Metabolismus lipidů Trávení lipidů, syntéza a odbourání MK, syntéza TAG, ketogeneze. Lipoperoxidace a lipofilní antioxidanty © Biochemický ústav LF MU 2018 (JG, JS, JT) Charakteristické vlastnosti lipidů üHydrofobní = nepolární = lipofilní charakter üNerozpustné ve vodě üRozpustné v nepolárních rozpouštědlech üChloroform üDiethylether üBenzen üDělení: üJednoduché lipidy üTuky üVosky üCeramidy üSložené lipidy – charakter tenzidů üGlycerofosfolipidy üSfingolipidy üGlykosfingolipidy üSložené lipidy se orientují na rozhraní voda – olej Související obrázek 2 Význam lipidů v organismu ü Zdroj energie ütukové buňky ü Strukturní funkce übiologické membrány ü Ochranná funkce ütuková tkáň –tepelná izolace üneuron - myelinová pochva - „elektrická“ izolace ü Zdroj esenciálních mastných kyselin üněkteré polynenasycené MK •lipidy + O2 → CO2 + H2O + energie 3 •Typy lipidů •Triacylglyceroly •Fosfolipidy •Sfingofosfolipidy •Glycerofosfolipidy •Steroidy •Ikosanoidy •(prostanoidy, leukotrieny) •Strukturální komponenty membrán •deriváty •Zdroj energie 4 Exogenní příjem lipidů üLipidy přijímáme ve formě: üTAG üSádlo üMáslo üOleje üTučné maso üSemena rostlin – rostlinné oleje üVolných MK üSubstituční terapie ω-3 nebo ω-6 MK • 5 Trávení lipidů üEnzymatický rozklad složek potravy üResorpce produktů štěpení 6 Trávení lipidů üZačíná v ústech üŽvýkání üSliny üEnzymy slouží spíše k hygieně než k trávení üVlastní trávení lipidů začíná až v žaludku üMísení tráveniny s trávícími enzymy üTéměř všechny trávicí enzymy jsou hydrolázy (štěpí za účasti vody) üTenké střevo üEmulsifikace lipidů üŽlučové kyseliny üVolné MK a MAG (produkty štěpení lipidů v tenkém střevě) üPankreatické enzymy (lipasy) hydrolyzují lipidy a estery cholesterolu üTvoří se směsné micely üResorpce do buněk střevní sliznice ve formě směsných micel 7 •Steatorea (lipidová malabsorpce) üNedostatečný přívod žluče (porucha jater, obstrukce žlučovodů) üPorucha ve funkci pankreatu üPorucha ve funkci střevní sliznice (trávení probíhá, porušená resorpce) ü ü •Možné příčiny •Lipidy z potravy •Nadbytek lipidů ve stolici •Důsledek: nedostatek lipofilních vitaminů üZtráta lipidů stolicí üFyziologicky je resorbováno ~ 98 % lipidů z potravy ü ü 8 Trávení lipidů üŽaludek: ü Linquální lipáza üGastrická lipáza üTenké střevo: üPankreatická lipáza a kolipáza üFosfolipáza üCholesterolesteráza • ü ü ü Lippincott’s Illustrated Reviews: Biochemistry, Sixth Edition 9 Triacylglyceroly üPankreatická lipáza: üŠtěpí TAG na 2-MAG a volné MK Pankreatická lipáza 2H2O + 2 TAG 2-MAG 2 MK 10 Lipázy üZažívací trakt: Lingvální (pH 2–7) Žaludeční (Ca2+) Pankreatická (kolipáza, ŽK) ü üExtracelulární: Lipoproteinová LPL (apoprotein CII) Jaterní ü üIntracelulární: Hormon senzitivní (aktivace fosforylací) Lyzosomální (pH ≈ 4) H2O EC 3 hydrolázy H2O H2O 1 2 3 üHydrolytické štěpení esterových vazeb üRozdílná: Aktivace Specificita (místo štěpení, délka acylů) 11 Cholesterol üCholesterol přijatý potravou je převážně volný = neesterifikovaný üPouze 10–15 % cholesterolu je esterifikováno üCholesterolesteráza: üŠtěpí esterifikovaný cholesterol na volný cholesterol a volné MK. ü + R-COOH •cholesterol •esteráza 12 Fosfolipidy üFosfolipáza A2: üŠtěpí za vzniku lysofosfolipidu a volné MK 13 Emulsifikace 14 Směsné micely üJsou tvořeny produkty degradace lipidů: üVolné MK üVolný cholesterol ü2-MAG üJedině ve formě micel může dojít ke vstřebání lipidů přijatých potravou üMAG a MK jsou vstřebávány pasivní difúzí üVýjimka: üMK s krátkým a středně dlouhým řetězcem jsou vstřebávány enterocytem bez nutnosti tvorby micel Lippincott’s Illustrated Reviews: Biochemistry, Sixth Edition 15 Tenzidy základ směsných micel Složky směsných micel soli ŽK + fosfolipidy + lysofosfolipidy + anionty MK 2-MG + MK + cholesterol lipofilní mikronutrienty > C12 Průměr < 20 nm tenzidy nepolární látky 16 Resyntéza TAG a esterů cholesterolu üEnterocytem absorbované lipidy putují do ER, kde podlehnou resyntéze Lippincott’s Illustrated Reviews: Biochemistry, Sixth Edition 17 Sekrece lipidů z enterocytu üNově syntetizované TAG a estery cholesterolu jsou velmi hydrofobní a proto asociují za vzniku lipoproteinové částice – chylomikronu (CM) üZ enterocytů jsou exocytózou uvolňovány do lymfy a přes ductus