Krevní buňky a principy jejich vyšetřování na hematologických analyzátorech a mikroskopicky Bourková L., OKH FN Brno Příklady webových stránek • hematologický atlas – http://www.hematocytologie.eu/ – http://www.hematologyatlas.com/ – http://www.grsmu.by/files/file/university/cafedry/klinicheskaya-immynologiya/files/fiu/atlas.pdf  http://www.cellavision.com/en/cellavision-cellatlas • RBC – https://www.google.cz/search?hl=cs&site=imghp&tbm=isch&source=hp&biw=1280&bih=908 &q=erythroblasts&oq=erythrob&gs_l=img.1.3.0i19l10.6606.9583.0.12410.8.8.0.0.0.0.68.208. 8.8.0....0...1ac.1.64.img..0.8.201.NRIoSeIUgdk – http://www.sekk.cz/infoservis/2006_Morfologie_erytrocytu.pdf • WBC https://www.google.cz/search?hl=cs&site=imghp&tbm=isch&source=hp&biw=1280&bi h=908&q=leukocytes&oq=leukocy&gs_l=img.1.2.0l3j0i30l7.1937.12377.0.15795.7.6.0 .1.1.0.244.565.5j0j1.6.0....0...1ac.1.64.img..0.7.577.pvdZx9LlCHk • PLT https://www.google.cz/search?hl=cs&site=imghp&tbm=isch&source=hp&biw=1280&bi h=908&q=platelets&oq=platelets&gs_l=img.1.0.0i19l10.1770.5225.0.7869.9.7.0.2.2.0. 207.325.6j0j1.7.0....0...1ac.1.64.img..0.9.349.CiouVP0aXo0 Vyšetřování krevních buněk v periferní krvi  nesrážlivá periferní krev  antikoagulační činidlo: K3EDTA, K2EDTA nebo Na2EDTA  vyšetření:  hematologické analyzátory  mikroskop myeloblast promyelocyt neutrofilní myelocyt eozinofilní myelocyt bazofilní myelocyt neutrofilní metamy eozinofilní metamy bazofilní metamy neutrofilní tyč eozinofilní tyč neutrofilní segment bazofilní segment proerytroblast středně zralý erytroblast (polychromní normoblast) pozdní erytroblast (ortochromní/oxyfilní normoblast) retikulocyt erytrocyt monoblast promonocyt monocyt magakaryoblast promegakaryocyt megakaryocyt trombocyty lymfoblast prolymfocyt lymfocyt bazofilní tyčí eozinofilní segment časný erytroblast (bazofilní normoblast) PERIFERNÍ KREV KOSTNÍ DŘEŇ plazmat. b.makrofág Leukocyty blast promyelocyt myelocyt meatamyelocyt neutrofilní segment eozinofilní segment bazofilní segment lymfocyt lymfocyt monocyt neutofilní tyč Erytrocyty Trombocyty proerytroblast bazofilní NRBC polychromní NRBC oxyfilní NRBC oxyfilní NRBC megakaryocyt Hematologické analyzátory linka analyzátor nátěrový automat digitální morfologie 12 3 Principy měření hematologických analyzátorů  principy měření:  impedanční analýza  optická analýza  hydrodynamická fokusace – kombinace různých principů analýzy  spektrofotometrická analýza hemoglobinu Principy měření umožňují vyšetření:  kvantitativní – počet buněk  kvalitativní – morfologie buněk  tvar buňky  tvar a velikost jádra  obsah cytoplazmy Impedanční analýza  ředění buněčné suspenze  diluent - vodivý  krevní buňka – nevodivá  průchod buněk mezi elektrodami (stejnosměrné elektrické pole) → impulz  prochází vždy jediná buňka  počet impulzů = počet buněk  velikost impulzů = velikost buněk  možné doplnění vysokofrekvenční analýzou  na buňku superponováno vysokofrekvenční elektrické pole  analýza vysokofrekvenčního napětí buňky = morfologie buňky Optická analýza  hydrodynamická fokusace: usměrnění buněk proudem izotonické kapaliny při průchodu měřícím kanálem „po jedné“  ředění buněčné suspenze  diluent – opticky inaktivní  krevní buňka – opticky aktivní  interakce buněk s monochromatickým laserovým paprskem  po interakci buňky s paprskem se provádí analýza:  prošlého světla (0°)  odraženého světla  depolarizovaného