Klinická biochemie Kapitola 14: Lipidy 14-1 Pavel Nezbeda Kapitola 14 Lipidy Do skupiny lipidů patří látky poměrně různorodého složení. Z uvedené tabulky zjistíme, že většina z nich jsou estery mastných kyselin s glycerolem (glycerolipidy), sfingosinem (sfingolipidy), cholesterolem (estery cholesterolu) či vyššími alkoholy (vosky). Často obsahují různé cukry (glykolipidy), kyselinu fosforečnou (fosfolipidy), případně další složky, jako jsou etanolamin (fosfatidyletanolaminy), cholin (fosfatidylcholiny), serin (fosfatidylseriny), kyselina sírová (sulfamidy), étery (plasmalogeny) aj. Společnou vlastností lipidů je jejich relativní nerozpustnost ve vodě a dobrá rozpustnost v tzv. tukových rozpouštědlech, tj. v nepolárních rozpouštědlech typu éteru, benzenu, chloroformu. Vysvětlivky k tabulce: Isoprenoidní– základem této skupiny lipidů je isopren (jako výchozí složka syntézy) Glyko- v lipidech je obsažena glycidová složka Fosfo – v lipidech je obsažen fosforečnan (fosfát) Sfingo – v lipidech je obsažen alkohol sfingosin Glycero – v lipidech je obsažen alkohol glycerol Tělesné lipidy pocházejí z tuků v potravě, které byly stráveny, vstřebány ve střevě a chemicky pozměněny a z vlastní biosyntézy ze sacharidů a z proteinů. Význam lipidů je široký:  triacylglyceroly o jsou významným (primárním) zdrojem energie o představují hlavní zásobu energie  fosfolipidy a cholesterol se vyskytují ve značném množství v membránách buněk a buněčných organel (strukturní lipidy)  cholesterol je navíc prekursorem steroidních hormonů  lipidy o mají izolační vlastnosti (ochrana orgánů před mechanickým šokem, tepelná izolace) o usnadňují tok elektronů podél nervových drah Změny ve spektru plazmatických lipidů, ať jsou změnami primárními (na genetickém podkladu), či sekundárními (způsobené chorobami, nezdravým životním stylem či jinými činiteli), znamenají vždy pro jejich nositele větší či menší riziko onemocnění vážnými chorobami, často s fatálními důsledky. Míněny jsou zejména ateroskleróza, ischemická choroba srdeční a infarkt myokardu. Účast jednotlivých lipidů, především lipoproteinů, na tomto riziku, bude u jednotlivých zástupců stručně zmíněna jako tzv. aterogenita. Místo obvyklých „referenčních mezí“ jsou uváděny „hodnoticí meze“, což jsou hodnoty, které se sice v průměru u populace asi nenacházejí, ale nacházet by se měly, má-li být daná populace zdravá. Lipidy Stavební složky nebo produkty metabolism u lipidů Isoprenoidní lipidy Složité lipidy Neutrální tuky Vosky Estery mastných kyselin Sfingolipidy Glycerolipidy Uhlovodíky Vyšší alkoholy Vyšší aldehydy Mastné kyseliny Prostaglan- diny Steroidy Karote- noidy Cerebrosidy Sulfatidy Ceramido- oligo- sacharidy Gangliosidy Fosfatidyl- choliny Fosfatidy- letanol- aminy Fosfatidyl- seriny Fosfatidyl- inositoly Fosfatidyl- glyceroly Estery glyceryl- eterů (plasmaloge ny) Sfingo- myeliny Metyl a etyl estery vyšších alkoholů s vyššími mastnými kyselinami FosfolipidyGlykolipidy Estery chole- sterolu Monoacy- lglyceroly Diacyl- glyceroly Triacyl- glyceroly Diolové lipidy Klinická biochemie Kapitola 14: Lipidy 14-2 Pavel Nezbeda Hodnoticí meze jsou kombinací mezí referenčních a hodnot optimálních, získaných z doporučení pro prevenci a léčbu kardiovaskulárních chorob. Nicméně odborné názory na tuto stránku problému se v posledních létech prudce mění. K podrobnějšímu vysvětlení pojmu „hodnoticí meze“ viz Doporučení ČSKB na (WEB) stránkách ČSKB. Diagnóza, terapie a monitorování těchto chorob se do značné míry opírá o laboratorní nálezy, proto je pro laboratorní pracovníky vhodné, aby se seznámili se základní chemií lipidů, s principy jejich metabolismu a s metodami jejich laboratorního stanovení. Něco z těchto požadavků již splnila obecná biochemie a některé další podrobnosti jsou, alespoň ve stručnosti, uvedeny v dalším textu. Z klinicko-biochemického hlediska mají význam především mastné kyseliny, triacylglyceroly (triglyceridy), cholesterol, fosfolipidy (fosfatidy) a sfingolipidy, z hlediska rutinní klinicko-biochemické praxe pak triacylglyceroly a cholesterol ve všech formách. Nauka o lipidech je poněkud komplikovaná, takže tato kapitola má svou specifickou skladbu. V úvodu budou nejprve stručně probrány základní vlastnosti cholesterolu a triacylglycerolů a metody jejich stanovení. Dále bude zmínka o mastných kyselinách a fosfolipidech. Následně budou probrány apoproteiny, jejich vlastnosti a metody stanovení a nakonec lipoproteiny, jejich vlastnosti, původ, metabolismus a metody stanovení. Přehled o celé látce si může student udělat pomocí závěrečného stručného shrnutí na konci kapitoly. 