thoraticus do krve (mimo játra) ü 18 Využití lipidů přijatých potravou tkáněmi üChylomikrony jsou převážně metabolizovány kapilárami kosterního svalstva a tukové tkáně üStruktura CM üTAG (85–92 %) üPL (6–12 %) üChol (1–3 %) üProteiny (1–2 %, Apo-B48, ApoC-II aktivuje LPL) üTransport tuků z potravy ze střeva do tkání üTAG chylomikronů jsou degradovány LPL na MK a glycerol üMK vstupují buď přímo do svalových buněk (zdroj energie) nebo adipocytů (zásoba energie) anebo jsou transportovány krví ve vazbě na albumin üGlycerol je exklusivně využit játry za vzniku glycerol-3-P a následné glykolýze či glukoneogeneze üZ CM tak vzniknou chylomikronové zbytky (cholesterol estery, PL, apoproteiny, zbytek TAG) a jsou vychytávaný přes receptory játry üReceptory reagují specificky s Apo-E: üLDL receptory (apo B/E receptory) a üLRP receptory (LDL-receptor related protein, též apo E) • 19 Osud chylomikronu v krevním řečišti 20 Plazmatické lipoproteiny üCM üVLDL üIDL üLDL üHDL üVětšinou kulovité částice üTvořené lipidy a proteiny üJádro: üNepolární lipidy – TAG a CHOLestery üObal: üPolárnější – PL, CHOL, apoproteiny üZpůsob transportu lipidů v krevním řečišti üČím větší je lipidové jádro částice, tím menší je jeho hustota Lippincott’s Illustrated Reviews: Biochemistry, Sixth Edition 21 •Přeměna mastných kyselin na zásobní lipidy üMK se po jídle resorbují z plazmy do tukových buněk (adipocytů) üResyntéze TAG • 3 MK + glycerol TAG üjen tuková tkáň, játra, tenké střevo a mléčná žláza ü ü Takto vzniklý tuk se ukládá v tukových buňkách üVýznam: üPři hladovění mohou být mastné kyseliny uvolněny zpět do krve ü 22 Katabolismus lipidů •TAG •MK+ glycerol •Acetyl-CoA •Ketolátky •CO2 + H2O + energie •lipolýza •b-oxidace •CO2 + H2O + energie •utilizace ketolátek v extrahepatálních tkáních •citrátový cyklus + dýchací řetězec •chylomikrony + VLDL (lipoproteinová lipáza, insulin) •zásobní tuky (hormon sensitivní lipáza, glukagon) 23 •Metabolismus mastných kyselin •Volné MK se v krvi váží na albumin •» (1 mmol/l), poločas 2 min. •Uvolnění MK z chylomikronů v resorpční fázi lipoproteinovou lipázou •Uvolnění MK z TG v adipocytech působením hormonsenzitivní lipázy •(hormonální regulace) 24 Odbourání mastných kyselin (b -oxidace) üLokalizace: üV mitochondriích buněk, na multienzymovém komplexu üAktivace MK: üVazba CoA üV cytoplazmě buňky üTransport MK do mitochondrií üVe vazbě na karnitin üβ-Oxidace üŠtěpení acyl-CoA a vznik acetyl-CoA ü • ü 25 üLokalizace aktivace MK üMK (2–10 C): až matrix mtch (nevyžadují karnitinový transportní systém) üMK (12–20 C): vnější MM, peroxisomy, ER üMK (> 20 C): vnější MM, peroxisomy Aktivace MK – syntéza acyl-CoA R C O OH + H S C o A C O S CoA R A T P A M P + PPi ztráta energie ekvivalentní 2ATP Acyl-CoA synthetasa (thiokinasa) PPi→ 2 Pi ΔG 26 Aktivace mastné kyseliny na acyl-CoA je katalyzována thiokinasou (ligasa). Je to reakce, při které se spotřebovává ATP. Dochází ke štěpení až na AMP, reakce je tedy adekvátní ztrátě 2ATP. ATP + H[2]O  AMP + PP[i] AMP + ATP  2 ADP PP[i ]+ H[2]O  2 P[i] Celkem 2ATP + 2H[2]O  2 ADP + 2P[i] Karnitin üPřenašeč vyšších MK (>12 C) do mitochondrie üBiologicky aktivní pouze L-isomer N C H 3 C H 3 C H 2 H 3 C C H C H 2 O C O O H O C acyl-karnitin karnitin ECT karnitin ICT Přenašeč karnitinu OCTN2 N C H 3 C H 3 C H 2 H 3 C C H C H 2 OH C O O H * karnitin 27 Vnitřní mitochondriální membrána má velmi omezenou propustnost. Mastná kyselina ve formě acyl-CoA nemůže procházet, musí se pro transport navázat na karnitin. Mastné kyseliny kratší než 12 uhlíků nevyžadují pro transport do mitochondrie vazbu na karnitin. Přechází volně přes mitochondriální membránu a v mitochondrii jsou vázány na CoA. Jejich metabolismus je tedy nezávislý na karnitinu. •Nedostatek L-karnitinu ü Zdroje L-karnitinu (před. maso, mléko) a syntéza (AK: lysin a methionin) üNemoci jater ® snížená syntéza ü Malnutrice, vegetariánská dieta ü Zvýšená potřeba karnitin (těhotenství, popáleniny, trauma) ü Ztráty karnitinu u hemodialyzovaných pacientů ü Vrozené choroby metabolismu karnitinu •Suplementace karnitinem je nutná Snížená schopnost tkání využít MK s dlouhým řetězcem 28 Projevy nedostatku karnitinu üVyužití MK je nižší, deficit je prohlouben lačněním (kdy je potřeba