Teoretické základy klinické
medicíny (TZKM)
Význam a perspektiva využití kmenových buněk v medicíně I
Vladimír Rotrekl 2017
Kmenové buňky: kriteria a definice
Sebeobnova
Diferenciace
Schopnost vytvářet
vlastní kopie
Schopnost měnit
vlastnosti a funkčně
se specializovat
Klonální kapacita
•Symetrické dělení
•Asymetrické dělení
Toti
Pluri
Multi potence
Oligo
Uni
Kmenové buňky se sebeobnovují, množí
Sebeobnova = tzv. self-renewal; nejdůležitější vlastnost kmenových
buněk; schopnost vytvořit identické dceřiné buňky
Symetrické dělení Asymetrické dělení
Kombinace obou mechanismů = neurální KB !!!
Buněčná smrt
Embryonální KB Fetální a dospělé KB (s vyjímkami)
.... a diferencují a regenerují tkáně orgány
totipotence pluripotence multipotence oligopotence unipotence
zygota Embryonální KB Hematopoetické KB Gastrointestinální KB KB prostaty
CFU-GM
CFU-E & BFU-E
CD34

Neurony
Nediferencované KB
Příklady
Kolonie mnoha tisíc buněk
Primitivní ektoderm/epiblast Trofektoderm
Polární trofektoderm
Extraembryonální ektoderm
Choriový ektoderm
Trofoblast placenty
Murální trofektoderm
Ektoplacentální konus
Obří buňky trofoblastu
placenta
parietální
žloutkový
váček
Primitivní entoderm
Ektoderm
• nervová tkáň – neurální KB
• kůže – kožní KB
Mesoderm
• kostní dřeň a krev – hematopoetické a mesenchymální KB
• svaly a kosti – tkáňově specifické KB
Entoderm
•plíce, játra, pankreas – orgánově specifické KB
• jícen, žaludek, střevo – intestinální KB
Viscerální entoderm
Parietální entoderm
embryonální KB
Původ a vývojová ontogeneze kmenových buněk (KB)
Primordiální zárodečné buňky
• gamety
Kmenové buňky v medicíně
• Pluripotentní
embryonální a indukované…
• Mezenchymální (Dr. Pešl)
experimentální léčba a turistika za
kmenovými buňkami
• Hematopoeitické (prof. Krejčí)
především hematoonkologické a
imunitní onemocnění
Kmenové buňky v medicíně
• Pluripotentní
embryonální a indukované…
• Mezenchymální (Dr. Pešl)
experimentální léčba a turistika za
kmenovými buňkami
• Hematopoeitické (prof. Krejčí)
především hematoonkologické a
imunitní onemocnění
Pluripotentní kmenové buňky
One Ring to Rule Them All…
…nebo to mělo být:
One cell to rise them all…?
Co myslíme EMBRYEM, když mluvíme
O kmenových buňkách
• preimplantační stádium
• blastocysta 4 dny stará
• tvoří ji několik desitek
buněk
• embryoblast a trofoblast
~9000 embryí implantováno (většinou po třech) ročně v ČR
zbytek >50% zůstane zamražen a …
"[T]he bottom line is that there are 400,000 frozen
embryos in the United States, and a large
percentage of those are going to be thrown out.
Regardless of what you think the moral status of
those embryos is, it makes sense to me that it's a
better moral decision to use them to help people
than just to throw them out. It's a very complex
issue, but to me it boils down to that one thing."
James Thompson
The destruction of human embryos to harvest stem
cells is "not only devoid of the light of God but is
also devoid of humanity" and "does not truly serve
humanity."
Benedict XIV
Zákon 227/2006 Sb
Zákon o výzkumu na lidských embryonálních kmenových buňkách a
souvisejících činnostech a o změně některých souvisejících zákonů
- Státem provozovaný registr linií lidských embryonálních kmenových buněk
- Výzkum lze provádět výhradně s povolením MŠMT
- Výzkum/činnost nesmí vést k vytvoření jedince (klonování)
Zákon 273/2011 Sb
- Skladování embryí neomezenou dobu (EU většinou 5 let)
- Likvidace embryí po 10 letech, pokud si pár nepřeje jinak
Zákon 227/2006 Sb
Zákon o výzkumu na lidských embryonálních kmenových buňkách a
souvisejících činnostech a o změně některých souvisejících zákonů
Možná Hlava 22…?