14.1. Cholesterol je živočišný sterol Cholesterol je živočišný sterol s 27 uhlíky, jednou dvojnou vazbou a jednou alkoholickou skupinou. RCOOH = mastná kyselina, nejčastěji kyselina linolová nebo linolenová: Cholesterol se vyskytuje prakticky v každé tělesné buňce, zvláště hojný je v nervové tkáni, pro mozek je naprosto nezbytný. Syntézy je schopna každá živočišná buňka, probíhá však zejména v hepatocytech, v enterocytech a v nervové tkáni. Náznak syntézy cholesterolu v organismu HMG-CoA-reduktáza H3C - CO~SCoA -hydroxy--metyl-glutaryl CoA kyselina mevalonová acetylkoenzym A 2 NADPH + H+ 2 NADP+ chhoolleesstteerrooll 7-dehydrocholesterol skvalen *) HMG-CoA-reduktáza = -hydroxy-methyl-glutaryl-CoA-reduktáza, resp.3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA-reduktáza, klíčový enzym v metabolismu cholesterolu – plná šipka naznačuje regulaci zpětnou vazbou (cholesterol, produkt, ale i exogenní cholesterol, potlačuje tvorbu enzymu); enzym má poločas několik hodin a jeho nízká hladina znamená nízkou syntézu cholesterolu a opačně; schopnost syntézy tohoto enzymu mají zřejmě všechny buňky. Aktivita tohoto enzymu je zvýšena také při vysokoenergetické dietě a u obezity. Čárkované šipky naznačují, že metabolická cesta obsahuje ještě další meziprodukty (cesta není znázorněna úplná). OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 Cholesterol (vitamín D) C5 C6 R O CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 O Ester cholesterolu CH3 O OH CH3 O OH Kyselina linolová Kyselina linolenová Klinická biochemie Kapitola 14: Lipidy 14-3 Pavel Nezbeda Syntéza v jiných tkáních probíhá při jeho nedostatku. Začíná postupnou kondenzací tří molekul acetylkoenzymu A („aktivované kyseliny octové“) na další makroergickou sloučeninu, -hydroxy-metylglutarylCoA. Z této látky, za přispění enzymu HMG-CoA-reduktázy *) , vzniká kyselina mevalonová, klíčová látka pro syntézu izoprenoidů (mezi které cholesterol patří). Zmíněný enzym je alostericky ovlivňován cholesterolem, takže při jeho nadbytku je syntéza cholesterolu utlumena. Naopak, při nedostatku cholesterolu je enzym aktivní a syntéza cholesterolu probíhá. Aktivita enzymu je zvýšená také při vysokoenergetické dietě a u obezity. Systematický název cholesterolu je 3-hydroxy-5,6-cholesten. Je typickým produktem živočišného metabolismu a prekurzorem všech ostatních steroidů v těle (kortikoidů, pohlavních hormonů, žlučových kyselin a vitamínu - hormonu D). Je nezbytný pro syntézu všech lipoproteinů ve střevě a játrech. Umožňuje resorpci triacylglycerolů a v tucích rozpustných vitamínů ze střeva. Jako amfipatický lipid, (má hydrofobní i hydrofilní vlastnosti) je významnou složkou membrán a vnější vrstvy plazmatických lipoproteinů. Nachází se také v živočišných tucích, ne však v rostlinných. Vyskytuje se volný a esterifikovaný mastnými kyselinami (esterifikována je OH- skupina, označená ve vzorci na předchozí straně červenou šipkou), nejčastěji kyselinou linolovou nebo linolenovou. Esterifikovaný cholesterol je zásobní formou cholesterolu ve většině tkání, především v hepatocytech. V transportní formě lipidů, lipoproteinech, tvoří estery cholesterolu, jakožto nepolární lipidy, jádro lipoproteinu, částečně polární volný cholesterol je v obalu lipoproteinu. Z organismu se cholesterol vylučuje žlučí ve formě žlučových kyselin, resp. solí žlučových kyselin (žlučové soli, viz také Kapitola 12, str. 12-30), a také jako cholesterol, který se ovšem ve střevě mění činností bakterií na koprosterol (bakteriální redukce dvojné vazby mezi uhlíky C5 a C6). 