metabolizovat MK) üSymptomy: üNonketotická hypoglykemie během lačnění üněkolik hodin po jídle ⇨ hypoglykemie ⇨ ↑glukagon ⇨ ↑lipolýza a glukoneogeneze ⇨ nadbytek acyl-CoA a nedostatek OA ⇨ acyl-CoA se omezeně dostává do matrix ⇨ nevznikají ketolátky üSvalová slabost, kardiomyopatie 29 üVýznam: üZisk energie, je-li v buňce nedostatek glukózy (postresorpční fáze, hladovění) üLokalizace: üMatrix mitochondrie ürakticky všechny buňky (sval, myokard, játra, ne v Erc, v CNS v nevýznamném rozsahu) üPůvod MK: üAdipocyty üCM üVLDL ü b-Oxidace mastných kyselin 30 üPrůběh: üDo reakce vstupuje acyl-CoA üPostupně se oxiduje β-uhlík (C-3) acylu üVznikají redukované kofaktory FADH2, NADH üOpakování čtyř reakcí ü b-Oxidace mastných kyselin dehydrogenace ® hydratace ® dehydrogenace ® odštěpení acetyl-CoA 31 •aktivace •2 •produkty • • • 32 •Při jedné otočce β-oxidace se MK zkrátí o 2C: • získá se: 1 FADH2 (2 ATP v DŘ) • 1 NADH (3 ATP v DŘ) •Odbourání palmitové kyseliny (16 C) • 8 x acetyl CoA………...x 12 = 96 ATP • 7 FADH2………………… x 2 = 14 ATP • 7 NADH ………………… x 3 = 21 ATP •131 ATP •Aktivace mastné kyseliny …………... – 2 ATP • CELKEM 129 ATP •Energetická bilance β-oxidace 33 • •b-oxidace MK je významným zdrojem energie •Kdy jsou MK odbourávány? •Buňky potřebují energii a dostupnost glukózy je nízká •b-oxidace je iniciována glukagonem v postresorpční fázi nebo hladovění 34 üLipolýza v tukové tkáni üMK jsou transportovány krví ve vazbě na albumin üMK jsou zdrojem energie pro myokard, svaly a játra ü ü •Lipidy v postresorpční fázy (glukagon) • •Játra •Acetyl-CoA • •Svaly, myokard •MK • •Tuková tkáň •MK + glycerol •TAG •MK-albumin •Acetyl-CoA •Efekt glukagonu •MK •HSL 35 Ketolátky üVýznam: üVe vodě rozpustné „palivo“ původem značně z MK üMísto vzniku: üJátra üMísto využití: üExtrahepatální tkáně (myokard, svaly, mozek.. ) üNadprodukce: üHladovění, nekompenzovaný diabetes melitus üVede ke ketoacidóze 36 • Příčiny vzniku a utilizace ketolátek •Játra •Acetyl-CoA •Ketolátky •Ketolátky • • •CNS •CO2 •Sval •MK • •tuková tkáň •MK + glycerol •TG •MK-albumin •Acetyl-CoA •nedostatek OA •Syntéza thioforasy indukována po několika dnech hladovění •thioforasa •Glukagon* •HSL •* Krev •Glc •thioforasa •CO2 •* 37 Příčiny zvýšené tvorby ketolátek v JÁTRECH: •Při hladovění nebo diabetu převažují účinky hormonu glukagonu •Pod jeho vlivem se uvolňují mastné kyseliny z adipocytů •V játrech dochází k jejich β-oxidaci •Produkce acetyl-CoA v játrech se tak zvyšuje •Aby byl veškerý acetyl-CoA využit v citrátovém cyklu, musel by se zvýšit také přísun druhého substrátu CC – oxalacetátu •Protože je však současně nedostatek glukosy, v játrech musí probíhat glukoneogeneze. Tento proces odčerpává oxalacetát, energeticky jej pokrývá ATP z β-oxidace. •Acetyl-CoA se hromadí v matrix mitochondrie jaterních buněk a váže CoA potřebný pro pokračování β-oxidace •Aby se zregeneroval CoA aktivuje se proces ketogeneze. Ketolátky (acetoacetát a β-hydroxybutyrát) se z jater uvolňují do krve a jsou vychytány extrahepatálními tkáněmi. Zpočátku jsou využívány hlavně svalovými buňkami a myokardem, při delším hladovění se na jejich metabolismus adaptuje i CNS. V CNS při delším hladovění dochází k indukci syntézy enzymu sukcinylCoA-CoA:acetoacetát-CoA-transferasy (thioforasy). •Ketogeneze •acetoacetyl-CoA •HMG-CoA •aceton •acetoacetát •pKA = 3,5 • • •# produkce ketolátek ⇨ ketoacidóza •převládá v krvi •určuje rychlost ketogeneze •#MK ⇨ #indukce HMG-CoA synthasy •matrix mitochondrie •acetyl-CoA • •3-hydroxybutyrát •pKA = 4,7 38 Syntéza ketolátek probíhá v matrix mitochondrie. Substrátem je acetyl-CoA. Prvním meziproduktem při syntéze ketolátek je acetoacetyl-CoA, který reakcí s dalším acetyl-CoA poskytuje 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA (HMG-CoA). Enzymem lyasou se 3-HMG-CoA štěpí na acetyl-CoA a acetoacetát. Při syntéze ketolátek je primárním produktem kyselina acetoctová. Redukcí (v závislosti na dostupnosti NADH) se mění na kyseliny β-hydroxymáselnou. Oba tyto produkty jsou v rovnováze a mohou být zpětně extrahepatálně přeměněny na acetylCoA. Dekarboxylací acetoctové kyseliny vzniká aceton. Tato reakce je nevratná a aceton je již odpadní látka. Z hodnot pK[A] je zřejmé, že při pH krve 7,4 jsou obě kyseliny