Vrozené poruchy krevního srážení •P. Smejkal Poruchy krevního srážení •Stavy, kdy se v důsledku chybění nebo nedostatečné (nadbytečné) funkce některé z látek potřebných pro krevní srážení objevuje sklon ke krvácivým nebo trombotickým příhodám • Rozdělení poruch krevního srážení •Dle dědičnosti: •Vrozené - porucha tvorby • - dysproteinemie •Získané - porucha tvorby • - zvýšený obrat - spotřeba • - ztráty •Dle projevů: •Hypokoagulační poruchy – vedou ke krvácivým projevům •Hyperkoagulační poruchy - projevy TEN • Vrozené krvácivé stavy - dělení dle etiologie •cévní stěna (Ehler-Danlos, Rendu-Osler) » •trombocyto - –penie (TAR, Wiskot-Aldrich, Grey platelet sy) –patie (Glanzmann-Naegeli, Bernard-Soulier) » •plazmatické koagulace –hemofilie –von Willebrandova choroba –defekty ostatních koagulačních faktorů –a2-antiplazmin, PAI-1 ? • • Krvácivé projevy Krvácivé projevy - laboratoř •Počet trombocytů, aPTT, PT, fibrinogen, (TT, ReT) •doba krvácení, PFA-100, vWF:RCo •ověření počtu a morfologie trombocytů •Rumpel-Leede test •specifické vyšetření: –jednotlivých faktorů –trombocytárních funkcí Frekvence hereditárních (AR) defektů koagulačních faktorů - homozygoti • faktor odhadovaná prevalence v populaci •Fibrinogen 1 : 1 000 000 •FII 1 : 2 000 000 •FV 1 : 1 000 000 •FVII 1 : 300 000 – 500 000 •FV+VIII 1 : 2 000 000 •FVIII (XR) 50 – 80 : 1 000 000 •FIX (XR) 10 – 15 : 1 000 000 •FX 1 : 1 000 000 •FXI 1 : 1 000 000 (Ashkenazi 8% heterozygoti) •FXIII 1 : 1 000 000 •MvW (AD) 100 – 1 000 : 1 000 000 • HEMOFÍLIE - výskyt •Sporadický výskyt v rodině (25 - 30%) –po generace přenos pouze ženami –bez klinické manifestace –nová mutace •Hemofilie A (FVIII) 1/5000 – 10000 chlapců •Hemofilie B (FIX) 1/30000-50000 chlapců • Hemofílie – pohlavně vázaná dědičnost (X-recesívní) • Hemophilia Hemophilia_02 zdravý muž žena přenašečka zdravá žena hemofilik zdravá zdravý dcera hemofilik dcera syn přenašečka dcera zdravý dcera zdravý přenašečka syn přenašečka syn Působení FVIII a IX v koagulační kaskádě – TENÁZA • • FIX XIIa •FVIIa-TF XIa • FIXa • • FVIIIa FVIII • • FX FXa • • FVa FV • FII FIIa • • fibrinogen FIBRIN Hemofilie A, B - diagnostika •krvácení: - především do kloubů a svalů • •těžká < 1% FVIII / FIX • - časté spont. krvácení (1 x měs.) • •středně těžká 1 - 5% FVIII / FIX • - spont. krvácení méně často • •lehká 5 - 40% FVIII / FIX • - krvácení potraumatické • HEMOFÍLIE - diagnostika • hemofílie M. von Willebrand •aPTT - N •PT (Quick) N N •doba krvácení N N •PFA-100 N •stanovení FVIII vWF, FVIII • Stanovení FVIII/IX metodou: •Jednofázovou: –Běžná praxe •Chromogenní (fotometricky) •Dvoufázovou: –Upouští se » •Část pacientů s lehkou HA má diskrepanci mezi metodou jednofázovou a chromogenní (dvoufázovou) –5-10% LHA nižší hladina chromogenně •tato většinou směrodatná pro krvácivé projevy •dáno mutací genu pro FVIII • • normální hemostáza hemostáza hemofilika • chvění • brnění • horkost • • bolest • omezení pohybu • horkost • otok • • • otok • bolest • omezení pohybu • ztuhlost • svalová slabost Nejčastější projev: krvácení do kloubu http://www.hemophiliaindia.com/images/Picture5.jpg HEMOFÍLIE – prenatální diagnostika •u těžké hemofilie především: –40% těžké hemofilie A: inverze v intronu 22 •nutnost UZV ověření délky gravidity •odběr choriových klků 11. – 13. týden •amniocentéza 15. – 18. týden •izolace fetální DNA z krve matky: – od 7.