světla  fluorescence o cytochemické barvení enzymu (peroxidáza) v buňkách, doplňková analýza absorbce a rozptylu světla dle stupně reakce enzymu v cytoplazmě (u některých typů přístrojů)  vyšetření:  kvantitativní a velikost buňky → detekce ve směru (0°)  kvalitativní/morfologie buňky → detekce odraženého a depolarizovaného světla, fluorescence, případně kombinace s cytochemickou analýzou http://www.eclinpath.com/hematology/tests/hemoglobin/rbc-analysis-2/ Spektrofotometrická analýza hemoglobinu  hemolýza všech erytrocytů lyzačním (bezkyanidovým) roztokem  uvolněný HGB je převeden na chromogenní formu s nejvyšší hodnotou absorbance při λ = 540 nm  HGB je převeden na chromogenní formu reagencií (např. imidazolem nebo sodium lauril sulfátem), která vytváří hemoglobinový komplex  měření absorbance hemolyzovaného vzorku a blanku (lyzační roztok)  měření cca 8x (dle typu přístroje)  z rozdílu absorbancí je vypočítána koncentrace HGB Mikroskopovací zařízení Zhotovení nátěru krve  roztírací sklíčko položit před kapku krve na podložním skle pod úhlem cca 30 - 40° (nikdy ne do kapky krve); po doteku krve a roztíracího skla se krev rozlije podél hrany skla; po té rychle krev rozetřít po podložním skle  sílu nátěru zvažovat – čím větší úhel, tím silnější nátěr  úhel se řídí hodnotou HCT: čím ↑HCT, tím ↓úhel; čím ↓HCT, tím ↑úhel  nátěr musí být: rovnoměrný, přiměřeně tenký, dlouhé okraje musí být rovné, na konci přechází „do ztracena“ Mikroskopování  mikroskop  suchý objektiv: mezi preparátem a objektivem je vzduch (přehledné prohlížení a buněčnost preparátu)  imerzní objektiv: mezi preparátem a objektivem je imerzní olej (morfologie buněk) o imerzní olej má podobný index lomu jako sklo – vznikne opticky homogenní prostředí, zvýší se index lomu prostředí mezi preparátem a objektivem imerzí může být: voda, parafinový olej, glycerol, cedrový olej, kanadský balzám (voda má vyšší index lomu než vzduch, ale nižší než imerzní olej)  digitální morfologie nové generace analyzátorů svým softwarovým vybavením digitálně zpracovávají a vyhodnocují krevní nátěry, hovoří se o virtuální mikroskopii (telehematologie), digitální analýza vytváří databázi digitálních fotografií krvinek, které lze i exportovat e-mailem nebo po internetu odborníkům ke konzultaci Barvení nátěrů periferní krve a aspirátů kostní dřeně  Panoptická barvící technika:  fixační roztok May-Grunwald – složení: eozin Y, metylenová modř, metylalkohol, glycerol  barvící roztok Giemsa-Romanowsky – složení: metylenová modř, azureozin, azur II, metylalkohol, glycerol, fosfátový pufr pH 6,8-7,0  Základní principy barvení:  Aniontové (kyselé) barvivo eosin Y se váže na kationtové části molekul proteinů a barví oranžovočerveně hemoglobin a eozinofilní granula  Kationtové (zásadité) barvivo azur B, se váže na aniontové části molekul a barví modrošedě zbarvení nukleové kyseliny (DNA nebo RNA), nukleoproteiny, granula bazofilů a sekundární granula neutrofilů. Pro správné vyhodnocení preparátů je nutná pravidelná kontrola kvality panoptického i speciálního cytochemického barvení. Celkové obarvení nátěru je výsledkem řady různých kombinací těchto barevných reakcí, které nakonec dávají výsledný vzhled nabarveného preparátu. Preparáty lze připravovat manuálně nebo na nátěrových a barvících automatech. Princip barvení je vždy stejný. Podpořeno MZ ČR – RVO (FNBr, 65269705)