zcela disociovány. To přispívá ke zvýšení koncentrace protonů v krvi, klesá koncentrace HCO[3]^- a nastává acidosa (ketoacidosa). Utilizace ketolátek v extrahepatálních tkáních •acetoctová kyselina •acetoacetyl-CoA •thioforasa •thiolasa •ENERGIE •donor HSCoA •4. reakce β-oxidace •matrix mitochondrie 39 V extrahepatálních tkáních (v mitochondriích) se acetoacetát působením enzymu thioforasy přeměňuje na reaktivní acetoacetyl-CoA. V játrech tento enzym není. V CNS je tento enzym indukován při delším hladovění. CoA se thioforasou přenáší ze sukcinyl-CoA (který je meziproduktem citrátového cyklu). V následujícím kroku, acetoacetyl-CoA reaguje s dalším koenzymem A za vzniku dvou acetylCoA (tholýza katalyzovaná thiolasou), které se mohou zapojit do citrátového cyklu. Tím extrahepatální buňka získává energii. Jestliže produkce ketonových látek je vyšší než jejich utilizace v extrahepatálních tkáních, jejich koncentrace v plazmě začne narůstat (ketonemie), při vyšších koncetracích jsou vylučovány i do moče (ketonurie). Tato situace nastává u diabetu, nebo dlouhodobého hladovění. Protože acetoctová i 3-hydroxymáselná kyselina jsou v plazmě téměř úplně disociovány, dochází ke snížení pH plazmy (acidemie). V organismu se vyvíjí acidosa, dle původu nazvaná ketoacidosa. Syntéza mastných kyselin 40 1. Transport acetyl-CoA z matrix mitoch. do cytosolu 2. Tvorba malonyl-CoA 3. Série reakcí na komplexu synthasy mastných kyselin Syntéza mastných kyselin z acetyl-CoA 41 Při popisu syntézy mastných kyselin rozlišíme tři fáze. Zdrojem je acetyl-CoA. 1.Fáze – transport acetyl-CoA do cytoplazmy Převážná část buněčného acetyl-CoA vzniká v mitochondriích. Transport acetylu s navázaným koenzymem A přes mitochondriální membránu však není možný. Acetyl-CoA se proto v matrix zúčastní první reakce citrátového cyklu, tj. tvorby oxalacetátu. Pokud je v buňce dostatek energie, citrátový cyklus dále nepokračuje a citrát je transportován přes mitochondriální membránu do matrix. 2. Fáze- vznik malonyl-CoA Acetyl-CoA nemá dostatečnou energii k tomu, aby vstoupil do kondenzačních reakcí při syntéze mastných kyselin. Je proto nejprve aktivován karboxylací na malonyl-CoA. 3. Fáze – vlastní syntéza mastné kyseliny katalyzovaná multifunkční synthasou mastných kyselin. 1.Transport acetyl-CoA do cytosolu CYTOSOL MATRIX acetyl-CoA + oxalacetát oxalacetát acetyl-CoA pyruvát ATP, NADH ADP + Pi ATP CoA citrát citrát CoA malát malát NADH + H+ NAD+ citrátlyasa pyruvát NADPH NADP+ citrátsynthasa malic enzyme isocitrát-DH Vnitřní MM pyruvát − X + 42 Snímek popisuje transport citrátu do cytoplazmy a související děje. Je-li v buňce dost ATP, isocitrátdehydrogenasa v matrix mitochondrie je inhibována ATP, isocitrát se hromadí v matrix a přeměněna citrátu na isocitrát je rovněř zastavena. Citrát je translokován do cytoplazmy. Zde na něj působí enzym citrátlyasa. Za spotřeby ATP dochází ke štěpení na acetyl-CoA a oxalacetát. Acetyl-CoA vstoupí do syntézy mastných kyselin. Oxalacetát je malátdehydrogenasou redukován na malát. Ten je buď transportován zpět do matrix, nebo je pomocí „jablečného“ enzymu přeměněn na pyruvát. V reakci se získá NADPH potřebné pro redukční reakce syntézy mastných kyselin. Všimněte si, že kombinací těchto dvou reakcí se extramitochondriální NADH konvertuje na NADPH. 2.Syntéza malonyl-CoA acetyl-CoA karboxylasa acetyl-CoA karboxylasa + HCO3– ATP ADP + Pi – OOC–CH2–CO–S–CoA CH3–CO–S–CoA malonyl-CoA acetyl-CoA biotin karboxybiotin 43 Karboxylace acetyl-CoA je regulačním krokem při syntéze MK a určuje její rychlost. Obsahuje biotin jako prostetickou skupinu (biotin je kovalentně vázán na lysinový zbytek enzymu). CO[2] se nejprve za spotřeby ATP váže na biotin a potom se karboxyl přenáší na acetyl-CoA. Malonyl-CoA tím získává vysoký obsah energie. üMultienzymový komplex se 7 enzymovými aktivitami ü Obsahuje ACP (acyl carrier protein) ⇨ váže fosfopantethein ü U savců homodimer ü Paralelně jsou tvořeny dvě molekuly MK ü Na syntéze každé molekuly MK se podílí oba monomery ü 3.Synthasa mastných kyselin 44 Vlastní syntéza mastné kyseliny probíhá na multienzymovém komplexu. U savců jsou komplexy sdruženy do dimerů. Každý monomer vykazuje sedm katalytických domén se sedmi enzymovými aktivitami