Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ISCN – An International System for Human Cytogenetic Nomenclature – Mezinárodní cytogenetická nomenklatura METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY pruhování / barvení chromosomů METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY pruhování / barvení chromosomů -charakteristika normálního a patologického karyotypu - techniky pruhování a barvení chromosomů - pruhovací vzory chromosomů s G – pruhy - vzory zápisů chromosomových změn - další cytogenetické informace Obr. 1 (Dokumentace OLG FN Brno) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno - VYŠETŘENÍ VROZENÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABNORMALIT – prenatální a postnatální vyšetření (periferní krev) - VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ (vznikajících v důsledku působení mutagenních faktorů prostředí na člověka) – postnatální vyšetření (periferní krev) - VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABNORMALIT (u onkologických onemocnění) (kostní dřeň, periferní krev, tkáň solidních tumorů) TYPY CHROMOSOMOVÝCH ABNORMALIT TYPY CHROMOSOMOVÝCH ABNORMALIT Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno DETEKCE VROZENÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABNORMALIT DETEKCE VROZENÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABNORMALIT vyšetření metodami klasické cytogenetiky + následně metodami molekulární cytogenetiky Standardní vyšetřovací postup stanovení karyotypu: Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY pruhování / barvení chromosomů METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY pruhování / barvení chromosomů • pruhovací metody umožňují individuální diferenciaci jednotlivých chromosomů, (byly zavedeny v letech 1968 -71) • do té doby bylo možné pouze obarvit chromosomy konvenčně a seřadit je do skupin podle velikosti a polohy centromery • ke klasifikaci chromosomů byl mezinárodně přijat jednotný systém, který vychází z identifikace lidských chromosomů pruhovacími a barvícími postupy Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY pruhování chromosomů G – pruhování METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY pruhování chromosomů G – pruhování • nejčastěji rutinně užívaná metoda • chromosomy jsou vystaveny účinkům trypsinu (proteolytický enzym), který natráví chromosomové proteiny na povrchu chromosomů • chromosomy obarvíme Giemsovým barvivem (směs barviv) • výsledek – každý chromosom se specificky obarví (střídavé tmavé a světlé příčné proužky různé tloušťky, tmavé proužky jsou bohatší na adenin a thymin, světlé na cytozin a guanin) • získané pruhy jsou specifické pro každý chromosomový pár • lze snadno rozpoznat strukturní a numerické abnormality Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY G – pruhování chromosomů normální mužský karyotyp 46,XY METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY G – pruhování chromosomů normální mužský karyotyp 46,XY Obr. 2 (Dokumentace OLG FN Brno) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY Q - pruhování chromosomů METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY Q - pruhování chromosomů • barvení akridinovými deriváty (fluoreskující látky – fluorochromy), akridin se specificky váže na oblasti bohaté na adenin (A) a tymin (T) • Q - pruhy (světlé a tmavé), přibližně odpovídají G - pruhům • nevýhody – je třeba fluorescenční mikroskop a při delší expozici UV světlem fluorescence slábne Obr. 3 (ISCN 2016) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY R - pruhování chromosomů METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY R - pruhování chromosomů • vystavení chromosomů působení specifických vlivů před obarvením (zahřátí) • R = reverse (opačný), tzn. R – pruhy jsou opačné ke G - a Q – pruhům (kde jsou G – a Q – pruhy světlé, tam jsou R – pruhy tmavé a opačně) Obr. 4 (ISCN 2016) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY C – barvení chromosomů METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY C – barvení chromosomů vizualizace heterochromatinu (heterochromatin v oblasti centromer a na dlouhých raméncích některých chromosomů – 1q, 9q, 16q, Yq) - metoda založena na denaturaci DNA působením různých agens (HCl, Ba(OH)2) a následné reasociaci v teplém pufru Obr. 5 (ISCN 2016) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY NOR – barvení chromosomů METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY NOR – barvení chromosomů • navázání zrn stříbra na aktivní oblast organizátoru jadérka (sekundární konstrikce akrocentrických chromosomů) • stříbro se vyloučí z AgNO3 za vyšší teploty a v kyselém prostředí • zjišťujeme, jestli jsou satelity schopny aktivity (jestli na nich není navázán euchromatin, který by aktivitě bránil a mohl by být nebalancovaným materiálem v karyotypu) • každý akrocentrický chromosom nemusí být aktivní ve všech buňkách • detekce satelitů v nestandardních pozicích (translokace) Obr. 6 (Dokumentace OLG FN Brno) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno AKROCENTRICKÉ CHROMOSOMY V KARYOTYPU AKROCENTRICKÉ CHROMOSOMY V KARYOTYPU Obr. 7 (Dokumentace OLG FN Brno) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY NOR – barvení chromosomů METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY NOR – barvení chromosomů Přítomnost satelitů na chromosomu 4 Obr. 6 (Dokumentace OLG FN Brno) NOR barveníG-pruhování chromosomů Obr. 8 (Dokumentace OLG FN Brno) chr. 4 Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY NOR – barvení chromosomů METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY NOR – barvení chromosomů Přítomnost satelitů na chromosomu 20 G-pruhování chromosomů NOR barvení Obr. 9 (Dokumentace OLG FN Brno) chr. 20 Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno DETEKCE ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ZMĚN DETEKCE ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ZMĚN Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY 1) ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA) (vliv mutagenních faktorů prostředí) METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY 1) ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA) (vliv mutagenních faktorů prostředí) konvenční barvení chromosomů – směsí barviv Giemsa - Romanowski stanovení % aberantních buněk – buněk s poškozeným chromosomem indikace k vyšetření – zejména práce v rizikovém prostředí vyšetření pouze konvenční metodou barvení chromosomů Obr. 10 (Dokumentace OLG FN Brno) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY 1) ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA) příčiny vzniku METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY 1) ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA) příčiny vzniku působení - fyzikálních faktorů (ionizující záření) - chemických látek (cytostatika, imunosupresiva, oxidační, alkylační činidla ad. látky používané v průmyslu) - biologických faktorů (virové infekce – pravé neštovice, spalničky, zarděnky ad.) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY 1) ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromatidové, chromosomové aberace METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY 1) ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromatidové, chromosomové aberace zlom na 1 chromatidě zlom na 2 chromatidách (chromosomu) dicentrický chromosom chromatidová výměna kruhový chromosom (ring) Obr. 11 Reálné chromosomy (Dokumentace OLG FN Brno) Schemata (Klen, 1982; Bočkov, 1971) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY 2) SCE – sesterská výměna chromatid (sister chromatid exchanges) METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY 2) SCE – sesterská výměna chromatid (sister chromatid exchanges) - testování účinku pouze chemických mutagenních látek (pro sledování vlivu ionizujícího záření test není vhodný) - test lze použít při výzkumu působení klastogenů – faktorů, působících strukturní změny chromosomů - testování SCE je metoda mnohem citlivější na detekci působení mutagenních látek než klasický test hodnocení chromosomových zlomů (100x při stejných dávkách mutagenů) - některé chemické látky lze testovat jen in vivo nebo po metabolizaci některými buněčnými liniemi - mechanismus SCE není jednoznačně vysvětlen - určitá část výměn je spontánní - nemocní se syndromy chromosomové instability – AR dědičnost – výrazně zvýšený počet SCE je nalézán pouze u Bloomova syndromu (počet výměn na mitózu a buněčný cyklus je více než 100) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY 2) SCE – sesterská výměna chromatid (sister chromatid exchanges) METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY 2) SCE – sesterská výměna chromatid (sister chromatid exchanges) BrdU technika pro detekci SCE BrdU = 5´bromo 2´deoxy uridin – analog báze thymidin - BrdU je přidán do kultivačního média – kultivace 72 h – 2 cykly buněčného dělení - BrdU se inkorporuje do nově syntetizované DNA místo thymidinu během S fáze buněčného cyklu - S fáze – replikace molekul DNA (které tvoří chromosom v mitóze): 1. buněčné dělení templátová molekula DNA (chromatida) – není inkorporován BrdU, nově syntetizovaná molekula DNA(chromatida) – je inkorporován BrdU - po inkorporaci BrdU – příprava preparátů – různé barvící metody – snížená schopnost chromatid s DNA substituovanou BrdU vázat některá barviva (například Giemsovo barvivo) - výměna zdánlivě homologních částí sesterských chromatid, k výměnám dochází během replikace - zvýšená frekvence výměn souvisí s vlivem mutagenních látek harlekýnský chromosom Obr. 12 Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY 3) ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY (vznik v souvislosti s onkologickým onemocněním) METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY 3) ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY (vznik v souvislosti s onkologickým onemocněním) G – pruhování chromosomů stanovení karyotypu maligních klonů + následné vyšetření metodami molekulární cytogenetiky Obr. 13 (Dokumentace IHOK FN Brno)