- 9. týdne •preimplantační diagnostika: –na úrovni 8 buněk Hemofílie – způsoby léčby koncentráty (plazmatické, rekombinantní) •FVIII:C 1 j. / kg vzestup o 2% t2 = 12 h •FIX:C 1 j. / kg vzestup o 1% t2 = 18 h • •Profylaxe •primární: •sekundární (v ČR od konce 90. let) •krátkodobá • •On demand •při krvácení •preventivně při operacích • Hemofílie - profylaxe •hladina faktoru > 1 - 2% •A: FVIII 25 – 40 j./kg 3 x týdně •B: FIX 25 – 40 j./kg 2 x týdně •2 - 3 x vyšší spotřeba (dražší) než léčba on demand •pokles: –život ohrožujících krvácení –krvácení do kloubů –poškození kloubů, tím i nutnosti ortopedických výkonů Léčba hemofílie krvácení (operace) FVIII (%) FIX (%) minim. hladina první týden (%) intervaly podání délka podávání drobné kloubní a sval. krvácení 30 - 40 25 - 30 12 - 24 h. 24 - 48 h. 1 – 3 dávky 1 – 2 dávky malé operace fraktury 50 – 60 40 – 50 30 - 50 30 - 40 12 h. 12 - 24 h. 6 - 10 dnů 6 - 10 dnů pokročilé svalové krvác. 50 – 80 40 – 60 30 – 50 30 – 40 8 – 12 h. 12 – 24 h. 9 – 14 dnů 9 - 14 dnů velké operace krvác. do CNS 70 – 100 60 – 80 50 – 70 40 – 60 4 – 12 h. 6 – 24 h. 14-21 dnů 14-21 dnů Hemofílie – léčba •Rekombinantní koncentráty: •Generace: –I. s lidským albuminem –II. lidské proteiny během výroby (některé s delecí B domény) –III. bez styku s lidskými proteiny (některé s delecí B domény) –IV. Syntetizované lidskými embryonálními buňkami •4 000 j / mg •prioritně: –PUPs –HCV a HIV negativní –HIV pozitivní –HCV pozitivní •SRN –rFVIII 0,79 € / 1 j pdFVIII 0,63 € / 1 j – 0,68 0,51 – *Auerswald, Haemophilia 2004 *Abbonizio, Haemophilia 2014 Modifikované koncentráty FVIII / FIX •Prodloužení t2: •Pegylované •Pegylované lysozomální •Fúzované s albuminem •Vázané s Fc fragmentem imunoglobulinu (Elocta®) •Rezistentní k inaktivaci •¯ vazba na LRP » •Zlepšení funkční aktivita: • aktivace • specifická aktivita •Hybridní FIX/FX * Pipe SW.Textbook of Haemophilia 2010 • • Hemofilie – genová terapie •Obnovení syntézy FVIII/FIX přenosem jeho genu: •In vivo: –přímo i.v., i.m., s.c. •Ex vivo: –Do buněk ex vivo a jejich implantace –Využití HSC, MSC, EPC •Vektory: •Virové: –retroviry - s.c.: onkogenní riziko –adenoviry - i.m.: eliminace imunitním systémem –adeno-asociované viry – i.m.: jen menší geny – hemofilie B •Jiné způsoby: –Liposomy, nanopartikule –Elektroporace –Přímá injekce Journal of Thrombosis and Haemostasis pages S133-S142, 19 JUN 2015 DOI: 10.1111/jth.12926 http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/jth.12926/full#jth12926-fig-0001 Schéma genové terapie hemofilie B adneno-asociovaným virem (AAV) Gene therapy approaches for hemophilia by direct administration of AAV8. (A) The therapeutic gene (FIX or