a dále doménu, která váže molekulu 4-fosfopanteteinu (nazývá se acyl carrier protein- ACP). ~ O H O P O O O C H 2 C HS C H 2 C H 2 H N O C C H 2 C H 2 H N O C C H C H 3 C H 3 Cysteamin β-Alanin Pantooová kyselina Pantothenová kyselina (B5) Acyl Koenzym A HS–Pantethein–Pi–Pi–adenosin-3‘-Pi Pantethein NH CH2–CH CO ACP Pan-SH Fosfopantethein je polovina struktury CoA Acyl carrier protein 45 Doména ACP v multienzymovém komplexu váže fosfopantetein (derivát vitamínu kys. pantothenové). Ten při syntéze přejímá roli CoA a prostřednictvím –SH skupiny cysteaminu váže thioesterovou vazbou intermediáty. Acyl je v průběhu reakcí navázán na –SH skupinu pantetheinu a je postupně přenášen od jednoho komplexu ke druhému – tzv. fosfopantetheinová ruka Komplex synthasy mastných kyselin ACP domaine with phosphopantethein arm •AT •acetyltransacylasa •MT •malonyltransacylasa •OAS •3-oxoacylsynthasa (kondenzující enzym) •OAR •oxoacylreduktasa •DH •dehydratasa •ER •enoylreduktasa •TE •thioesterasa u živočichů - homodimer Každý monomer je rozložen do tří domén zahrnujících sedm katalytických aktivit navázání malonylu navázání acetylu Pan-SH V prvním cyklu: OAS OAS OAR OAR 46 Vlastní syntéza mastné kyseliny probíhá na multienzymovém komplexu. U savců jsou komplexy sdruženy do dimerů. Každý monomer vykazuje sedm katalytických domén se sedmi enzymovými aktivitami a dále doménu, která váže molekulu 4-fosfopanteteinu (nazývá se acyl carrier protein- ACP). Snímek znázorňuje schematicky dimerní komplex synthasy mastných kyselin. Při syntéze jedné molekuly mastné kyseliny jsou funkčně sdruženy podjednotky protilehlých monomerů 1.Přenos acetylu z acetyl-CoA na –SH skupinu oxoacylsynthasy ükatalyzuje acetyl transacylasa Reakce syntézy mastných kyselin ACP SH Cys S CO–CH3 AT OAS OAS OAR OAR 47 První cyklus syntézy začíná navázáním prvních reaktantů acetyl-CoA a malonyl-CoA na –SH skupiny proteinů. Acetyl-CoA se přenáší na periferní –SH skupinu cysteinového zbytku acetyl-CoAtransacylasy. AS-Cys-SH + CH[3]-CO-S-CoA  AS-Cys-S-CO-CH[3] + CoA-SH Při dalších cyklech syntézy bude do této reakce vstupovat již vzniklý acyl. 2.přenos malonylu z malonyl-CoA na –SH fosfopantetheinu ükatalyzuje malonyltransacylasa ACP S Cys S CO–CH3 COOH CH2 CO AT Pan-S OAS OAS OAR OAR 48 Malonyl-CoA se přenáší na fosfopanteteinovou skupinu Pan-SH pomocí enzymu malonyltransacylasy. ACP-Pan-SH + HOOC-CH[2]-CO-S-CoA  ACP-Pan-S-Co-CH[2]-COOH + CoASH 3.Kondenzace üpřipojení acetylu na druhý uhlík malonylu za současné dekarboxylace ütvorba acetoacetylu navázaného na Pan-S– ükatalyzuje 3-oxoacylsynthasa OAS ACP S Cys SH + CO2 CH3 C=O CH2 CO ACP S Cys S CO–CH3 COOH CH2 CO AT AT OAS OAS OAR OAR 49 V dalším kroku enzym 3-oxoacylsynthasa (AS) katalyzuje kondenzaci acetylu a malonylu. AS nese acetyl a současně katalyzuje syntézu oxoacylu. AS-Cys-S-CO-CH[3] + ACP-Pan-S-CO-CH[2]-COOH  ACP-Pan-S-CO-CH[2]-CH[3] + CO[2] Z malonylu se odštěpuje terminální karboxyl (došlo na dekarboxylaci). Produktem je β-oxoacyl navázaný na pantethein thioesterovou vazbou. 4.První redukce ükatalyzuje 3-oxoacylreduktasou s NADPH. üprodukt je 3-hydroxyacyl navázaný na Pan-S– ACP S Cys SH CH3 C=O CH2 CO + NADPH + H+ ACP S Cys SH CH3 CH–OH CH2 CO + NADP+ AT AT Další tři reakce se odehrávají ve vazbě na fosfopantethein, cílem je přeměnit C=O na 3. uhlíku na –CH2– (hydrogenace, dehydratace, hydrogenace ) srovnejte s b-oxidací mastných kyselin OAS OAS OAR OAR 50 Nyní proběhne série reakcí, jejímž cílem je odstranit oxoskupinu na uhlíku C-3. Reakce probíhají v opačném sledu než při β-oxidaci. Prvním krokem je hydrogenace, z oxo- skupiny vzniká hydroxy- skupina. Všimněte si, že donorem vodíku je NADPH (jedná se o syntetickou reakci). ACP S Cys SH CH3 CH–OH CH2 CO ACP S Cys SH CH3 CH CH CO + H2O 5.Dehydratace ükatalyzuje 3-hydroxyacyldehydratasa üprodukt je trans–2–enoyl navázaný na Pan-S– AT AT OAS OAS OAR OAR 51 V dalším kroku probíhá dehydratace, mezi uhlíky 2 a 3 se vytváří dvojná vazba. ACP S Cys SH CH3 CH CH CO + NADPH + H+ ACP S Cys SH CH3 CH2 CH2 CO + NADP+ 6.Druhá redukce ükatalyzuje enoylreduktasa s NADPH üproduktem je nasycený acyl (nyní butyryl-) vázaný na –PanS– (původní acetyl byl prodloužen o dva C) AT AT OAS OAS OAR OAR 52 Smyslem dalšího kroku