14.1.1. Metody stanovení cholesterolu Původní neenzymové metody používaly agresivní reagencie (koncentrované kyseliny), nebyly příliš specifické a nehodily se k automatizaci. Byly nahrazeny moderními, specifickými, enzymovými metodami, vyvinutými zejména pro využití v automatických analyzátorech. Neenzymové metody stanovení cholesterolu a jejich principy  Liebermannova-Buchardova reakce: Cholesterol, kyselina sírová a anhydrid kyseliny octové spolu reagují za vzniku zeleného zbarvení.  Zlatkisova reakce: Cholesterol, kyselina sírová, ledová kyselina octová a Fe 3+ poskytují červené zbarvení. Bilirubin a hemoglobin v obou případech falešně zvyšují výsledky stanovení cholesterolu. Obě metody se používaly v různých modifikacích, dnes jsou v rutinní praxi opuštěny a nahrazeny specifickými enzymovými metodami; reakce podle Liebermanna-Bucharda však tvoří součást referenční metody. Bývalá diagnostická souprava PLIVA-Lachema Diagnostika: Cholesterol (CHOL 150): Modifikace podle Liebermanna a Burcharda, kromě kyseliny sírové a anhydridu kyseliny octové (= acetanhydridu) vstupuje do reakce navíc 2,5dimethylbenzensulfonová kyselina, která potlačuje interferenci bílkovin. Zelené zbarvení je fotometrováno při 560 – 590 nm. Reakce probíhá asi 15 min, teplota se má pohybovat mezi 10 – 20 °C (nutné chlazení!), zbarvení je stálé 45 min. Interferuje bilirubin, hemoglobin (hemolýza vadí!) výsledek je závislý i na kvalitě chlazení. Referenční hodnoty pro tuto metodu uváděl výrobce v rozmezí 4,65 – 6,46 mmol cholesterolu/l (pro obě pohlaví) – viz poznámky dál. Referenční metoda pro stanovení celkového cholesterolu podle Abella-Kendalla/Leveye-Brodieho: Po extrakci cholesterolu a esterů cholesterolu ze séra se estery cholesterolu zhydrolyzují a barevnou LiebermannBuchardovou reakcí se stanoví celkový cholesterol. Tímto postupem dojde ke stejnému vybarvení obou složek (estery mají jinou výtěžnost v reakci s činidlem než volný cholesterol) a k odstranění interferencí. Klinická biochemie Kapitola 14: Lipidy 14-4 Pavel Nezbeda Princip enzymových metod stanovení cholesterolu V prvním kroku štěpí cholesterolesteráza estery cholesterolu na cholesterol a mastné kyseliny. V dalším kroku je cholesterol za přispění cholesteroloxidázy oxidován kyslíkem na cholestenon a peroxid vodíku. Peroxid vodíku se stanoví modifikovanou Trinderovou reakcí. Hodnoticí meze pro sérový celkový cholesterol: Dolní mez: 2,90 mmol/l Horní mez: 5,00 mmol/l Poznámka: současné poznatky nasvědčují tomu, že nedostatek cholesterolu vede k poškození mozku a kognitivních funkcí. Příklady diagnostických souprav ERBA Lachema : Cholesterol Liquid 250 (CHOL L 250), Cholesterol Liquid 1000 (CHOL L1000); Soupravy obsahující CHOD (cholesteroloxidázu) a POD (peroxidázu), s kapalnými reagenciemi (liquid = kapalný, kapalina); výsledné růžové zbarvení se fotometruje při 500 nm resp. při 546 nm. Podobné soupravy vyrábí řada dalších firem. 14.2. Triacylglyceroly jsou estery glycerolu a mastných kyselin Triacylglyceroly (triglyceridy) jsou estery trojsytného alkoholu glycerolu a mastných kyselin. Většina přírodních tuků jsou smíšené acylglyceroly, tzn., že mají v esterových pozicích různé mastné kyseliny. Nejčastěji bývá na prvním uhlíku kyselina palmitová, na druhém linolová a na třetím kyselina olejová. OCH CH2 O CH2 O C O O CH3 O CH3 O O CH3 OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 mastné kyseliny cholesterolesteráza O CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 O R + +H2O2 cholesteroloxidáza O2 modifikovaná Trinderova reakce estery cholesterolu cholesterol 4-cholesten-3-on peroxidáza R-CO2H chinoniminové barvivo O CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 kyselina palmitová Z hlediska stereochemie nejsou uhlíky C1 a C3 identické, enzymy je snadno rozlišují a jsou téměř vždy specifické pro některý z těchto uhlíků. Poslední uhlík ve vzorci