancia v tripletoch Výsledok DELFIA Cytometrické stanovenie • Ki-67 - jadrový proteín • asociovaný (možno nevyhnutný) s bunečnou proliferáciou a s transkripciou rRNA • interfáza- bunečné jadro • mitóza- povrch chromozómov • prítomnosť G1, S, G2, mitóza • absencia G0 HeLa cells Ki-67 proteín (červená) tubulín (zelená) DNA (modrá) Spracovanie • značenie L/D- 30 min • extracelulárne značenie (CD25 PerCP Cy5.5, CD8 APC A750)- 30 min – CD25- súčasť receptoru pre IL-2 (α reťazec) • fixácia (paraformaldehyd)- 60 min • permeabilizácia (metanol?) + intracelulárne značenie (CD3 APC, Ki-67 PE)- 30 min Pacient 1- ↓ expresia Ki-67 ELISPOT • patrí medzi funkčné testy lymfocytov • slúži k sledovaniu produkcie špecifických protilátok Blymfocytmi alebo produkcie cytokínov T- a B-lymfocytmi ELISPOT 5 x 105 2,5 x 105 1,25 x 105 0,63 x 105 7 dní po očkovaní