je odstranit hydrogenací dvojnou vazbu. K hydrogenaci je opět využiti NADPH. Výsledkem předchozí série reakcí je čtyřuhlíkatý acyl (butanoyl) navázaný na pantethein. ACP S Cys SH CH3 CH2 CH2 CO ACP SH Cys S CH3 CH2 CH2 CO Nasycený acyl je přenesen na atom síry v Cys-SH kondenzujícího enzymu (oxoacylsynthasu). Pan-SH je volný pro navázání dalšího malonyl-CoA AT AT 53 Aby mohla syntéza pokračovat, butanoyl se dočasně přesune na –SH skupinu oxoacylsynthasy, tím se uvolní pantethein-SH Po ukončení prvního cyklu se na Pan-SH naváže další malonyl. Butyryl kondenzuje s malonyl za odštěpení CO2 za vzniku 3-oxohexanoyl navázaný na Pan-S … … Následuje: hydrogenace dehydratace hydrogenace Výsledkem je hexanoyl navázaný na Pan-S ACP S Cys S CH3 CH2 CH2 CO COOH CH2 CO AT 54 Ve druhém cyklu syntézy vstupuje nový malonyl-CoA a váže se na ACP-Pan-SH. Na něj se přenáší butanoyl vzniklý v předchozí sérii reakcí, dochází k odštěpení CO[2]. Vzniká 3-oxo-hexanoyl navázaný na pantetheinu. V dalších třech reakcích bude oxo-skupina na C-3 přeměněna na CH[2]. Po průchodu přes kroky 1–6 sedmkrát … Produktem synthasy MK je u savců 16:0 (palmitát) (hlavní) 18:0 (stearát) (minoritní) thioesterasa 55 Po sedmi cyklech , tj. když acylový zbytek dosáhne 16 uhlíků se hydrolyticky odštěpí palmitát, který je hlavním produktem syntézy v cytoplazmě. Bilance syntézy palmitátu (16:0) acetyl-CoA + 7 malonyl-CoA + 14 NADPH + 14 H+ CH3-(CH2)14-COOH + 7 CO2 + 6 H2O + 8 HSCoA + 14 NADP+ 7 acetyl-CoA + 7 ATP + 7 CO2 palmitová kyselina 56 Po sedmi cyklech , tj. když acylový zbytek dosáhne 16 uhlíků se hydrolyticky odštěpí palmitát, který je hlavním produktem syntézy v cytoplazmě u živočichů. Syntéza mastných kyselin je proces vyžadující velké množství ATP a dostupnost acetyl-CoA. Na syntézu kyseliny palmitové je potřeba 8 acetyl-CoA, z nichž 7 musí být karboxylováno za spotřeby ATP. Na každý cyklus jsou též potřebné 2 NADPH, tedy na syntézy kyseliny palmitové se spotřebuje 14 NADPH. Pro syntézu MK je potřebný NADPH Zdroje NADPH Pentosafosfátová dráha Glc + ATP → G-6-P + ADP G-6-P + 2 NADP+ ↓ ↓ Ru-5-P + 2 NADPH + CO2 + 2 H+ Jablečný enzym malát + NADP+ ↓ pyruvát + NADPH + CO2 + H+ 57 Ve dvou redukčních reakcích probíhajících na komplexu synthasy mastných kyselin se jako donor vodíku uplatňuje NADPH. Jeho zdrojem může být buď pentosa-fosfátová dráha, nebo dekarboxylace malátu „jablečným“ enzymem. Porovnej b-oxidace Synteza MK lokalizace mitochondrie cytoplasma základní jednotka acetyl (C2) acetyl (C2) Kofaktory redox. r. NAD+, FAD NADPH stimulace glukagon insulin 58 Elongace MK üSubstráty: MK, malonyl-CoA, NADPH üElongace probíhá od karboxylu ⇨ posun číslování C=C vazeb Desaturace MK üSubstráty: MK, O2, NADH üČlověk D9, D6, D5, D4 desaturázy üRostliny též D12, D15 desaturázy Elongace a desaturace MK endoplasmatické retikulum 59 Hlavním produktem syntézy mastných kyselin v cytoplazmě je kyselina palmitová. V dalších krocích však může probíhat i prodlužování řetězce a vznik dvojných vazeb. Tyto reakce se však odehrávají v ER. Po transportu MK do ER dochází nejprve k navázání CoA. Prodlužování pak probíhá obdobným způsobem jako v cytoplazmě, pomocí malonyl-CoA, enzymy však nejsou sdruženy v multienzymovém komplexu. Velmi dlouhé MK jsou syntetizovány zejména v mozku, kde slouží k tvorbě speciálních lipidů. Dvojné vazby se tvoří působením desaturas, rovněž v ER. Desaturace MK ü První krok: vždy D9 desaturace 18:0 a 16:0 ü Živočichové: další desaturace možná pouze mezi C9 a C1 ü Rostliny: další desaturace možná i mezi C9 a Cω • D15 desaturasy zejména u rostlin vegetujících ve studené vodě (řasy, plankton) ⇨ vysoký obsah ω-3 PUFA v rybím tuku 60 Mechanismus desaturace MK 1. hydroxylace 2. dehydratace Monooxygenace cyt b5 61 Desaturace mastných kyselin probíhá v ER a vyžaduje molekulární kyslík. Probíhá ve dvou stupních: • nejprve dochází k hydroxylaci mechanismem monoxygenasové reakce •druhým krokem je dehydratace Desaturace probíhá ve dvou krocích: 1.hydroxylace nasyceného acylu za účasti dikyslíku a koreduktantu 2.dehydratace hydroxyacylu (eliminace vody) Celková rovnice desaturace: nasycený acyl-CoA + O[2] + NAD(P)H + H^+  nenasycený acyl-CoA + NAD(P)^+ + 2 H[2]O Hydroxylační reakce se účastní cytochrom