mastné kyseliny bývá označován (omega). Během metabolizmu se uvolňují i částečné acylglyceroly, tj. monoacylglyceroly či diacylglyceroly. Triacylglyceroly jsou hlavní zásobní formou mastných kyselin, které jsou zase zásobní formou dostupné energie pro buňky. Příklad typického triacylglycerolu 1- palmitoyl-2-linoleoyl-3-oleoylglycerol C1 C3 kyselina linolová kyselina olejová glycerol Klinická biochemie Kapitola 14: Lipidy 14-5 Pavel Nezbeda Triacylglyceroly získává organismus z potravy (exogenní triacylglyceroly), a také si je sám syntetizuje z mastných kyselin a glycerolu (endogenní triacylglyceroly). Syntéza triacylglycerolů probíhá v játrech a v enterocytech. Při trávení se tuky rozštěpí na mastné kyseliny a monoacylglyceroly a pasivně vstupují do enterocytů. Mastné kyseliny s krátkým řetězcem se vstřebávají přímo do portální krve (jsou poměrně dobře rozpustné ve vodě) a putují do jater. Monoaclyglyceroly a mastné kyseliny s dlouhým řetězcem, které jsou nerozpustné ve vodě, jsou v enterocytech sliznice tenkého střeva resyntetizovány na triacylglyceroly a zabudovány do jádra chylomikronů, transportní formy (externě přijatých) lipidů nerozpustných ve vodě. Podobným způsobem jsou zpracovány také estery cholesterolu a vitamíny rozpustné v tucích. Hlavní zásobárnou triacylglycerolů v těle je tuková tkáň. Tato tkáň je aktivní, dochází zde neustále k rozkladu a syntéze, k lipolýze a esterifikaci, což jsou dva rozdílné děje, s různými reaktanty a enzymy. Nejedná se o jednu zvratně probíhající reakci. Výsledkem obou dějů je hladina volných mastných kyselin v krevní plazmě, která dále ovlivňuje metabolismus jiných tkání, např. jater a svalů. V metabolismu tukové tkáně se uplatňuje řada hormonů, zejména insulin, který inhibuje lipolýzu, konkrétně inhibuje hormonsenzitivní lipázu, která je aktivní pouze při nízkých koncentracích inzulínu (např. při hladovění). Naopak gukokortikoidy a hormony štítné žlázy lipolýzu podporují. Dalšími hormony jsou adiponektin a leptin, peptidové hormony, které jsou předmětem značného zájmu výzkumníků z oblasti lipidového metabolismu a nutrice. Oba se tvoří v adipocytech (tukových buňkách) a patří tak mezi tzv. adipokiny, tj. látky tvořené tukovými buňkami. Leptin působí na hypotalamus a zřejmě reaguje především na energetický deficit organismu. Popsán byl v roce 1994. Adiponektin byl objeven v polovině 90. let minulého století a jeho funkce je zejména ochranná (potlačení produkce kyslíkových radikálů, snižování hladiny adhesivních molekul, stimulace protizánětlivých interleukinů aj.). Metabolismus tukové tkáně a faktory, které jej ovlivňují, mají značný význam pro celý organismus. Tukovou tkáň lze považovat za samostatný endokrinní orgán, jehož buňky (adipocyty), produkují řadu hormonálně aktivních látek, které ovlivňují nutriční stav jedince. Triacylglyceroly jsou vývojově primárním zdrojem energie, slouží také jako energetická zásoba pro organismus, podkožní tuk pak jako tepelná izolační vrstva. 14.2.1. Metody stanovení triacylglycerolů Klasické metody stanovení triaclyglycerolů byly poněkud komplikované, nespecifické, v automatických analyzátorech nepoužitelné. V současné denní laboratorní praxi byly nahrazeny metodami využívajícími enzymy. Enzymové metody jsou specifické, relativně jednoduché a nastavené pro použití v automatických analyzátorech. Extrakční metoda Pro zvídavé studenty – princip extrakční metody (neenzymová metoda pro stanovení triacylglycerolů) Obecný postup Souprava PLIVA-Lachema Diagnostika Triglyceridy 50 1. Extrakce lipidů Extrakce lipidů izopropanolem 2. Odstranění fosfolipidů adsorpcí na adsorbent Adsorpce fosfolipidů na oxid hlinitý (?), třepání na třepačce po dobu 10 – 15 min, centrifugace 3. Zmýdelnění triacylglycerolů Zahříváním při 60 °C s KOH po dobu 5 – 10 min 4. Vysrážení nebo vyvázání mastných kyselin Tvorba esterů s izopropanolem 5. Oxidace (zbylého) glycerolu jodistanem na formaldehyd Oxidační činidlo, 10 min při laboratorní teplotě 6. Stanovení formaldehydu barevnou reakcí