Základní barvicí metody v histologii Práce se světelným mikroskopem BARVENÍ •zviditelnění struktur v řezu – buňka a její součásti vykazují afinitu k barvivům dvou skupin: • •zásaditá /bazická/ barviva („jaderná“) – reagují s kyselými strukturami buněk a tkání (NK v jádře aj.) • bazofilie – bazofilní struktury •kyselá barviva („cytoplazmatická“) – reakce se zásaditými strukturami • acidofilie – acidofilní struktury v buňce • •- chromofilní ≠ chromatofilní/ x chromofobní •- polychromatofilní – afinita k oběma druhům barviv RUTINNÍ BARVENÍ: HEMATOXYLIN – EOSIN (HE) •Hematoxylin – zasaditý •Eosin – kyselý • •Postup: •Odstranění parafinu xylenem •Rehydratace „sestupnou“ řadou alkoholů (100% Ò96% Ò80%) •Barvení hematoxylinem ð jádra - modro-fialová •Diferenciace kys. alkoholem a vodou (odstranění přebytku barviva) •Barvení eosinem ð růžová - cytoplazma, vazivo, svaly •Praní ve vodě (odstranění přebytku barviva) •Dehydratace „vzestupnou“ řadou alkoholů (80% Ò96%) •Projasnění v xylenu vertical staining jar http://www.aname.es/microscopia/ems/histology/HIST44.gif http://www.aname.es/microscopia/ems/histology/HIST44.gif http://www.aname.es/microscopia/ems/histology/HIST44.gif http://www.aname.es/microscopia/ems/histology/HIST44.gif http://www.aname.es/microscopia/ems/histology/HIST44.gif http://www.aname.es/microscopia/ems/histology/HIST44.gif http://www.aname.es/microscopia/ems/histology/HIST44.gif http://www.aname.es/microscopia/ems/histology/HIST44.gif http://www.aname.es/microscopia/ems/histology/HIST44.gif http://www.aname.es/microscopia/ems/histology/HIST44.gif http://www.aname.es/microscopia/ems/histology/HIST44.gif http://www.aname.es/microscopia/ems/histology/HIST44.gif http://www.aname.es/microscopia/ems/histology/HIST44.gif http://www.aname.es/microscopia/ems/histology/HIST44.gif xylen I xylen II 100% 96% H2O hematoxylin kyselý etanol etanol etanol xylen IV xylen III 100% 96% H2O eosin H2O etanol etanol HEMATOXYLIN – EOSIN (HE) deparafinace rehydratace praní barvení diferenciace projasnění dehdyratace praní barvení praní SHANDON LIPSHAW VARISTIAN 24-4 vertical staining jar ≈ řada boxů (kyvet) s barvicími médii TYPY BARVENÍ •rutinní, přehledná – HE, AZAN (demonstrují všechny zákl. složky) •speciální – vizualizace vybraných struktur –Massonovy trichromy: žlutý - HEŠ, modrý - AZAN, zelený trichrom (kolag.vlákna) –orcein, aldehydový fuchsin (elast.vlákna) aj. •impregnační – AgNO3 (nervová nebo retikulární vlákna) MONTOVÁNÍ •uzavření preparátu – kapkou montovacího media a krycím sklíčkem Þ trvalý preparát • • • • • • –rozpustná v xylenu – kanadský balzám –rozpustná ve vodě – glycerin-želatina, arabská guma http://www.canemco.com/images5/4470.jpg http://nationaldiagnostics.com/images/h1_7a.gif Hematoxylin Eosin (HE) Výsledek barvení: jádra buněk – modrofialová cytoplazma – růžová kolagenní vlákna – růžová svalové buňky – červené 2 – Apex linguae (HE) Hematoxylin Eosin Šafrán (HEŠ) Výsledek barvení: jádra buněk – modrofialová cytoplazma – růžová kolagenní vlákna – žlutá žlutý Massonův trichrom 11 – Oesophagus (HES) Azokarmin Aniline blue Orange G (AZAN) Výsledek barvení: jádra buněk – purpurová cytoplazma – růžová kolagenní vlákna – modrá erytrocyty – oranžové modrý Massonův trichrom 99 – Pupečník (AZAN) Impregnace AgNO3 68 – Lien (impregnace) Speciální metody barvení Prep. 28 – elastická chrupavka Barvení – orcein Výsledekt – purpurová