b[5] a NADH (nebo NADPH). Dvojná vazba vznikající dehydratací je vždy v konfiguracu cis-. (Mastné kyseliny s konfigurací trans vznikají ve větší míře u přežvýkavců mikrobiálními trávícími procesy a také při technické rafinaci potravinových tuků.) Desaturace a elongace MK 18:0 → 18:1 (9) → 18:2 (9,12) → 18:3 (9,12,15) všechny organismy rostliny rostliny, zejména plankton Řada ω−9 ω−6 ω−3 ⇩ D6 desaturace ⇩ ⇩ elongace ⇩ ⇩ D5 desaturace ⇩ ⇩ elongace ⇩ ⇩ D4 desaturace ⇩ !Příslušnost MK k řadě se nemění! D12 desaturace D15 desaturace 62 Živočichové neumí syntetizovat kyselinu linolovou a linolenovou, protože nemají Δ ^12 a Δ ^15 desaturasu. Tyto dvě kyseliny jsou proto pro člověka a většinu dalších živočichů esenciální. Pokud jsou ale tyto dvě esenciální kyseliny přijaty, mohou být dále modifikovány elongací a další desaturací v pozicích mezi devátým uhlíkem a karboxylovým koncem. Syntéza nenasycených MK •Ikosanoidy •Nasycené řada n-9 řada n-6 řada n-3 •18:0 18:1 (9) 18:2 (9,12) 18:3 (9,12,15) •stearová olejová linolová a-linolenová • • • 18:2 (6,9) 18:3 (6,9,12) 18:4 (6,9,12,15) • g-linolenová • • • 20:3 (5,8,11) 20:4 (5,8,11,14) 20:5 (8,11,14,17) • arachidonová eikosapentaenová • ARA EPA •esenciální 63 •64 •Glukóza z potravy •Glukóza z potravy •acetyl-CoA •pyruvát •dihydroxyacetone-P mastná kys. •TG z potravy •glycerol-3-P + acyl-CoA • •fosfatidát •glycerofosfolipidy •(buněčné membrány) •Triacylglyceroly •glykolýza •oxidativní dekarboxylace •Syntéza MK •glykolýza •hydrogenace •aktivace •Anabolické přeměny: biosyntéza lipidů •střevo® chylomikrony •adipocyty ® tukové zásoby •játra ® VLDL 64 •Syntéza triacylglycerolů •3 Mastné kyseliny + glycerol triacylglycerol •+ 65 Glycerol-3-P Lysofosfatidát Fosfatidát 1,2-DAG TAG Syntéza TAG üPostupná esterifikace glycerol-3-fosfátu aktivovanými MK • • • • • • üLokalizace: üAdipocyty üHepatocyty üEnterocyty üPůvod MK: üZ potravy = z CM üZ krve = z VLDL • 66 • • Kde probíhá syntéza TAG? •Tenké střevo •Játra •Tuková tkáň •Mléčná žláza •Syntéza •chylomikronů •Ukládání TG •Syntéza •VLDL •Kde? •Význam? 67 VLDL üVznik v játrech üTransport endogenně vzniklých lipidů (TAG, chol, PL) do extrahepatálních tkání üapoB-100 üLPL mění VLDL na IDL až na LDL ü 68 Lipoperoxidace •69 Lipoperoxidace •Neenzymová üPUFA (membrány, LDL) üRadikálová řetězová reakce üIniciace üPropagace ütTrminace üReaktivní meziprodukty (radikály, peroxidy, ...) üNěkteré produkty mutagenní nebo karcinogenní • • •Enzymová üPUFA üEnzymy üCyklooxygenasa üLipoxygenasy üEpoxygenasy üCytochrom P450 • … • •70 •Oxidaci podléhá i cholesterol ⇨ oxysteroly V průběhu neenzymové peroxidace lipidů (viz schéma) jsou rozlišovány 3 fáze: iniciace, propagace a terminace. Lipidová peroxidace je proces, při kterém jsou polynenasycené mastné kyseliny lipidů poškozovány působením volných radikálů a kyslíku za vzniku hydroperoxidů. Z hydroperoxidů pak dalšími reakcemi vznikají následné sekundární produkty. Je třeba připomenout, že pod pojmem peroxidace lipidů se většinou uvažuje neenzymový a nekontrolovaný proces přeměny lipidů. V řadě buněk však probíhá i enzymová peroxidace lipidů, která vede k tvorbě biologicky aktivních produktů, důležitých pro regulaci buněčných pochodů (např. prostaglandiny a leukotrieny). V biologických systémech probíhá neenzymová peroxidace lipidů (dále jen peroxidace lipidů) především v biologických membránách a lipoproteinech. Zde jsou jako součásti fosfolipidů v největší koncentraci přítomny polynenasycené mastné kyseliny, které jsou hlavními substráty lipoperoxidace. Iniciace lipoperoxidace •71 •X∙ •PUFA nepárový elektron v konjugaci s π-elektrony •X–H •Fentonova reakce •H2O2 + Fe2+/Cu+ •↓ •∙OH + OH- + Fe3+ /Cu2+ •přesmyk • • • •Alkylový radikál L∙ •vznik ≈ 50 ∙OH / s / buňka nepárový elektron v konjugaci s π-elektrony konjugovaného dienu •Alkylový radikál L∙ Pochod iniciace zahrnuje reakci, při níž je molekula mastné kyseliny atakována volným reaktivním radikálem. Největší význam se připisuje působení hydroxylového radikálu, iniciaci však v závislosti na podmínkách mohou vyvolat i radiály jiné. Nejcitlivějším místem pro atak radikálu v molekule mastné kyseliny je -CH[2]- skupina obklopená z obou stran dvojnou vazbou. To vysvětluje, proč především