„Zamražená generace“ – cca ½ milionu zmražených embryí v US
ČR: skladovaní embryí (ČR) …. ~ 10 000 Kč (jednorázově
v roce 2007 – 3400 asistovaných reprodukcí
§9 odstavec 1: a) je možné udělit, je-li zřejmé, že jde o nadbytečné lidské embryo, a
zároveň dříve, než dojde k jeho použití k získání lidských embryonálních kmenových
buněk.
Blok I - Diskuze
• Relevance výuky o KB pro studenty
medicíny
• Relevance argumentů o lidském jedinci
od oplození do smrti a účelovosti
argumentů o absenci některých
schopností embrya (myslet, cítit bolest)
• (ne)dostatečnost současné legislativy o
EKB v ČR
Albert Lasker basic medical
research award 2009
Indukované pluripotentní KB (Yamanaka 2006)
Thy1 (a další geny typické pro fibroblasty))
0 4 8 12
retrovirová aktivita
markery pluripotentních KB
geny pluripotence
aktivita telomerázy
umlčení chromozomu X
Somatické buňky
Např. kožní fibroblasty
iPS buňky
Čas ve dnech
Stabilní reprogramace na “kmenovost”
Alternativní zdroj pluripotence - Indukované pluripotentní KB (iPS cells)
- KB vytvořené ze somatických tj. diferencovaných buněk pomocí genetické metody
Kinetika reprogramace fibroblastů do pluripotentních KB - relativně krátká cesta zpět
Oct4
Sox2
c-Myc
Klf4
iPS jsou schopny vytvořit chimérní organizmus
Oct-4 GFP
fibroblasty
Oct-4 GFP
iPS
Nanog GFP
iPS
Injekce chiméry
(bílá a hnědá srst)
Nanog GFP iPS chiméra Oct-4 GFP iPS chiméra
Brambrink et al. Cell Stem Cell, February 2008
Indukované pluripotentní kmenové buňky
mají obrovský potenciál pro medicínu - tzv. patient-specific cells
Etický problém s hiPSC?
• není potřeba destrukce embrya
• pro “reprogramaci” lze použít vlastní buňky
pacienta a odpada tak riziko GVH
LIDSKÉ INDUKOVANÉ PLURIPOTENTNÍ
KMENOVÉ BUŇKY
Zárodečné buňky z
pluripotentních
Diferenciace do PGC
Spermatocyt
Oocyt
Preimplantační embryo
Hubner, Science, 2003
?
Etický problém s hiPSC …. I
• Altruistický sentiment a očekávání benefitů
versus
• Ochrana soukromí
• Ustavení permanentní linie buněk (nesmrtelné; např.HeLa)
• Komercionalizace lidských buněk a tkání
• Možnost vytvořit gamety (zárodečné buňky)
• Editace genomu před transplantací buněk
Etický problém s hiPSC …. II
US
UK
Mezidruhové chiméry pro
výzkum a transplantační
medicínu
Blok II - Diskuze
• Relevance výuky o reprogramaci pro
studenty medicíny
• Relevance argumentů o lidském
individualitě ve vztahu ke klonování
• (ne)dostatečnost současné legislativy o
hiPSC v ČR
Předpoklady racionálního vývoje aplikací pluripotentních
kmenových buněk v klinické medicíně
• Otevřená a pravdivá komunikace s laickou veřejností
• Dokonalý informovaný souhlas
• Naprostá transparentnost výzkumu a preklinických testů
• Důvěra v systém a jednotlivce (vědce a lékaře)
K čemu to vlastně je?
Regenerativní a transplantační
buněčná medicína
Modelování chorob
Pochopení
patologických procesů
Vývoj léčiv
K čemu to vlastně je?