Reakce formaldehydu s acetylacetonem za přítomnosti amonných iontů na světle žlutý 3,5-diacetyl-1,4dihydrolutidin (viz stanovení kyseliny močové), při 60 °C po dobu 30 minut; následuje fotometrie při 405 - 420 nm Klinická biochemie Kapitola 14: Lipidy 14-6 Pavel Nezbeda Chinoniminové barvivo Enzymové metody Princip enzymových metod lipoproteinová lipáza TAG/TG mastné kyseliny + glycerol ATP ADP glycerolfosfátoxidáza H2O2 + dihydroxyaceton glycerol-3-fosfát O2 + 4-aminofenazon, 3,5-dichlor-2-hydroxybenzensulfonová kyselina H2O2 POD modifikovaná Trinderova reakce Dg soupravy Erba-Lachema, s.r.o.: Triacylglyceroly Liquid 250 S (TG L 250 S), Triacylglyceroly Liquid 1000 (TG L 1000): metody s glycerolfosfátoxidázou a POD s kapalnými reagenciemi (liquid = kapalina, kapalný); fotometrie při 500, resp. při 546 nm. Hodnoticí meze pro sérové triacylglyceroly: Dolní mez: 0,45 mmol/lHorní mez: 1,70 mmol/l 14.3. Volné mastné kyseliny Mastné kyseliny jsou karboxylové kyseliny s dlouhými řetězci, nasycené i nenasycené. Pro organismus představují jeden ze základních energetických zdrojů (základní energetický zdroj pro srdeční a kosterní svalstvo). Jsou syntetizovány z dvouuhlíkatých štěpů, jejichž zdrojem je především glukóza. Hlavním místem syntézy je jaterní tkáň. V krvi jsou přepravovány ve vazbě na albumin, kdy jedna molekula albuminu může nést až 20 molekul mastných kyselin. Nevyužité mastné kyseliny jsou v játrech znovu zpracovány na triacylglyceroly a v této formě uloženy jako zásobní zdroj energie. Mastné kyseliny s dvojnými vazbami jsou, mimo jiné, prekurzory prostaglandinů a tvoří součást buněčných membrán. Ačkoliv jsou pro organismus důležité, ne všechny si je dokáže vytvořit a musí být přijímány potravou. Jsou pro organismus esenciální (Essential Fatty Acid, EFA). Esenciální: z latinského essentia, podstata věci = hlavní, důležitý, podstatný, základní, životně důležitý. V uvedeném kontextu (a podobných kontextech) znamená sloučeninu, která je pro organismus nezbytná, ale organismus ji musí přijímat zvenčí, nedokáže si ji sám vytvořit (esenciální aminokyseliny, esenciální mastné kyseliny). Referenční hodnoty: V krvi se nachází mezi 0.30 – 1,10 mmol/l volných mastných kyselin. Poznámka: Mastné kyseliny mají velmi krátký biologický poločas a již během první minuty je zmetabolizována asi jedna třetina množství, které vstoupilo do krve. Hladina v krvi je také značně závislá na fyzické aktivitě (cvičení, fyzické práci), na hladině krevní glukózy a na všech okolnostech, které mají za následek uvolnění adrenalinu. Mastná kyselina Počet uhlíků/počet dvojných vazeb Syntéza v organismu Palmitová 16/0 + Stearová 18/0 + Myristová 14/0 + Palmitoolejová 16/1 + Olejová 18/1 + Linolová 18/2 Arachidonová 20/4 Linolenová 18/3 Eicosapentaenová 20/5 Docosahexaenová 22/6 Pro zvídavé studenty: V případě vzácného onemocnění s defektem glycerolkinázy charakterizovaného vysokou glycerolémií budou výsledky stanovení triaclyglycerolů vysoké, chylozita séra však nebude odpovídat nalezeným hodnotám. Reakce glycerol  glycerol-3-fosfát probíhá i v organismu. U zmíněné poruchy je přeměna na fosforylovaný glycerol nedostatečná (je defektní enzym glycerolkináza), glycerol zůstává v séru, jeho hladina již není zanedbatelná a (falešně) navyšuje výsledek. glycerolkináza Triacylglycerol/Triglycerid glycerolkináza Klinická biochemie Kapitola 14: Lipidy 14-7 Pavel Nezbeda 14.4. Fosfolipidy jsou estery mastných kyselin se sfingosinem nebo s glycerolem Fosfolipidy jsou estery mastných kyselin s alkoholem, kterým může být buď sfingosin (sfingomyeliny) nebo glycerol. Podle obsahu dalších látek v esterech s glycerolem pak rozeznáváme dále např. fosfatidylcholiny, fosfatidyletanolaminy, fosfatidylseriny, fosfatidyl-inositoly a další. 