elastická vlákna Speciální metody barvení Prep. 31 – kůra ledviny Barvení – Weigert-van Giesson Výsledek – třešňově červená kolagenní vlákna Speciální metody barvení Prep. 49 – vagina - glykogen Barvení – Bestův karmín Výsledek – tmavě růžový glycogen Speciální metody barvení Prep. 65 – myocard Barvení – Heidenhain Výsledek – černé kardiomyocyty Speciální metody barvení Prep. 76 – cortex cerebri Barvení – impregnace Výsledek – hnědé buňky, nerv. vlákna hnědočerná Speciální metody barvení Prep 68 – lien Barvení – impregnace Výsledek – černá retikulární vlákna Speciální metody barvení Prep. 78 – cerebellum Barvení – Nissl Výsledek – modře gER, N, ncl. Speciální metody barvení Prep. 95 – kost Barvení – Schmorl Výsledek – rezavě hnědá kostní tkáň Pojivové tkáně - 45 Lamelózní kost Speciální metody barvení Prep. 87 – nerv - myelin Barvení – luxolová modř Výsledek – modrý myelin Světelný mikroskop •okuláry •objektivy s čočkami •stolek s preparátem •clona •on/off •regulace intenzity světla •zdroj světla •makrošroub - ostřit jen s objektivem 4x •mikrošroub •posun preparátu Olympus01 ukazovátko! Obj. 100x / nepoužívat! +pérko k fixaci preparátu na stolku Orientace preparátu krycím sklem nahoru. 4x, 10x, 40x, imerzní obj. – 100x Světelný mikroskop •okuláry •objektivy s čočkami •stolek s preparátem •clona •on/off •regulace intenzity světla •zdroj světla •makrošroub - •mikrošroub •posun preparátu • • Olympus01 ukazovátko! Obj. 100x / nepoužívat ostřit jen s objektivem 4x +pérko k fixaci preparátu na stolku • Zapněte světlo. • Začněte s objektivem 4x. • položte preparát na stolek mikroskopu – krycím sklíčkem nahoru. • Pohlédněte do mikroskopu a zaostřete. Použijte hrubé zaostření a jakmile je obraz víceméně vidět, použijte jemné ostření obrazu. • Seřiďte světlo. • Seřiďte okuláry. • Přepněte na objektiv 10x. K zaostření obrazu by měl stačit šroub pro jemné ostření. Pokud ztratíte obraz, vraťte se k objektivu 4x a začněte znovu. • Chcete-li vidět detailní obraz, přepněte na objektiv 40x. Objektiv 100x nepoužívejte! • Chcete-li studovat další preparát, přepněte zpět na obj. 4x před výměnou preparátu. • V každém okamžiku během praktika může být vyjmut pouze jeden preparát. NE víc! • Po skončení práce s mikroskopem (na konci praktika), nastavte objektiv 4x ztlumte intenzitu osvětlení, zhasněte světlo, přikryjte mikroskop obalem. • Na konci praktika bude krabice s preparáty zkontrolována za přítomnosti studenta, který s ní pracoval. Teprve pak může student opustit pracovní místo. Instrukce 1.Na začátku každého praktika zkontrolujte sadu preparátů a zjištěné závady (např.chybějící nebo rozbitý preparát) oznamte učiteli. 2.Z krabice lze vyjmout vždy pouze jeden preparát! 3.Preparát na stolku mikroskopu musí být vždy orientován krycím sklíčkem nahoru, tj. proti čočce objektivu. 4.Při manipulaci s preparáty buďte maximálně opatrní; v případě poškození preparátu informujte učitele. 5.Na konci každého praktika nechte krabici s preparáty otevřenou ke kontrole, během níž musí student zůstat na svém pracovním místě. PRAVIDLA PRO ZACHÁZENÍ S PREPARÁTY image002 http://www.siumed.edu/~dking2/bluehist/epithel3.gif ZOBRAZENÍ 3D ÚTVARŮ V 2D ROVINĚ ŘEZU 2 – Apex linguae (HE) 11 – Oesophagus (HEŠ) 99 – Pupečník (AZAN) 76 – Cortex cerebri (impregnace) 49 – Vagina – glykogen ( Bestův karmín) Preparáty : Základní barvicí metody v histologii Práce se světelným mikroskopem