Regenerativní a transplantační
buněčná medicína
Modelování chorob
Pochopení
patologických procesů
Vývoj léčiv
Jakákoliv aplikace PKB je podmíněna kvantitativní diferenciací do kýžené tkáně
Vztah mezi pluripotencí a tumorogenicitou
(a) Telomeráza
(b) Absence kontaktní inhibice
(c) Silný antiapoptotický aparát
(d) Vysoká proliferační schopnost
Kooreman, J R Soc Interface. 2010
Současný standard pro klinické zkoušky: Maximálně 1 pluripotentní buňka na 106
diferencovaných buněk v off-the-shelf produktu!
Primitivní ektoderm/epiblast Trofektoderm
Polární trofektoderm
Extraembryonální ektoderm
Choriový ektoderm
Trofoblast placenty
Murální trofektoderm
Ektoplacentální konus
Obří buňky trofoblastu
placenta
parietální
žloutkový
váček
Primitivní entoderm
Ektoderm
• nervová tkáň
• kůže
Mesoderm
• kostní dřeň a krev
• svaly a kosti
Entoderm
• plíce, játra, pankreas
• jícen, žaludek, střevo
Viscerální entoderm
Parietální entoderm
embryonální KB
Původ a vývojová ontogeneze kmenových buněk (KB)
– pro dospělé KB hypotéza II.
Primordiální zárodečné buňky
• gamety
Multipotentní KB
• neurální KB
• kožní KB
• hematopoetické KB
• mesenchymální KB
• intestinální KB
• tkáňově specifické KB
• orgánově specifické KB
!
Thomas Graf & Tariq Enver Nature 462, 587-594 (2009) doi:10.1038/nature08533
Co řídí a určuje diferenciaci KB in vivo a in vitro:
Liniová diferenciace embryonálních kmenových buněk ve členité krajině vysokých
kopců (=NESTABILNÍ STAV BUNĚK), horských údolí (=RELATIVNĚ STABILNÍ ALE
REVERZIBILNÍ STAV BUNĚK) a hluboké nížiny (=TERMINÁLNÍ DIFERENCIACE BUNĚK)
Transkripční a růstové faktory!
DIFFERENTIATION OF PSC – analogie embryonálního vývoje…
Retinová kyselina
Ustavení AP osy
Ribes, Development 2009 Zhang, PLOS 2015
RA indukuje tvorbu ektodermu z PSC
DIFFERENCIACE PSC DO FUNKČNÍCH KARDIOMYOCYTŮ…
Pešl, Heart and Vessels, 2014
BMP4 pomáhá
polarizaci
embrya při
gastrulaci
(primitivní
mesendoderm)
Hensenův uzel v
přítomnosti FGF2
spouští
kardiogenezi
Activin A spouští
tvorbu
mezodermu
VEGF is je
třeba pro
pozdní
morfogenezi
srdce (tvorba
komor)
IWR inhibuje Wnt
signál – zabrání
neurodiferenciaci
atp.
Kardiomyocyty
začínají
spontánně bít
1mm
APD90(ms)
AP atrial ventricular
WT
DMDWT
DAPI / troponin T/C DAPI / α-actinin
DAPI / Troponin T/C /
α-actinin
FUNCTIONAL CHARACTERISATION OF PSC DERIVED CARDIOMYOCYTES…
Atomic Force MicrscopyCa2+ Transients
Cardiac Markers & Morphology Electrophysiology (Patch Clamp)
Department of Biology MU
Pokroky v diferenciaci lidských
pluripotentních KB - biologické
modely a aplikace
Neurony, astrocyty, oligodendrocyty
Kardiomyocyty
Insulin-produkující pankreatické buňky
Krevní buňky
Imunokompetentní buňky
Endoteliální buňky
Buňky trofoblastu
Respiratorní buňky
Osteoblasty
Hepatocyty
Melanocyty
Buňky prostaty
Zárodečné buňky
Příklad: traumatické poškození krční míchy, myelopatie a léčba kmenovými buňkami
Patofyziologie a strategie léčby KB Anatomie poškození Stav po transplantaci
Výsledek: obnovení bílé a šedé hmoty v místě poškození
obnovení funkčnosti motorických neuronů
obnovení pohybových funkcí
Model: laboratorní potkan
Adaptováno ze Stem Cells, 2010
Makrofág
Astrocyt
Oligodendrocyt
Axony s myelinem
Progenitory oligodendrocytů
Progenitory motoneuronů
…Srdeční záplaty…
Pacient s akutním
srdečním selháním
5% ejekční frakce
30% ejekční frakce
… pacient odchází z JIP
Úspěchy: Indukované pluripotentní KB
Teruo Okano: ISSCR Yokohama 2012; current status: unknown
…Regnerace RPE…
Úspěchy: Embryonální kmenové buňky
Schwartz a kol. Lancet 2012; 379:713-20
Lidské embryonální kmenové buňky
Diferenciace do pigmentového epitelu
Trounson, 2016
Výběr recentních aplikací PSC v klinických studiích
(další info v části II – Dr. Martin Pešl
K čemu to vlastně je?
