1 3 PRINCIPY LABORATORNÍCH STANOVENÍ 3.1 Stanovení pomocí kinetické metody a konstantního času 3.1.1 Stanovení katalytických koncentrací aminotransferáz v séru Kinetická metoda: kontinuálním měřením absorbance v závislosti na čase opakovaným zaznamenáváním změn absorbance ve stejných časových intervalech. Měříme buď přírůstek nebo úbytek substrátu nebo koenzymu, případně jiného reaktantu. Jestliže stanovujeme koncentraci koenzymu typu NAD+, NADP+ nazýváme tento způsob měření optický test. Důležitý je také časový interval, ve kterém měříme. Většinou neměříme ihned na začátku enzymové reakce, neboť rychlost nebývá ještě konstantní, tuto fázi nazýváme lag-fáze. Měříme až v čase, kdy je rychlost reakce konstantní, tj. nezávisí na koncentraci reagujících látek. Tuto fázi reakce kontrolujeme. Automatické analyzátory mají tyto časy definovány v parametrech metod. Stejně tak i kontrolu vyčerpání substrátu. Aminotransferázy jsou enzymy, které katalyzují transaminaci (přenos aminoskupiny z aminokyseliny na 2-oxokyselinu). Z klinicko-biochemického hlediska jsou nejvýznamnější alaninaminotransferáza (ALT) a aspartátaminotransferáza (AST). Alaninaminotransferáza (ALT … L-alanin:2-oxoglutarát-aminotransferáza) katalyzuje reakci: L-alanin + 2-oxoglutarát ↔ pyruvát + L-glutamát Aspartátaminotransferáza (ASP … L-aspartát:2-oxoglutarát-aminotransferáza) katalyzuje reakci: L-aspartát + 2-oxoglutarát ↔ oxalacetát + L-glutamát Princip: Stanovení aktivity ALT je založeno na měření rychlosti tvorby pyruvátu vznikajícího v reakci katalyzované alaninaminotransferázou z alaninu. Tato rychlost se určí s využitím spřažené enzymové reakce katalyzované laktátdehydrogenázou, v níž je pyruvát redukován na laktát: pyruvát + NADH + H+ ↔ L-laktát + NAD+ Stanovení aktivity AST je analogické stanovení ALT. Vznikající oxalacetát v reakci katalyzované AST je ve spřažené reakci katalyzované malátdehydrogenázou redukován na malát: oxalacetát + NADH + H+ ↔ L-malát + NAD+ 2 Úbytek NADH se projeví poklesem absorbance reakční směsi při 340 nm (A340). Za předpokladu dostatečně vysoké aktivity laktátdehydrogenázy, resp. malátdehydrogenázy v reakční směsi, rychlost poklesu A340 je úměrná aktivitě stanovovaných enzymů (ALT, resp. AST). Stanovení je příkladem kinetické metody měření katalytické aktivity – během prvních minut reakce se zaznamenává (počáteční) rychlost úbytku substrátu nebo rychlost tvorby reakčního produktu (v našem uspořádání pomocí optického testu, tzn. měření rychlosti úbytku NADH). Materiál: Set ALT firmy Roche Diagnostics*: ALT-činidlo (Tris pufr 110 mmol/l, pH 7,3; L-alanin 550 mmol/l; LDH ≥ 21,7 µkat/l; NADH 0,198 mmol/l; 2-oxoglutarát 16,5 mmol/l). Set AST firmy Roche Diagnostics*: AST-činidlo (80 mmol/l Tris-pufr pH 7,8, L-aspartát 240 mmol/l, malátdehydrogenáza min. 7,67 kat/l, NADH 0,198 mmol/l, 2-oxoglutarát disodný 13,2 mmol/l). Vzorek krevního séra; mikropipetor 0,1 ml a 1 ml; spektrofotometr s temperovaným kyvetovým prostorem na 37 ºC; plastová nebo skleněná tyčinka.