FVIII) is packaged into AAV8 and then directly injected into the body. AAV8 can efficiently transduce hepatocytes to express coagulation factor. (B) AAV vectors enter the cells via endocytosis and then express the target gene as an episome (upper panel). Neutralizing antibodies against AAV capsid proteins interfere with AAV transduction of the cells (lower panel). (C) Techniques to minimize the inhibitory effect of neutralizing antibodies against AAV. Blood flow in the left portal vein was transiently occluded with a balloon catheter. To remove neutralizing antibodies in the blood, saline followed by AAV8 was injected sequentially through the catheter. IF THIS IMAGE HAS BEEN PROVIDED BY OR IS OWNED BY A THIRD PARTY, AS INDICATED IN THE CAPTION LINE, THEN FURTHER PERMISSION MAY BE NEEDED BEFORE ANY FURTHER USE. PLEASE CONTACT WILEY'S PERMISSIONS DEPARTMENT ON PERMISSIONS@WILEY.COM OR USE THE RIGHTSLINK SERVICE BY CLICKING ON THE 'REQUEST PERMISSIONS' LINK ACCOMPANYING THIS ARTICLE. WILEY OR AUTHOR OWNED IMAGES MAY BE USED FOR NON-COMMERCIAL PURPOSES, SUBJECT TO PROPER CITATION OF THE ARTICLE, AUTHOR, AND PUBLISHER. Schéma genové terapie hemofilie A přenosem mesenchymálními buňkami s lentivirem jako vektor Journal of Thrombosis and Haemostasis pages S133-S142, 19 JUN 2015 DOI: 10.1111/jth.12926 http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/jth.12926/full#jth12926-fig-0002 Local cell‐based therapy for hemophilic arthropathy by MSCs expressing coagulation factor. (A) The therapeutic gene (FVIII or FIX) is packaged into a lentiviral vector that efficiently transduces MSCs to produce FVIII or FIX. MSC can self‐renew and differentiate into a number of lineage‐specific cells. MSCs expressing coagulation factor have the significant potential to treat hemophilic arthropathy (expression of coagulation factor, regenerative effects, and modulation of immune responses and inflammation). (B) Transduced MSCs expressing coagulation factor are transplanted into the joint space by arthrocentesis. IF THIS IMAGE HAS BEEN PROVIDED BY OR IS OWNED BY A THIRD PARTY, AS INDICATED IN THE CAPTION LINE, THEN FURTHER PERMISSION MAY BE NEEDED BEFORE ANY FURTHER USE. PLEASE CONTACT WILEY'S PERMISSIONS DEPARTMENT ON PERMISSIONS@WILEY.COM OR USE THE RIGHTSLINK SERVICE BY CLICKING ON THE 'REQUEST PERMISSIONS' LINK ACCOMPANYING THIS ARTICLE. WILEY OR AUTHOR OWNED IMAGES MAY BE USED FOR NON-COMMERCIAL PURPOSES, SUBJECT TO PROPER CITATION OF THE ARTICLE, AUTHOR, AND PUBLISHER. Genová terapie – hemofilie B •těžká forma •AAV8 •1/3 pacientů má neutralizující protilátky •desítky pacientů od roku 2011: –2x1011 vg/kg - 2x1012 vg/kg –3-4 roky hladina FIX 1-6% – JT 6.-12. týden při použití vyšší nálože •destrukce hepatocytů T-lymfocyty •prevence kortikoidy –Padua mutant FIX (p.R338L): •5-10x vyšší koagulační aktivita •hladina FIX 18-80% •Riziko ztráty s obnovou hepatocytů – • – *Dolan G.Eur J Haematol. 