14.5. Všechny plazmatické lipidy se vážou na bílkoviny Vazbou na bílkoviny se stanou lipidy rozpustnými ve vodném prostředí a mohou být transportovány v extracelulární tekutině. Polární lipidy (neesterifikované mastné kyseliny, lyzolecitin) jsou transportovány albuminem, některé specifickým transportním proteinem (retinol binding protein, RBP, -globulin vázající retinol). Nepolární lipidy (triaclyglyceroly, estery cholesterolu) jsou transportovány makromolekulárními útvary, lipoproteiny, ve kterých jsou vázány na bílkoviny zvané apoproteiny (často se jím říká i apolipoproteiny). Plazmatické lipoproteiny se liší svou hustotou, relativním obsahem jednotlivých lipidů, typem bílkoviny (apoproteinu) a některými dalšími vlastnostmi. Dělení lipoproteinů do jednotlivých tříd vychází obvykle z rychlosti sedimentace při ultracentrifugaci v hustotním gradientu, ale je možné i na základě elektroforetické separace. Při elektroforetickém dělení se dosahuje vyššího počtu frakcí než při ultracentrifugaci, též názvosloví při tomto způsobu dělení je odlišné. Ultracentrifugace rozdělí lipoproteiny do pěti skupin, pěti základních typů nebo tříd lipoproteinů, které se liší jak svým složením, tak biologickou funkcí. Z hlediska klinického se liší např. svou schopností zasahovat do procesu aterosklerózy (aterogenitou). Hlavní „dopravní“ prostředky lipidů v plazmě jsou pro Volné mastné kyseliny Albumin Triacylglyceroly exogenní (z potravy) Chylomikrony Triacylglyceroly endogenní (z vlastní syntézy) VLDL Cholesterol Chylomikrony, VLDL, LDL, HDL Polární (hydrofilní) hlavička Nepolární (hydrofobní) konce Dvojná vazba Na obrázku vlevo je schematicky znázorněna molekula fosfatidylcholinu (lecitinu) s hydrofilní „hlavičkou“ a hydrofobním „koncem“. Tento charakter molekuly umožňuje látkám tohoto typu inkorporaci do buněčné membrány, lipoproteinu apod., kdy hydrofilní část je orientována do vodného prostředí a hydrofobní část je orientována do prostředí lipidového. Znázorněný fosfatidylcholin patří mezi nejčastěji se vyskytující fosfolipidy. Ačkoliv jsou z hlediska biologického fosfolipidy nesmírně důležité, z praktického hlediska laboratorní medicíny ve vztahu k poruchám lipidového metabolismu nemají prakticky žádný význam a jejich koncentrace v krvi se neměří. Fosfatidylcholin (lecitin); (Vzorec lecitinu je uveden v kapitole 15 na str. 15-19) CHOLIN FOSFÁT GLYCEROL Klinická biochemie Kapitola 14: Lipidy 14-8 Pavel Nezbeda Třídy lipoproteinů na základě dělení metodou ultracentrifugace  CL (ChyLomikrony, ChyLomikra)  VLDL (Very Low Density Lipoproteins = lipoproteiny o velmi nízké hustotě)  LDL (Low Density Lipoproteins = lipoproteiny o nízké hustotě)  IDL (Intermediate Density Lipoproteins = lipoproteiny o střední hustotě)  HDL (High Density Lipoproteins = lipoproteiny o vysoké hustotě Poznámka I: ultracentrifugací lze rozlišit ještě CL remnants (remnantní čili zbytková/é chylomikra/chylomikrony) Poznámka II: mezi hustotou a velikostí molekuly je vztah nepřímo úměrný – čím vyšší hustota, tím menší molekula a naopak Stavba lipoproteinů má v podstatě ve všech třídách stejnou strukturu – v jádru se nacházejí nepolární lipidy (triacylglyceroly, estery cholesterolu) a jádro je obklopeno jednoduchou vrstvou polárních lipidů (fosfolipidy, volný cholesterol) a bílkovin, apolipoproteinů (viz obrázek vpravo; srovnejte též se schématem stavby chylomikronu na str. 11-12 a schématem stavby LDL na str.11-14) Některé lipoproteiny jsou uspořádány ve dvojvrstvě, ve formě diskoidní (např. nascentní HDL) nebo vezikulární (váčkovité). Vlastnosti lipoproteinů jsou převážně určeny jejich bílkovinnou částí, apoproteiny. Ty jsou složeny buď z jednotlivých polypeptidových řetězců, nebo z několika neidentických polypeptidů. Systém a nomenklaturu do problematiky apolipoproteinů zavedl v roce 1971 Petar Alaupovic, Ph.D., vědec původem z Jugoslávie, dnes žijící v Okhlahoma City, člen mnoha významných vědeckých institucí a nositel mnoha vědeckých ocenění. Abecední nomenklatura třídí apoproteiny do skupin (rodin), které se označují velkými písmeny abecedy: A, B, C, D, E, F, G (apoA, apoB...), polypeptidové řetězce se označuji římskými číslicemi (A-I, A-II) a případné izoformy apoproteinů arabskými číslicemi 1, 2..). V rutinní biochemické