Regenerativní a transplantační
buněčná medicína
Modelování chorob
Pochopení
patologických procesů
Vývoj léčiv
Duchenova muskulární
dystrofie
-Postižené kosterní
svalstvo
-Srdeční selhání
Předpoklad:
-Chybí dystrofin
-Únik kalcia ze
sarkoplazmatického
retikula
-Pomohly by inhibitory
vápníkových kanálů?
Chceme je testovat na
srdečních buňkách!!!
Duchenova muskulární
dystrofie
-Postižené kosterní
svalstvo
-Srdeční selhání
Předpoklad:
-Chybí dystrofin
-Únik kalcia ze
sarkoplazmatického
retikula
-Pomohly by inhibitory
vápníkových kanálů?
Chceme je testovat na
srdečních buňkách!!!
Nalezeny fyziologické rozdíly, ale nic co by
ohrozilo přirozenou regeneraci a vysvětlovalo
srdeční selhání….
Duchenova muskulární
dystrofie
-Postižené kosterní
svalstvo
-Srdeční selhání
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
Ratiofoci/nuclei
*WTDMD
spontaneo
us
MOX
WT DMD
**
***
*
D
CTRL MOX CTRL MOX0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
DMD WT
ROS
Relativefluorescence
DMDWT
*B
Duchenova muskulární
dystrofie
-Postižené kosterní
svalstvo
-Srdeční selhání
Závěr: defektní dystrofin způsobuje produkci ROS přes NO syntázu,
zvýšenou mutagenezu KB a následnou depleci progenitorů
K čemu to vlastně je?
Regenerativní a transplantační
buněčná medicína
Modelování chorob
Pochopení
patologických procesů
Vývoj léčiv
Katecholinergní polymorfní ventrikulární tachykardie (CPVT)
Syndrom náhlé srdeční smrti (často u „zdravých sportovců“)
Marc Vivian Foe
Mutace RyR:
Pomalý únik Ca2+
Požadován skríning inhibitorů kanálů Ca2+ - pomohou hiPSC?
Biopsie kožních buněk
Indukované
pluripotentní
buňky
Embryonální tělíska
… aneb jak dostat srdeční buňky z pacienta, který nám
je dát nemůže..
α-actininp-cTnI
Imunocytochemická analýza CM
Biopsie kožních buněk
Indukované
pluripotentní
buňky
Embryonální tělíska
… aneb jak dostat srdeční buňky z pacienta, který nám
je dát nemůže..
Analýza pomocí mikroskopu atomárních sil
Mechanické vlastnosti:
Biopsie kožních buněk
Indukované
pluripotentní
buňky
Embryonální tělíska
… aneb jak dostat srdeční buňky z pacienta, který nám
je dát nemůže..
Analýza pomocí mikroskopu atomárních sil
Mechanické vlastnosti:
Biopsie kožních buněk
Indukované
pluripotentní
buňky
Embryonální tělíska
Fluorescenční
mikroskopie
… aneb jak dostat srdeční buňky z pacienta, který nám
je dát nemůže..
Acimovic, Rotrekl a kol.
Konečná diskuse – část I (pluripotentní
buňky)
•Stárnutí PKB v kultuře a adaptace na in vitro podmínky-hrozí nebezpečné změny?
•Genetický reprograming – představuje riziko buněčné terapie?
•Problém “bezpečnosti” buněčných transplantátů derivovaných z pluripotentních KB
•Problémy rejekce KB imunitním systémem a omezené genetické diverzity linií?
•Nedostatečné/korektní/přemrštěné legislativní a etické překážky?