Počítání krevních buňek Principy hematologických analyzátorů Bourková L., OKH FN Brno Hematologické analyzátory •každý má svá jedinečná specifika •dva základní principy měření: –optický –impedanční •z měření získáváme informace o: –počtu buněk (kvantitativní analýza) –velikosti, tvaru a složení buňky (kvalitativní analýza) •principy měření mohou být na jednotlivých analyzátorech různě kombinovány •různé kombinace pak umožňují různě přesnou kvantitativní i kvalitativní analýzu všech prošlých buněčných elementů Principy měření •absorbční spektrofotometrie •impedanční analýza •optická analýza • •Poznámka: dle typu analyzátoru lze počítat i více jak 10.000 buněk a získávat více jak 40.000 informací Používaná diagnostika •analýza nesrážlivé periferní krve –odběr krve do solí EDTA (K, Na) •ředící roztoky –impedanční analýza vodivý roztok + nevodivá buňka –optická analýza opticky inaktivní roztok + opticky aktivní buňka •lyzační roztoky hemolýza erytrocytů a dle typu analyzátoru může být i destrukce jiných krevních elementů •barvící roztoky barvení obsahu buňky (granula/enzymy, DNA, RNA) •čistící roztoky čištění měřícího systému Absorbční spektrofotometrie •Metoda slouží ke stanovování množství hemoglobinu ve vzorku (cca. λ = 540 nm) V dnešní době se již jedná většinou o bezkyanidové metody. Impedanční analýza - I •mezi elektrodami je v apertuře standardní vodivost (vodivost zajišťuje diluentu) •buňky jsou v jedné kyvetě suspendovány diluentem (s katodou) → pomocí vakua jsou nasávány malým otvorem (aperturou) do druhé kyvetky s diluentem (s anodou) •obě kyvety jsou přes aperturu propojeny vodivým diluentem •při průchodu buňky aperturou se vodivost naruší/změní: vzniká impedanční impulz •četnost impulzu ® počet buněk velikost impulzu ® velikost buňky Impedanční analýza - II •měření může být doplněno vysokofrekvenční analýzou: → na stejnosměrné elektrické pole → je superponováno vysokofrekvenční elektrické pole → to pronikne cytoplazmou → pak se změří vysokofrekvenční vodivost buňky → ta odpovídá její fyzikálněchemické struktuře (kvalitativní analýza buňky) Hydrodynamická fokusace •využívá unášení jednotlivých buněk proudem kapaliny •pro impedanční i optickou analýzu Optická analýza •využívá se průtoková cytometrie: (spolu s hydrodynamickou fokusací) –každá buňka je ozářena monochromatickým laserovým paprskem –po interakci buňky s paprskem se provádí analýza –analyzuje se samostatně každá buňka v suspenzi •detekuje se světlo: –prošlé –odražené –depolarizované –fluorescence https://www.abbottdiagnostics.com/sal/image/MAPSS_differentiation_classification.png Laser → Analýza prošlého světla •Detekce paprsku ve směru 0° udává hodnoty: –počet prošlých buněk –velikosti jednotlivých buněk Analýza odraženého a depolarizovaného světla •Detekce paprsků v různých úhlech (dle typu analyzátoru). •Analýza může být doplněna cytochemickým barvením buněk. –Roztok se substrátem (např. 4-chlor-1-naftol) barví v leukocytech enzym peroxidázu. •Reakcí enzymu se substrátem vznikají v buňce barevné intracelulární sraženiny, které ovlivňují úbytek světla a rozptyl paprsku. •Měření slouží k detekci tvaru a velikosti buňky, jádra a granularity cytoplazmy Analýza fluorescence •Obarvení buňky speciálními barvami → ozáření buňky laserovým paprskem. •Absorbce světla buňkou → emise světla o vyšší vlnové délce → detekce emitovaného světla •Detekce: DNA, RNA nebo povrchové antigeny (CD znaky). Analýza fluorescence