laboratorní praxi se stanovují zejména apoproteiny typu A a B. Rovněž apoproteiny vykazují, jako jiné bílkoviny, polymorfismus, což má v některých případech závažné dopady na metabolismus lipidů a na zdravotní stav jedince (viz např. apoE). Hlavní funkcí apolipoproteinů je regulace metabolismu plazmatických lipidů a stabilizace lipidové emulze, což je zajištěno zejména tím, že apolipoproteiny  jsou, jak již bylo uvedeno, strukturálními částicemi amfipatických lipoproteinů, s hydrofobní stranou v kontaktu s vodním prostředím plazmy, což umožňuje transport ve vodě nerozpustných lipidů  slouží jako ligandy (ve smyslu ligand = signální spouštěcí molekula vázající se na vazebné místo cílového proteinu). Vážou se na specifické lipoproteinové receptory na povrchu prakticky všech somatických buněk. Vazba apoproteinu na lipoproteinový receptor je prvním krokem k využití lipidů buňkou  některé apoproteiny (apoA-I, C-I a C-II) jsou kofaktory lipolytických enzymů (lecitin:cholesterol acyltransferázy = LCAT, lipoproteinové lipázy = LPL) a zúčastňují se tak přímo lipoproteinového metabolismu. Schematické znázornění lipoproteinů Petar Alaupovic, Ph.D. Klinická biochemie Kapitola 14: Lipidy 14-9 Pavel Nezbeda 14.5.1. Apoproteiny a jejich základní charakteristiky ApoA-I je hlavní komponentou třídy HDL Tvoří se v tenkém střevě a v játrech v přibližně stejných množstvích. Je to hlavní komponenta třídy HDL, tvoří přibližně 30% HDL částice. Hlavní fyziologickou funkcí je příjem/odnímání volného cholesterolu z buněk/buňkám a slouží také jako kofaktor v reakci LCAT . Tyto procesy jsou důležité pro transport cholesterolu zpět do jater, což je činnost známá jako reversní cholesterolový transport. Je to hlavní antiaterogenní a antioxidační faktor v HDL. ApoA-II je druhou hlavní komponentou třídy HDL Tvoří se podobně jako apoA-I v tenkém střevě a v játrech. Je to druhý nejznámější apolipoprotein třídy HDL. ApoA-IV se nalézá především v chylomikronech Tvoří se v tenkém střevě (i když syntéza probíhá i v hypotalamu) a syntéza ve střevě je podporována aktivní absorpcí lipidů. Nalézá se především ve vazbě s chylomikrony, ale také v malých HDL a ve frakci séra neobsahující lipoproteiny. ApoA-IV je aktivátorem LCAT. ApoB je hlavní komponentou LDL a IDL, je rovněž důležitou komponentou VLDL a chylomikronů a vyskytuje se ve dvou formách  apoB100, která se nachází ve VLDL a LDL, tvoří se v játrech; vazby s lipidovým jádrem částice jsou extrémně stabilní; zřejmě díky této silné vazbě k lipidovému jádru se apoB nevyměňuje během metabolismu mezi jednotlivými lipoproteiny - apoB48, která se nachází v chylomikronech a tvoří se v játrech jako N-terminální polovina apoB100. ApoB se zdá být nezbytným pro tvorbu lipoproteinů bohatých triacylglyceroly (CL, VLDL), současně je také ligandem B, E receptoru (zvaného též LDL receptor). Existuje genetický polymorfismus apoB, vedoucí k různým afinitám k tomuto receptoru a tím následně k různým rychlostem katabolismu LDL v buňkách. Platí: čím pomalejší katabolismus, tím vyšší aterogenita částice. ApoC se vyskytuje především v HDL Tvoří se převážně v játrech. Tato třída apolipoproteinů obsahuje tři malé peptidy značené C-I, C-II a C-III, které se téměř vždy vyskytují pospolu. Nacházejí se především v HDL. C-I aktivuje LCAT a inhibuje fosfolipázu A2, C-II je hlavním kofaktorem lipoproteinové lipázy (LPL) a C-III chrání tzv. zbytky (remnants) od předčasného odklizení játry tím, že naopak aktivitu endoteliální lipoproteinové lipázy inhibuje. ApoE je rovnoměrně rozdělen mezi částice VLDL a HDL Tvoří se převážně v játrech a je distribuován rovnoměrně mezi VLDL a HDL částice. Podobně jako u apoC dochází i u apoE k výměnám mezi těmito hustotními třídami. Působí jako ligand pro dva rozdílné receptory, a to pro zbytkový (remnant) receptor a pro B,E receptor. Existuje genetický polymorfismus apoE: jsou známy 3 alely (označené -2, -3 a -4) jejichž produktem jsou tři proteiny lišící se v jedné aminokyselině a v afinitě k receptoru. Alela 2 provází