Imunofluorescence
Peter Slanina (peter.slanina@fnusa.cz)
Ústav klinické imunologie a alergologie
FN u sv. Anny a Lékařská fakulta MU
Serologické metódy
Reakcia antigénu (Ag) s protilátkou (Ab) = imunokomplex:
1. Primárna – rýchla, nepozorovateľná voľným okom
fáza – tvorba imunokomplexov Ag + Ab
– vznik väzby jednotlivých epitopov s väzbovými miestami protilátok
2. Sekundárna – pomalá, pozorovateľná voľným okom
fáza – uplatňuje sa multivalencia Ag a polyvalencia Ab
– vznik priestorového komplexu
Pokiaľ nedochádza k sekundárnej fáze reakcie, je nutné imunokomplexy vzniknuté v
primárnej fáze vizualizovať – imunochemické metódy
http://www.wikiskripta.eu
Serologické metódy
1. Klasické serologické metódy
- Aglutinácia (priama / nepriama)
- Precipitácia (v kvapaline, v géle)
2. Imunochemické metódy s následnou detekciou
- Imunofluroscencie (priama / nepriama)
- Imunoanalýza (EIA-ELISA, RIA, FIA, LIA)
- Imunoblot, imunodot
3. Metódy založené na efektorovom účinku protilátok (využívané v
klinickej mikrobiológii)
- Komplement fixačné reakcie
- Inhibičné a neutralizačné testy
Imunofluorescencie
• Luminiscencia
Jav, pri ktorom látka emituje žiarenie po absorpcii excitačného žiarenia
(Fotoluminiscencia) alebo pri chemickej reakcii (Chemiluminiscencia),...
Fluorescencia
emisia žiarenia krátko po excitácii (10-8 až 10-5 s)
Fotoluminiscencia
Fosforescencia
emisia žiarenia trvá dlhšiu dobu (10-2 s až dni)
Zdroj:
www.chemiaasvetlo.sk/teoria/
chemiluminiscencia/
Zdroj: www.infobiologia.net/2017/01/bioluminiscencia-animales-bacterias.html
Fluorescencia
látka po absorpcii excitačného žiarenia uvoľňuje emisné žiarenie o dlhšej vlnovej
dĺžke (nižšej energii)
Fluorescenčný mikroskop
• Zdroj svetla – ortuťová výbojka, LED dioda
• Excitačný filter – prepúšťa iba časť spektra potrebnú pre
excitáciu fluorescencie a zabraňuje priechodu žiarenia v
oblasti emisnej vlnovej dĺžky, ktorá by vytvárala pozadie
• Emisný (bariérový) filter – prepúšťa iba emisnú časť
spektra a zabraňuje priechodu excitačného žiarenia
• Binokulár/trinokulár
• Jednoduché polarizované svetlo,
Brightfield, Darkfield, Fluorescencia
Schéma fluorescenčného mikroskopu
Základný princíp
Inkubácia → Premytie
Inkubácia →
Premytie →
Krycie sklíčko
Imunofluorescencia
➢Priama IF
Slúži k detekcii antigénov – väzba konjugátu priamo na antigén
Využitie: histológia – preukázanie antigénu v tkanive
mikrobiológia – rýchla detekcia patogénov v biologickom materiálu
➢Nepriama IF
Používa sa k detekcii protilátok, väzba protilátok a konjugátu v 2 krokoch:
1. Na sklíčko sa nanesie vyšetrovaný materiál (sérum), pokiaľ sú v ňom
prítomné hľadané protilátky, naviažu sa na antigénny substrát na sklíčku
2. Nanesie sa konjugát, ktorý sa viaže na protilátku príslušnej izotypovej triedy
(IgG/IgA)
Využite: dôkaz špecifických protilátok, najčastejšie autoprotilátok
Imunofluorescencia
PRIAMA NEPRIAMA
Imunofluorescencie
Antigénne substráty používané pri nepriamej IF
➢Bunky HEp2 (Human Epithelial) – detekcii ANA
- odvodené od línie HeLa (karcinom děložního čípku)
- rýchlo sa deliace bunky, v mitóze pozorovateľná chromatinová destička –
dôležitý znak pre odlíšenie jednotlivých typov ANA
➢Neutrofilné granulocyty – detekcia ANCA
➢Crithidia luciliae – prvok, detekcia protilátok proti dsDNA
➢Opičí jícen – detekcia EMA
➢LKS (liver, kidney, stomach) – detekcia AMA, ASMA, GPC, RET, ...
