IMUNOFLUORESCENCE
Mgr. Petr Bejdák
Ústav klinické imunologie a alergologie
Fakultní nemocnice u sv. Anny a Lékařská fakulta MU
IMUNOFLUORESCENCE
Luminiscence
jev, při kterém látka emituje záření po absorpci excitačního záření
(fotoluminiscence) nebo při chemické reakci (chemiluminiscence)
fluorescence
emise záření krátce po excitaci (10-8 až 10-5 s)
Fotoluminiscence
fosforescence
emise záření trvá delší dobu (10-2 s až dny)
IMUNOFLUORESCENCE
Fluorescence
látka po absorpci excitačního záření uvolňuje emisní záření o delší
vlnové délce (nižší energii)
excitovaný stav
základní stav
Emise
Absorpce
Vnitřní
konverze
IMUNOFLUORESCENCE
Fluorescenční mikroskop
Zdroj světla – rtuťová výbojka, LED dioda
Excitační filtr - propouští pouze část spektra potřebnou pro excitaci
fluorescence a zabraňuje průchodu záření v oblasti emisní vlnové
délky, které by vytvářelo pozadí
Emisní (bariérový) filtr - propouští pouze emisní část spektra a
zabraňuje průchodu excitačního záření
IMUNOFLUORESCENCE
Schéma fluorescenčního mikroskopu
IMUNOFLUORESCENCE
Konjugát
- protilátka s navázaných fluorescenčním
barvivem (fluorochromem)
- nejčastěji používaný flourochrom je FITC
(fluoresceinizothiokyanát) excitační/emisní
vlnová délka 495/520 nm
(emituje zelené světlo)
- konjugát se specificky váže jen na
imunoglobuliny určité izotypové třídy
(IgG / IgM / IgA) – výběrem konjugátu
stanovíme protilátky jen této třídy
- pro některá autoimunitní onemocnění
má klinický význam výskyt autoprotilátek
v určité izotypové třídě (př. celiakie - IgA)
IMUNOFLUORESCENCE
Přímá IF
slouží k detekci antigenů - vazba konjugátu přímo na antigen
Využití: histologie – průkaz antigenu ve tkáních
mikrobiologie – rychlá detekce patogenů v biologickém materiálu
Nepřímá IF
používá se k detekci protilátek, vazba protilátek a konjugátu ve 2 krocích:
1. na sklíčko se nanese vyšetřovaný materiál (sérum), pokud jsou v něm
přítomny hledané protilátky, navážou se na antigenní substrát na sklíčku
2. nanese se konjugát, který se váže na protilátku příslušné izotypové
třídy (IgG/IgM/IgA)
Využití: průkaz specifických protilátek, nejčastěji autoprotilátek
IMUNOFLUORESCENCE
PŘÍMÁ NEPŘÍMÁ
IMUNOFLUORESCENCE
Antigenní substráty používané při nepřímé IF
Buňky HEp2 (Human Epithelial) – k detekci ANA
- odvozeny od linie HeLa (karcinom děložního čípku)
- rychle se dělící buňky, v mitóze pozorovatelná chromatinová
destička - důležitý znak pro odlišení jednotlivých typů ANA
Neutrofilní granulocyty – k detekci ANCA
Crithidia luciliae – prvok,
detekce protilátek proti dsDNA
Opičí jícen – detekce EMA
LKS (liver, kidney, stomach)
– kombinace 3 potkaních tkání
k detekci AMA, ASMA, GPC, RET...
IMUNOFLUORESCENCE
ANA (anti-nuclear antibodies)
- velká skupina autoprotilátek
- vážou se na různé antigeny v jádře (DNA, RNA, centromery...)
- výskyt při různých autoimunitních onemocněních (systémový
lupus erytematodes, Sjongrenův syndrom, revmatoidní artritida...)
- flourescenční obraz v mikroskopu může vypadat stejně nebo
podobně u různých autoprotilátek – když vidíme určitý obraz,
nevíme ještě o jakou autoprotilátku jde (na jaký antigen se váže), k
jejímu bližšímu určení mohou pomoci jiné metody (ELISA,
imunoblot)
IMUNOFLUORESCENCE
ANA – typ homogenní
IMUNOFLUORESCENCE
ANA - typ granulární (zrnitý)
IMUNOFLUORESCENCE
ANA - typ nukleolární (jadérkový)
IMUNOFLUORESCENCE
ANA - typ centromerový
IMUNOFLUORESCENCE
V cytoplazmě HEp2 buněk je možné pozorovat další typy
fluorescence – např. mitochondriální – AMA (anti-mitochondrial
antibodies) – výskyt u onemocnění primární biliární cirhóza
IMUNOFLUORESCENCE
ANCA (protilátky proti cytoplazmě neutrofilů)
- pANCA – perinukleární - antigenem je MPO (myeloperoxidáza)
- cANCA – cytoplazmatická - antigenem je PR3 (proteináza 3) – typická
pro onemocnění (Wegenerova) granulomatóza s polyangiitidou
-atypická ANCA - různé antigeny (elastáza, lysozym, katepsin...)
pANCA cANCA
IMUNOFLUORESCENCE
Prvok Crithidia luciliae - dsDNA
IMUNOFLUORESCENCE
EMA (protilátky proti endomysiu) – na řezu opičího jícnu
antigenem je TTG (tkáňová transglutamináza) – také ELISA detekce
- výskyt těchto
protilátek u celiakie
(hlavně ve třídě IgA)
IMUNOFLUORESCENCE
Substrát LKS – kombinace 3 potkaních tkání:
- játra (liver)
- ledviny (kidney)
- žaludek (stomach)
Lze pozorovat protilátky:
- AMA (antimitochondriální) – primární biliární cirhóza
- ASMA (proti hladkému svalu) – autoimunitní hepatitidy
- GPC (proti parietálním buňkám žaludku) – prim. perniciózní anémie
- RET (proti retikulinu)
aj.
IMUNOFLUORESCENCE
AMA – potkaní žaludek, ledviny, játra
IMUNOFLUORESCENCE
ASMA – potkaní žaludek
IMUNOFLUORESCENCE
GPC - potkaní žaludek
IMUNOFLUORESCENCE
RET – potkaní žaludek, ledviny, játra