Výsledek obrázku pro med muni Iontový podklad akčního napětí srdečních buněk Metodiky, fyziologie a vybrané patologie Doc. MUDr. Markéta Bébarová, Ph.D. Fyziologický ústav, Lékařská fakulta, Masarykova univerzita Prezentace vznikla za podpory projektu FRMU „Modernizace výuky buněčné srdeční elektrofyziologie“, MUNI/FR/1490/2018. 1:Ganong´s Review of Medical Physiology, 23rd edition 1 Jak je obecně známo, podkladem fyziologicky probíhající mechanické aktivity srdce je adekvátně utvářená aktivita elektrická. Srdeční svalové buňky jsou jedním z typů vzrušivých tkání. Jsou tedy schopné na stimulaci reagovat vznikem akčního napětí, které se šíří srdeční svalovinou a umožní její následnou kontrakci vedoucí k vypuzení krve ze srdce do krevního oběhu. Elektrická aktivita srdce vzniká a na pracovní myokard se šíří prostřednictvím srdečního převodního systému. Obrazem elektrické aktivity na úrovni jednotlivé srdeční buňky je akční napětí. Jeho konfigurace se zásadním způsobem liší v buňkách převodního systému a v buňkách pracovní svaloviny srdce a rovněž pak v rámci samotné pracovní svaloviny náležící k různým srdečním oddílům a vrstvám. Odlišná konfigurace akčního napětí je podmíněna odlišným zastoupením a aktivitou jednotlivých iontových membránových proudů. Pro správné utváření akčního napětí je klíčová dokonalá souhra těchto proudů. Narušení funkce prakticky kteréhokoliv z iontových kanálů a tedy změna kteréhokoliv z iontových proudů pak může vést ke vzniku proarytmogenního stavu. 1: http://tmedweb.tulane.edu/tmedwiki/doku.php/intro_to_the_heart_cardiac_electrophysiology 1 1 Fáze AN. Iontový podklad AN. Význam souhry jednotlivých proudů pro správné utváření AN. Tyto iontové proudy, tedy proudy nesené ionty, které jsou hydrofilními a tedy lipofobními částicemi, tečou přes buněčnou membránu přes speciální proteiny přemosťující buněčnou membránu, tzv. iontové kanály. Iontové kanály Výsledek obrázku pro med muni 1 1:Despopoulos, Color Atlas of Physiology, 2003 1 Iontové kanály – typ pasivního transportu, po elektrochemickém gradientu. Různé typy iontových kanálů. Vrátkování. Význam znalostí elektrických vlastností srdečních buněk pro klinickou medicínu Výsledek obrázku pro med muni 1 →Dědičné arytmogenní syndromy →Získané arytmogenní syndromy -Na podkladě jiných základních onemocnění srdce -Vedlejší účinky farmak -Účinky jiných látek, včetně látek návykových →Náhlá srdeční smrt →Mechanismy účinku antiarytmik Elektrofyziologické metody v kardiologii 1.Na úrovni celého organismu Příklad: EKG 2.Na úrovni srdce Příklad: Intrakardiální EKG 3.Na izolovaném srdci Příklad: Perfuze srdce dle Langendorffa 4.Na částech srdeční tkáně Příklad: Měření na multicelulárních preparátech 5.Na izolovaných srdečních buňkách Příklad: Technika patch clamp při měření z celé buňky (whole cell patch clamp) 6.Na jednotlivých membránových kanálech Příklad: Technika patch clamp při měření z jediného kanálu (single channel patch clamp) 6. Výsledek obrázku pro med muni Měření může probíhat: 1 Zipes D. a Jalife J. ; Cardiac Electrophysiology: From Cell To Bedside, 2003 Elektrofyziologické metody v kardiologii 1.Na úrovni celého organismu Příklad: EKG 2.Na úrovni srdce Příklad: Intrakardiální EKG 3.Na izolovaném srdci Příklad: Perfuze srdce dle Langendorffa 4. Měření může probíhat: 1 Princip: →Měříme rozdíl potenciálu mezi dvěma body objemového vodiče. →Měřenou veličinou je napětí. →Registrované signály představují součet příspěvků elektrické aktivity jednotlivých buněk sledovaného orgánu při šíření elektrického vzruchu. → Výsledek obrázku pro med muni Elektrofyziologické metody v kardiologii Výsledek obrázku pro med muni Měření