polynenasycené mastné kyseliny podléhají peroxidaci. Působením reaktivního volného radikálu se odtrhuje atom H z této skupiny a z mastné kyseliny se stává radikál L^. V jeho struktuře poté dojde k přeskupení dvojné vazby a vznikne konjugovaný dien. Propagace lipoperoxidace •72 • •O2 • •Peroxylový radikál LOO∙ •LH •L∙ •Alkylový radikál •primární produkt •Hydroperoxid LOOH •endoperoxid MDA •isoprostany •Sekundární produkty •Alkylový radikál L∙ •přesmyk •O2 •LOO∙ •… •… •∙ •∙ Radikál L^ konjugovaný s konjugovaným dienem reaguje spontánně s molekulou kyslíku za vzniku lipoperoxylového radikálu LOO^. Tento radikál je rovněž velmi reaktivní a je schopen reagovat s jinou molekulou nenasycené mastné kyseliny. Odštěpí z ní atom vodíku a sám se přemění na hydroperoxid LOOH. Tím je zahájena propagace, která pokračuje tak dlouho, dokud se volný radikál L^ nesetká s jiným radikálem nebo molekulou antioxidantu (např. tokoferolem) a dojde k ukončení řetězové radikálové reakce, tzv. terminaci. Hydroperoxidy jsou pouze primárními produkty peroxidace. V následných reakcích, z nichž některé jsou opět radikálové (viz schéma), se mění na řadu dalších, sekundárních produktů. Tvorba některých sekundárních produktů může být ovlivněna volnými ionty kovů, zejména železa a mědi. • Terminace lipoperoxidace tokoferolem •73 •askorbát •dehydro-askorbát •2 RSH •RS–SR •NADPH + H+ •NADP+ •cytosol •membrána • •regenerace •tokoferolu/askorbátu je částečná •vitamin E radikál •XH •L-OO∙ •PUFA (LH) •X∙ •XH •O2 •L-OOH •cyklus vitaminu E •cyklus vitaminu C •cyklus thiolů • •L∙ Propagace pokračuje tak dlouho, dokud se volný radikál L^ nesetká s jiným radikálem nebo molekulou antioxidantu (např. tokoferolem) a dojde k ukončení řetězové radikálové reakce, tzv. terminaci. Lipidové peroxidaci zabraňují antioxidanty. Z hlediska jejich zásahu do mechanismu peroxidace je lze rozlišit na preventivní antioxidanty, které lipidové peroxidaci zabraňují a antioxidanty, které přerušují řetězovou reakci, tj. zamezují propagaci. Do první skupiny patří např. katalasa a peroxidasy, které svým účinkem rozkládají peroxid vodíku a zabraňují jeho přeměně na reaktivní OH radikál. Patří sem i superoxiddimutasa, která vychytává superoxidový anion-radikál. Na prevenci rozvoje radikálových reakcí se podílí také látky schopné vázat ionty mědi a železa a zabraňující tak těmto iontům vstoupit do Fentonovy reakce. Jedná se hlavně o transferin, ferritin a ceruloplasmin. Do druhé skupiny antioxidantů se řadí látky, které mají schopnost reagovat s radikály za vzniku stabilních produktů a mají přitom lipofilní charakter. Největší význam je přikládán -tokoferolu (vitamin E). K účinným antioxidantům membrán patří také karotenoidy a ubichinol (mitochondriální membrána).V poslední době je značná pozornost věnována antioxidačním účinkům flavonoidů a dalších polyfenolů z potravy. •M1dG •MDA guanin Sekundární produkty lipoperoxidace üMalondialdehyd – vysoce mutagenní ü⇨ adukty s proteiny/DNA ü ü ü ü üIsoprostany ⇨ různý biologický účinek üprostaglandinům strukturou podobné sloučeniny üAlkanaly/alkenaly (4-hydroxynonenal, 4-HNE) üvysoce toxické üAlkany, alkeny ⇨ plíce •74 •markery oxidačního stresu •1 •4 •9 Lipoperoxidace je velmi destruktivní proces. Jednak přímo poškozuje fosfolipidy membrán, navíc však vznikající sekundární metabolity jsou velmi reaktivní a narušují strukturu dalších biomolekul. Toxické jsou především některé aldehydy (malondialdehyd, 4-hydroxynonenal), které se navazují na volné aminoskupiny proteinů. V důsledku toho se proteiny agregují, síťují a stávají se citlivější k proteolytické degradaci. Mění se fluidita membrán, zvyšuje se propustnost pro ionty, mění se membránový potenciál a dochází k lýze buněk. Preventivní antioxidanty üZabraňují vzniku ROS / eliminují ROS ⇨ ↓iniciace lipoperoxidace ü üVážou ionty Fe/Cu ⇨ zabraňují vzniku ∙OH ütransferrin, ferritin, ceruloplasmin, … üflavonoidy ü üAntioxidační enzymy ükatalasa üglutathionperoxidasa üglutathionreduktasa üsuperoxiddismutasa ü • •75 Lipofilní antioxidanty üEliminují radikály ü ükarotenoidy/β-karoten při nízkém pO2 übilirubin üvitamin E při nižších//normálních koncentracích üubichinol ü üpotravinářská aditiva – butylhydroxyanisol (BHA) butylhydroxytoluen (BHT) •76