201799(Suppl.87): 3-9 *Nathwani AC. Human Gene Therapy 2017;28: 1004-12 Genová terapie – hemofilie A •celý gen 7 kb •od roku 2015 •AAV5, 15 pacientů: –nutnost delece B-domény (4,4 kb) –7: 6x1013 vg/kg: po 1 roce FVIII v normě –6: 4x1013 vg/kg: po 1 roce FVIII v normě 3x, 3x > 5 % –3: 6x1012 vg/kg a 2x1013 vg/kg: bez efektu •Lentivirus –možnost přenosu i většího genu • *Nathwani AC. Human Gene Therapy 2017;28: 1004-12 • Bispecifická protilátka simulující funkci FVIII (ACE910, emicizumab) Emicizumab – volba dávky a cílová hladina hladina •Dávkování 1x týdně s.c.: –Skupina 1: 0,3 mg/kg –Skupina 2: 1 mg/kg –Skupina 3: 3 mg/kg • •„Trough level“ 12. týden: •10 µg ~ 3 % FVIII •30 µg ~ 9 % FVIII •90 µg ~ 27 % FVIII • •30-50 µg ~ 10-15% FVIII Figure *Shima M. et al. N Engl J Med 2016;374:2044-53 Počet krvácení ročně (ABR) větev A vs větev B *Oldenburg J et al. ISTH, 2017 Median: 18,8 0 87% redukce P< 0,0001 Intraindividuální porovnání *Oldenburg J et al. N Engl J Med 2017;377:809-18 79% redukce P = 0,0003 Větev C: Větev A: HEMOFÍLIE - výskyt inhibitoru •alogenní oprotilátky •protilátky většinou třídy IgG •1 BU / ml = inhibice faktoru ve zdravé plazmě na 50% po 2 hod. inkubaci s plazmou pacienta –Bethesda jednotka •PUP (previous untreated patient) s těžkou hemofílií A: –medián vzniku je 12. den expozice (aplikace) koncentrátům FVIII/FIX (9 – 36), oj. > 100 den aplikace • HEMOFÍLIE - chování inhibitoru • responder "Low" "High" • •odpověď na žádná / pomalý vzestup titru • podání FVIII vzestup titru • •titr inhibitoru < 5 B.U./ml > 5 B.U./ml • •výskyt cca 1/3 cca 2/3 • HEMOFÍLIE – inhibitor - léčba krvácení •koncentráty lidského FVIII (< 5 BU/ml) •koncentráty vepřového FVIII – riziko parvoviru •koncentráty aktivovaných faktorů protrombinového komplexu (FVIIa, FII, FIX, FX) FEIBA •koncentrát rFVIIa NovoSeven •DDAVP •plazmaferéza (s imunoadsorpcí imunoglobulinů) Proč FVIIa? • Imunotoleranční léčba (ITI - immune tolerance induction) •Bonnský protokol: –200 j / kg / den –Úspěšnost: 85% » •Malmö: –plazmaferéza s imunoadsorpcí IgG –imunosuprese cyklofosfamidem –substituce FVIII – vysycení inhibitoru –úspěšnost asi 50% » •low dose protokol: –< 50 j / kg / denně či 3x týdně –u LR –úspěšnost: 67% – Defekty ostatních koagulačních faktorů • •dědičnost AR •vzácné - těžké defekty 1 / 1 000 000 (homozygoti, dvojití heterozygoti) •dysfibrinogenemie (AD, krvácení i TEN) •snížení: - fibrinogen, F II, V, VII, X, XI, XII FXIII, a2AP, PAI, prekalikrein, HMW kininogen, protein Z • Vliv gravidity: Û Fbg, FVII, FVIII, vWF, FX, FXII, PAI Ü PS •Vliv HAK: ÛFbg, FVII, FVIII, vWF, FIX, FXII, FII, X, XI Ü PS, AT III •Vliv zánětu: Û Fbg, FV, FVII, FVIII, vWF Û a1AT, PAI, tPA, a2MG, Plg –Vliv fyz. i psych. stresu: ÛFbg, FVII, FVIII, vWF ÛtPA •Üa2AP, Plg • Û Û • • ; Faktor PT aPTT TT DK hladina F A-fbg fbg 0 Dys - fbg N fbg N - ¯, reptilázový čas II N N < 30 % V N N - < 30 % VII N N N < 30 % VIII N N N < 30 % vWCH N - N N - N FVIII: N - ¯, vWF:RCo < 50 %* IX N N N < 30 % X N N < 30 % XI N N N < 40 % XII N N N < 40 % XIII N N N N rozpustnost koagula PK N N N HMWK N N N α2AP N N N N PAI-1 N N N N N – normál - zvýšení ¯ - snížení * závisí na krevní skupině Faktor Krvácení Laboratorní nález Minim. hemostat. hladina Léčba fbg z pupečníku, CNS, měkké tkáně, klouby PT, aPTT, TT 0,5 - 1 g / l ČZP, fibrinogen II měkké tkáně PT a aPTT 20 - 30 % koncentrát PCC V z pupečníku, do kloubů, ekchymózy PT a aPTT 15 - 20 % ČZP VII <1% = hemofilické PT 15 - 20 % koncentrát FVII, PCC VIII viz text aPTT 40 - 50 % koncentrát FVIII vWCH viz text aPTT a DK 40 - 50 % koncentrát FVIII obsahující vWF IX viz text aPTT 40 - 50 % koncentrát FIX X <1% = hemofilické PT a aPTT 15 - 20 % koncentrát PCC XI po poprodu, trhání zubů, prostatektomii aPTT 30% (45%) ČZP XII není aPTT nevyžaduje léčbu XIII z pupečníku, CNS, měkké tkáně, klouby Norma 3 - 5 % (30%) Koncentrát FXIII, kryoprecipitát, ČZP PK není aPTT nevyžaduje léčbu HMWK není aPTT nevyžaduje léčbu a2AP hemofilické, do kostí zkrácená EF neurčeno antifibrinolytika, ČZP PAI-1 traumatické, pooperační zkrácená EF neurčeno antifibrinolytika, ČZP Dysfibrinogenemie •Diagnostika: – TT i reptilázový čas, ale i normální i ¯ –Antigen > funkční aktivita (Clauss) •Fenotyp (většinou AD): –Asymptomatické 55% (Aa Arg 16 His) –Krvácení 25% (Aa Gly 17 Val) –Trombóza 20% (Arg 554 cys) •Screening trombofilie •Popsáno 330 mutací •Terapie: –Krvácení: jako u afibrinogenemie –Trombózy: LMWH, kumariny –Potraty •LMWH •substituce Renální amyloidóza: • mutace v řetězci Aa • kuagulační fu v normě • terapie • transplantace jater Defekt FXIII • •koagulogram v normě • rozpustnost koagula v močovině •krvácení z pupečníku, špatné hojení ran, potraty •1-3% (30-60%) •koncentrát FXIII, kryoprecipitát, MP • - profylaxe á 4 - 5 týdnů (ICH) • - á 3 týdny v graviditě při opak. abortech • Kombinované defekty •typ •I FV+VIII (ERGIC-53) •II FVIII+IX •III FII+VII+IX+X, PC, PS, porucha: - karboxylace - reduktázy vit. K •IV FVII+VIII •V FVIII+IX+XI •VI FIX+XI Defekty koagulačních faktorů •FXII – aPTT –není indikace MP –suspektní trombofilní stav - nejednoznačné – •prekalikren, HMW kininogen - aPTT •- není indikace MP • •PZ – ZK v normě, u části patologie Rumpel-Leede –úloha při vazbě IIa na fosfolipidy –kofaktor při inaktivaci FXa ZPI –klinická významnost ne zcela jasná Krvácivé projevy - laboratoř •počet trombocytů –ověření počtu a morfologie trombocytů » •aPTT, PT, fibrinogen, (TT, ReT) » •doba krvácení, PFA-100, vWF:RCo » •specifické vyšetření jednotlivých faktorů » •vyšetření trombocytárních funkcí aPTT – příčiny prodloužení •deficit: –FVIII, FIX, FXI, FXII –FII, FV, FX » •lupus antikoagulans » •přítomnost heparinu ( TČ, norma rept. čas) –slouží k monitoraci léčby heparinem » •Pradaxa ( TČ) » •špatná technika odběru (z kanyly) » •vzácně získaný inhibitor (většinou FVIII) •vysoký hematokrit (srdeční vady) •těžká hypofibrinogenemie PT – příčiny prodloužení •deficit: –FVII –FII, FV, FX » •Léčba –Warfarinem: slouží k monitoraci léčby Warfarinem –Xareltem, Eliquisem » •lupus antikoagulans » •vysoký hematokrit (srdeční vady) » •těžká hypofibrinogenemie » •extrémně vzácně získaný inhibitor