Stanovení cholesterolu v séru Úvod Problematika poruch lipidového metabolismu je v popředí zájmu především v souvislosti s prevencí a léčbou kardiovaskulárních onemocnění. Základní lipidové vyšetření zahrnuje analýzu triacylglycerolů, celkového cholesterolu, HDL-cholesterolu, LDL-cholesterolu a z nich vypočtené non-HDL cholesterol, případně aterogenní index. Vyšetření může být doplněno analýzou apolipoproteinu B, lipoproteinu Lp(a), poměru apoB/apo A1 a elektroforézou lipoproteinů. 1. Enzymové stanovení celkového cholesterolu v séru Cholesterol je v krevní plazmě transportován jako součást lipoproteinů, z největší části ve frakci LDL, méně v HDL a VLDL. Z tohoto cholesterolu jsou přibližně dvě třetiny esterifikovány vyššími mastnými kyselinami, zbytek je neesterifikován. + R-COOH H[2]O Princip Estery cholesterolu jsou štěpeny cholesterolesterázou na cholesterol a mastnou kyselinu. Cholesterol je pak dalším enzymem cholesteroloxidázou oxidován na cholestenon. Současně vzniká peroxid vodíku, který za katalýzy peroxidázou reaguje s 4-aminofenazonem (4-aminoantipyrinem) a fenolem na červeně zbarvený produkt. Spřažení reakcí, při kterých vzniká peroxid vodíku, s následnou peroxidázovou reakcí s aminofenazonem je jeden z častých principů stanovení analytů v klinické biochemii. § Napište rovnici reakce, kterou katalyzuje cholesterolesteráza. Následují reakce: Cholesterol Oxidase Reaction Textové pole: + 2 H2O2 → + 4 H2O Textové pole: + Materiál: Set CHOL 250 firmy Erba Lachema^*: Činidlo-cholesterol (obsahující Goodův pufr 50 mmol/l, pH 6,7; 4‑aminoantipyrin (4AAP) 0,3 mmol/l; fenol 5 mmol/l; cholesterolesteráza ³ 3,33 mkat/l; cholesteroloxidáza ³ 0,83 mkat/l; peroxidáza ³ 50 mkat/l). Kalibrátor-cholesterol (o známé koncentraci), vzorky krevních sér, spektrofotometr. ^*Alternativně mohou být použity testy firmy BioVendor, Roche Diagnostics, pak složení činidla je odlišné. § Vysvětlete význam všech reagencií. Hodnocení Podle doporučení pro diagnostiku a léčbu hyperlipoproteinemií v dospělosti, vypracované výborem České společnosti pro aterosklerózu, má být provedeno vyšetření cholesterolu jedenkrát za pět let u všech dospělých osob mezi 20–75 lety při preventivní prohlídce. Je-li koncentrace celkového cholesterolu < 5 mmol/l, má být provedena další kontrola cholesterolu za 5 let. Zjištěné hodnoty koncentrace cholesterolu > 5 mmol/l by měly být důvodem k dalšímu vyšetření metabolismu lipidů, zvláště rozložení cholesterolu v lipoproteinových frakcích. Zvýšená koncentrace cholesterolu se často nachází u diabetiků nebo u hypotyreózy, snížená např. u pokročilých jaterních cirhóz nebo hypertyreózy. 2. Stanovení HDL-cholesterolu a LDL-cholesterolu Zjištěné hodnoty koncentrace cholesterolu > 5 mmol/l by měly být důvodem k dalšímu vyšetření metabolismu lipidů, zvláště rozložení cholesterolu v lipoproteinových frakcích, tedy v HDL a LDL. Stanovení HDL[Chol] v séru V prvním reakčním kroku reagují všechny lipoproteinové částice (VLDL, IDL, LDL, chylomikrony) mimo HDL s protilátkami za vzniku imunokomplexů, ve kterých je cholesterol „maskován“ před působením enzymů. V druhém reakčním kroku je stanoven cholesterol v HDL pomocí série na sebe navazujících enzymových reakcí katalyzovaných cholesterolesterázou, cholesteroloxidázou a peroxidázou. Barevný produkt vzniklý v poslední reakci katalyzované peroxidázou je měřen spektrofotometricky. Stanovení LDL[Chol] v séru Princip stanovení spočívá ve specifické reakci polyaniontového detergentu s LDL částicemi za tvorby nerozpustných komplexů. Vznikající zákal se měří turbidimetricky. Hodnocení Vysoký podíl z celkového cholesterolu séra vázaný v HDL-lipoproteinech se pokládá za známku dobré schopnosti vyloučit nežádoucí nadbytek cholesterolu z organismu. Naopak, hodnoty LDL[chol] jsou mírou aterogenní hypercholesterolemie. 3. Výpočet LDL-cholesterolu a odvozených parametrů LDL[Chol] Koncentraci LDL[Chol] lze stanovit buď přímým měřením (viz výše) nebo výpočtem pomocí Friedewaldova vzorce: LDL[Chol] = Chol[Celk] – TG/2,2 – HDL[Chol ] (mmol/l). Vzorec vychází z předpokladu, že ve většině sér nalačno chybí chylomikrony a že stanovené TG pocházejí převážně z VLDL, v nichž molární poměr TG/Chol má hodnotu 2,2. Uvedený vztah lze použít jen v případě, že koncentrace TG v séru je nižší než 4,5 mmol/l. Index Chol[Celk]/HDL[Chol ](aterogenní index) Index zohledňuje fakt, že zvýšený HDL[Chol] je „negativní rizikový faktor“, snižující riziko ischemické choroby srdeční (ICHS). Současné zvýšení Chol[Celk] i HDL[Chol] nemusí riziko ICHS zvyšovat. Non-HDL[Chol] Non-HDL[Chol] = Chol[Celk] – HDL[Chol] Tento parametr zohledňuje koncentraci všech aterogenních lipoproteinů. Cílové (žádoucí) hodnoty krevních lipidů běžné populace Chol[Celk ](mmol/l) LDL[Chol ](mmol/l) TG (mmol/l) HDL[Chol ](mmol/l) Index Chol[Celk]/HDL[Chol] Non-HDL[Chol ](mmol/l) < 5,0 < 3,0 < 2,0 > 1,0 < 5,0 < 3,8 4. Další testy metabolismu lipoproteinů Apolipoprotein B ApoB je velmi přesným ukazatelem rizika kardiovaskulárních onemocnění, neboť jeho koncentrace odráží počet všech aterogenních lipoproteinových částic v krvi. Stanovení apoB nevyžaduje vyšetření na lačno, je možné ho stanovit i při zvýšené koncentraci triacylglycerolů (TG až do 10 mmol/l). Stanovení apoB je možno provést imunoturbidimetricky. Lipoprotein (a) Lp(a) je pokládán za nezávislý rizikový faktor aterosklerózy a za parametr s trombogenním a aterogenním potenciálem. Koncentrace Lp(a) je z 90 % geneticky determinována a plazmatické hladiny Lp(a) jsou nezávislé na hodnotách jiných lipoproteinů a apolipoproteinů. Stanovení lipoproteinu (a) je možno provést imunoturbidimetricky.