- kombinácia 3 krysích tkanív
Konjugát
• Protilátka s naviazaným fluorescenčným farbivom
(fluorochromom)
• Najčastejšie používaný fluorochrom je FITC
(fluoresceinizothiokyanát)
excitačná/emisná vlnová dĺžka 495/520 nm (zelené svetlo)
• Konjugát sa špecificky viaže len na imunoglobulíny určitej
izotypovej triedy (IgG/IgA) – výberom konjugátu stanovíme
protilátky len tejto triedy
• Pre niektoré autoimunitné ochorenia má klinický význam
výskyt autoprotilátok v určitej izotypovej triede (napr.
celiakia – IgA)
ANA (Anti Nuclear Antibodies)
• Veľká skupina protilátok
• Viažu sa na rôzne antigény v jadre (DNA, RNA, centroméry, ...)
• Výskyt pri rôznych autoimunitných ochoreniach (systémový lupus erytematodes,
Sjögrenov syndróm, reumatoídna artritída, ...)
Fluorescenčný obraz v mikroskope môže vyzerať rovnako alebo podobne u rôznych
protilátok – keď vidíme určitý obraz, nevieme ešte o akú autoprotilátku ide (na aký
antigén sa viaže), k jej bližšiemu určeniu môžu pomôcť iné metódy (ELISA,
imunoblot)
ANA – typ homogénny (dsDNA, má Ch.d.)
ANA – typ granulárny, zrnitý (nemá Ch.d.,ENA)
ANA – typ nukleolárny (jadierkový)
ANA – typ centromerový (CREST syndrom)
V cytoplazme HEp2 buniek je možné
pozorovať ďalšie typy fluorescencie –
napr. mitochondriálny – AMA (antimitochondrial
antibodies) – výskyt u
ochorení primárna biliárna cirhóza
Zdroj: www.mayoclinic.org/diseases-
conditions/primary-biliary-cholangitis-pbc
ANCA (protilátky proti cytoplazme neutrofilov)
pANCA – perinukleárny – antigénom je MPO
(myeloperoxidáza)
Atypická ANCA – rôzne antigény (elastáza, lysozym,
katepsin)
cANCA – cytoplazmatická – antigénom je PR3
(proteináza 3) – typická pre (Wegenerova)
granulomatózu s polyangiitídov
pozitívna = vážna diagnóza = okamžite hlásiť
Prvok Crithidia luciliae – dsDNA neg/poz (↑špecifická,↓senzitívna)
EMA (protilátky proti
endomysiu)
• Na reze opičieho jícnu
• Ag je TTG (tkanivová
transglutamináza) – tiež ELISA
• Výskyt u celiakie (hlavne IgA)
Substrát LKS
• Kombinácia 3 krysích tkanív
- játra (Liver)
- ledviny (Kidney)
- žalúdok (Stomach)
• Pozorujeme protilátky:
- AMA (antimitochondriálne) – primárna biliárna cirhóza
- ASMA (proti hladkému svalu) – autoimunitné hepatitídy
- GPC (proti parietálnym bunkám žaludku) – prim. perniciózne anémie
- RET (proti retikulínu)
AMA (antimitochondriálne) – krysí žalúdok, ledviny, játra
ASMA
(proti hladkému svalu)
– krysí žalúdok
GPC
(proti parietálnym bunkám žaludku)
– krysí žalúdok
RET (proti retikulínu) – krysí žalúdok, ledviny, játra
Imunofluorescencie
• Zlatý štandard
• Na prvom mieste – každé imun. lab. by malo poskytovať stanovenie
autoprotilátok IF metódou
• Kombinácia s ELISA + Imuno-Blot
• Interpretácia výsledkov:
- záleží na type
- pozitívna/negatívna alebo titer Ab
- autoimunitné protilátky sa ↑ s vekom (!! Deti !!)
Imunofluorescencie
• Popis vzoriek + sklíčka
• Pracovný list – zoznam pacientov → zápis výsledkov
• Prepis do systému