může probíhat: 1 4.Na částech srdeční tkáně Příklad: Měření na multicelulárních preparátech 5.Na izolovaných srdečních buňkách Příklad: Technika patch clamp při měření z celé buňky (whole cell patch clamp) 6.Na jednotlivých membránových kanálech Příklad: Technika patch clamp při měření z jediného kanálu (single channel patch clamp) 6. Princip: →Měříme membránové napětí, což je rozdíl mezi extra- a intracelulárním prostředím, nebo membránový proud. Základní principy měření na jednotlivých úrovních Výsledek obrázku pro med muni Elektrokardiografie Výsledek obrázku pro med muni 1 Výsledek obrázku pro outline of figure Registrujeme rozdíl potenciálů, tedy napětí, a jeho změny v čase EKG t [s] 1:http://www.cndajin.com/group/human-figure-outline/#photo_2 1 Elektrokardiografie Výsledek obrázku pro med muni 1 Převzato od Malmivuo, J., Plonsey, R., 1995. Bioelectromagnetism: principles and applications of bioelectric and biomagnetic fields. Oxford University Press, New York Přesný mechanismus vzniku C:\Users\Roman Kula\Desktop\ezgif.com-gif-maker.gif Elektrokardiografie Výsledek obrázku pro med muni 1 Převzato od Malmivuo, J., Plonsey, R., 1995. Bioelectromagnetism: principles and applications of bioelectric and biomagnetic fields. Oxford University Press, New York Přesný mechanismus vzniku Intrakardiální elektrokardiografie Výsledek obrázku pro med muni 1 1: http://www.medicalexpo.com/prod/osypka/product-111576-879783.html; 2: http://www.drjohnm.dreamhosters.com/wp-content/uploads/2010/12/EPS-Teal_3.jpg →Invazivní metoda, která je používaná v klinice →Princip: Zavedení katetru intrakardiálně, do těsné blízkosti převodního systému. Ze zakončení katetru je snímán signál. 1. Multipolární katetr http://www.drjohnm.dreamhosters.com/wp-content/uploads/2010/12/EPS-Teal_3.jpg 2. Umístění katetru v srdci včetně ukázky záznamu Intrakardiální elektrokardiografie Výsledek obrázku pro med muni 1 Lze měřit: →Funkci sinusového uzlu →Vedení v síních →Vedení AV uzlem →Vedení Hissovým svazkem →Vedení Purkyňovými vlákny Ukázka elektrogramu Hissova svazku obr4c SA AV EKG EHS PQ QRS A H V PQ segment A V P Ukázka interpretace naměřeného záznamu 1 →Experimentální metoda →Srdce je umístěno do Langendorffova perfuzního zařízení: obr8 ccc LK PK aorta → Výsledek obrázku pro langendorff perfusion Princip retrográdní perfuze směr toku roztoku aortální chlopeň uzavřena prázdné komory perfuze přes věnčité tepny 1: https://www.adinstruments.com/research/animal/cardiovascular/isolated-heart-systems/langendorff Výsledek obrázku pro med muni 1 Měření na izolovaném srdci Měření na izolovaném srdci Výsledek obrázku pro med muni Měření se provádí pomocí: 1.Elektrod zabudovaných v lázničce obr8c referenční elektroda 2.Epikardiální přísavné elektrody Elektrogram Monofazický akční potenciál [mV] Výsledek obrázku pro med muni Měření na multicelulárních preparátech Skleněná mikroelektroda Ag/AgCl elektroda Referenční Ag/AgCl elektroda Skleněná mikroelektroda Uspořádání aparatury Výsledek obrázku pro med muni →Pro měření je nutná stimulace preparátu →Může probíhat ve dvou režimech: Měření na multicelulárních preparátech Im Um Ic Ic Im Um ICa-L INa Ito IK, IK1 metoda vnuceného proudu ´current clamp´ metoda vnuceného napětí ´voltage clamp´ Výsledek obrázku pro med muni Patch-clamp →Technika patch-clamp při měření z celé buňky (whole cell) i z jediného kanálu (single channel) vyžadují k měření izolované srdeční buňky. →Izolací ískáme tak frakci živých, funkčně nepoškozených buněk, které odpovídají na elektrickou stimulaci: •Kontrakcí •Elektrickou aktivitou (akčním napětím a membránovými proudy) Výsledek obrázku pro med muni Patch-clamp