*Alternativně lze použít set fy Pliva-Lachema, pak složení činidla je odlišné. Vysvětlete význam všech reagencií. Provedení (manuelní): Kyvetu fotometru naplňte destilovanou vodou a při vlnové délce 340 nm fotometr vynulujte. Vodu z kyvety vylejte. Do kyvety předehřáté na 37 °C odměřte 1 ml pracovního roztoku. Kyvetu vložte do kyvetového prostoru fotometru a nechejte 5 min předehřát (tuto dobu je nutné dodržet!). Přidejte do kyvety mikrodávkovačem 0,1 ml vzorku séra a tyčinkou opatrně promíchejte. Tím je zahájena první enzymová reakce, v návaznosti na ni probíhá ihned reakce druhá. Zaznamenejte čas v okamžiku smíchání a v intervalech po 15 s zapisujte absorbance vzorku v kyvetě po dobu 5 minut. Naměřené hodnoty vyneste do grafu. Z přímkové části grafu vypočítejte průměrnou rychlost poklesu absorbance ΔA340/min (viz obr.): 3 Výpočet katalytická koncentrace ALT v séru: katalytická koncentrace ALT A V V A kat l NADH CELK VZ = ⋅ ⋅ ⋅ = ∆ ∆340 6 340 1 60 10 29 10 / min / min . , / ε µ kde molární absorpční koeficient ε340(NADH) = 6 300 1.mol-1.cm-1, podíl VCELK/VVZ koriguje objem reakční směsi na objem vzorku séra a zlomek 1/60 převádí rychlost poklesu absorbance z minut na sekundy. Vysvětlete význam všech složek vztahu pro výpočet katalytické koncentrace. Proč počáteční část grafu není přímková? Hodnocení: Pro zdravou populaci je referenční interval katalytické koncentrace ALT v rozmezí 0,1–0,8 µkat/l. Z lidských orgánů je největší aktivita ALT v játrech. Zvýšení katalytické koncentrace ALT v séru tak indikuje především porušení integrity cytoplazmatické membrány hepatocytů. Zvýšení ALT je často prvním nálezem v časné fázi akutní hepatitidy. Referenční interval katalytické koncentrace AST je 0,1–0,5 µkat/l. Zvýšené hodnoty AST indikují porušení integrity cytoplazmatických membrán ve tkáních s vysokou aktivitou AST, nejčastěji v myokardu a jaterním parenchymu. Význam stanovení AST a ALT v diagnostice hepatobiliárního poškození: Aminotransferázy jsou citlivým ukazatelem většiny jaterních onemocnění, nejsou však pro ně specifické. Naopak nález fyziologické hodnoty ALT a AST vylučuje se značnou pravděpodobností hepatobiliární onemocnění. Více než dvacetinásobné zvýšení aktivity sérových aminotransferáz je charakteristické pro akutní virovou hepatitidu, akutní toxické poškození jater a stavy spojené s jaterní hypoperfuzí resp. hypoxií a městnáním (šok, akutní pravostranné srdeční selhání). Několikanásobné zvýšení transamináz provází řadu dalších jaterních chorob. AST se asi 30 % nachází v cytoplazmě, zbytek v mitochondriích. Zvýšené hodnoty AST indikují porušení integrity cytoplazmatických membrán ve tkáních s vysokou aktivitou AST, nejčastěji v myokardu a jaterním parenchymu. Při zánětech jater převažují enzymy uvolňované z cytoplazmy a poměr AST/ALT je typicky < 1. Při nekróze jaterních buněk se zvýší i mitochondriální frakce AST a poměr AST/ALT > 1 (progrese do jaterní cirhózy). Poměr AST/ALT > 2 je pokládán za specifický test pro alkoholické jaterní choroby. Poměr AST/ALT > 1 je nalézán také u infarktu. 4 3.1.2 Stanovení katalytické koncentrace ALP v séru End – point metoda: Metoda end-point (stanovení se provádí z celého průběhu reakce – do koncového bodu, všechen substrát musí zreagovat) – reakce musí být rychlá a kvantitativní. Koncentrace substrátu jsou často nízké, [S] <