Enzymatická izolace srdečních buněk: Možnosti využití patch-clampu 1.Izolovaných srdečních buňkách Výsledek obrázku pro med muni 2.Buněčné linii, která přechodně exprimuje lidské iontové kanály Měření lze provádět na: 3.Lidských odvozených srdečních buňkách (iPSC-CM) Výsledek obrázku pro med muni Patch-clamp 1.Navázání kontaktu s buňkou Technika patch-clamp při měření z celé buňky (whole cell patch-clamp) Výsledek obrázku pro med muni Patch-clamp 2.Průběh měření Technika patch-clamp při měření z celé buňky (whole cell patch-clamp) Měření může probíhat v režimu •Vnuceného napětí (voltage clamp) •Vnuceného proudu (current clamp) Výsledek obrázku pro med muni Patch-clamp Technika patch-clamp při měření z jediného kanálu (single cell patch-clamp) Skleněná mikroelektroda [pA] Část membrány (‘patch’) s jedním kanálem Proud jedním kanálem v odezvě v odpovědí na vnucené napětí Výsledek obrázku pro med muni Patch-clamp Technika patch-clamp při měření z jediného kanálu (single cell patch-clamp) Skleněná mikroelektroda Část membrány (‘patch’) s jedním kanálem 5 µM ACh 50 μM ACh single channel current at -110 mV induced by acetylcholine at rat neuromuscular junction (nicotinic receptors; Mulrine and Ogden) Možnosti využití patch-clampu Výsledek obrázku pro med muni Lze studovat: 1 Výsledek obrázku pro med muni KONTROLA AJMALIN VÝPLACH Výsledek obrázku pro med muni Vnucený napěťový impulz Kontrola Po aplikaci DNP 240 mV 3 nA 50 ms IK(ATP) Měření IK(ATP) Výsledek obrázku pro med muni Změny po aplikaci ajmalinu 240 mV Měření IK(ATP) IK(ATP) v kontrole IK(ATP) po aplikaci ajmalinu Kontrola Vnucený napěťový impulz Výsledek obrázku pro med muni 1:Bébarová et al. (Naunyn Schmied Arch Pharmacol 2009; 380:125-133); 2: http://tmedweb.tulane.edu/tmedwiki/doku.php/intro_to_the_heart_cardiac_electrophysiology 1 2 INa Ito Výsledek obrázku pro med muni 1.Měření v tomto případě provedeno na lidských odvozených srdečních buňkách 2.Inhibice IKr nefazodonem Práce o nefazodonu převzata od Lee et al., Toxicol Appl Pharmacol 2016; 296: 42-53; 1: Jouni et al., J Am Heart Assoc 2015; 4: e002159 1 Odkaz na TZKM Možnost modelovat dědičné arytmie Inhibice Ikr antidepresivem druhé generace nefazodonem (množící se zprávy o jeho proarytmogenní aktivitě) Výsledek obrázku pro med muni Páce převzata od Bébarová et al. , Am J Physiol Heart Circ Physiol 2008; 295:H48-H58 Smeets_without layers_yellow_cut_provoc klinické symptomy: synkopa EKG: vyklenutá elevace úseku ST P vlna = 80 ms (120 ms) QRS komplex = 135 ms (100 ms) QTc interval = 382 ms (440 ms) AH = 109 ms (160 ms) HV interval = 56 ms (50 ms) Pokus_Smeets_smaller_flatten_def_def COOH NH2 bodová mutace v C-konci INa-kanálu (část Na+ kanálu podílející se na inaktivaci) F2004L Výsledek obrázku pro med muni 1.Měření bylo provedeno na buněčné linii, která přechodně exprimovala zdravý (WT) a mutovaný (F2004L) lidský kanál pro INa 2.Patrná inhibice INa v mutovaném kanálu F2004L Fig1_functional Páce převzata od Bébarová et al. , Am J Physiol Heart Circ Physiol 2008; 295:H48-H58 Výsledek obrázku pro med muni 1.Kinetické schéma INa kanálu 2.d Rozvoj pomalé inaktivace Rozvoj inaktivace ze zavřených stavů Páce převzata od Bébarová et al. , Am J Physiol Heart Circ Physiol 2008; 295:H48-H58 Výsledek obrázku pro med muni Schematický model Páce převzata od Bébarová et al. , Am J Physiol Heart Circ Physiol 2008; 295:H48-H58 Výsledek obrázku pro med muni Schematický model Páce převzata od Bébarová et al. , Am J Physiol Heart Circ Physiol 2008; 295:H48-H58 Výsledek obrázku pro med muni Prezentace vznikla za podpory projektu FRMU „Modernizace výuky buněčné srdeční elektrofyziologie“, MUNI/FR/1490/2018.