hypetriglyceridémii a alela 4 hypercholesterolémii. Apoprotein(a) (apoprotein „malé a“) je vysoce aterogenní. Je to glykoprotein s vysokým obsahem kyseliny neuraminové, rozpustný ve vodě. Molekulová hmotnost je variabilní a pohybuje se mezi 300 až 700 kD. Je syntetizován v játrech. Kyselina neuraminová je kondenzační produkt mannosaminu a pyruvátu, součást glykoproteinů a glykolipidů. Umělecké ztvárnění molekuly Apolipoproteinu AI (Apo AI ve vodě) http://www.komsta.net/chemwalls/apolipo2- 1280.jpg Klinická biochemie Kapitola 14: Lipidy 14-10 Pavel Nezbeda 14.5.1.1. Metody stanovení apolipoproteinů Pro prognostiku vývoje poruchy v metabolismu lipidů má význam především stanovení apolipoproteinu A-I a apolipoproteinu B (apoB100). Tyto bílkoviny se stanovují imunochemicky, v rutinní praxi většinou (homogenní) zákalovou metodou v roztoku, tj. turbidimetricky (imunotrubidimetrie). Používají se specifické protilátky od různých výrobců (Dako, Orion, Immunotech aj.), většinou vázané na latexové částice ((PETIA, viz kapitola 10, str.10-21). Metody lze aplikovat na automatické biochemické analyzátory, případně lze používat specializované fotometry různých výrobců i běžné fotometry či nákladnější, ale přesnější, nefelometry. V současné době se od stanovení apoA i apoB v rutinní praxi upouští a provádí se spíše ve specializovaných laboratorních provozech navázaných na příslušné odborníky (metabolické poradny). Hodnoticí meze: ApoA1 ApoB Muži Ženy Dolní mez: 1,00 g/l 1,10 g/l 0,50 g/l Horní mez: 1,70 g/l 1,90 g/l 1,00 g/l Některé základní vlastnosti apolipoproteinů Výskyt Apolipo protein Místo syntézy Moleku- lární hmotnost [D] Počet amino kyseli n Chr omo zom Funkce Střední normální koncentrace v plazmě [mg/l HDL, chylomikrony A-I Tenké střevo, játra 28 300 243 11 Aktivace lecitin cholesterol acyltransferázy (LCAT), transport lipidů, ligand pro HDL receptor, stabilizace prostacyklinů, strukturální bílkovina 1000 – 1600 HDL A-II Tenké střevo, játra 17 000 77 1 Strukturální bílkovina, ligand pro HDL receptor, aktivace jaterní lipázy? 300 – 500 Chylomikrony HDL, VLDL, frakce séra s volnými lipoproteiny A-IV Tenké střevo 46 000 376 ? Aktivace LCAT, ligand pro HDL receptor, metabolismus triacylglycerolů asi 150 LDL, VLDL B 100 Játra 549 000 4536 2 Sekrece triacylglycerolů a cholesterolu z jater a tenkého střeva, absorpce lipidů, vazba na B/E receptor, aktivace lysolecitin acyltransferázy 500 - 900 Chylomikrony B 48 Tenké střevo 265 000 - 2 Vazba na B,E-receptor Chylomikrony VLDL, HDL C-I Játra, nadledviny 6 500 57 19 Potlačení vazby vznikajících lipoproteinů na LDL receptor a na LRP, aktivace LCAT <100 Chylomikrony VLDL, HDL C-II Játra 8 800 79 19 Aktivace LPL 30 – 80 Chylomikrony VLDL, HDL C-III 0,1,2 Játra 8 900 99 11 Inhibice LPL aktivity, interference s lipoproteiny na jaterních receptorech 80 – 150 HDL3 Ledviny, pankreas, střevo, mozek, varlata, nadledviny 2 000 - 3 LCAT aktivátor asi 100 VLDL, chylomikrony Játra,periferní tkáně 36 500 299 19 Vazba na B/E a E receptory Odstranění cholesterolu s periferních buněk 30 – 50 Lp(a) Játra 270 000 - 700 000 8 ? <300 Klinická biochemie Kapitola 14: Lipidy 14-11 Pavel Nezbeda 14.5.2. Lipoproteiny a jejich základní charakteristiky Již v úvodu kapitoly byla naznačena (víceméně jednotná) stavba jednotlivých tříd lipoproteinů. Následující tabulky přehledně uvádějí průměrné složení jednotlivých lipoproteinů a jejich vlastnosti. Složení jednotlivých tříd lipoproteinů Další pohled na některé vlastnosti lipoproteinů Vysvětlivky: V horní tabulce je uvedeno procentové zastoupení jednotlivých lipidů a celkových proteinů; je uvedeno zastoupení apoproteinů (před závorkou je uvedena převažující složka); uváděné složení jednotlivých lipoproteinů se může poněkud lišit podle autorů. V dolní tabulce jsou některé aspekty horní tabulky rozvedeny podrobněji. Poznámka: Flotace odkazuje na ultracentrifugaci v solném gradientu: částice se „vznášejí“ tj. „flotují“ v roztoku o uvedené hustotě, čili v podstatě vyjadřuje relativní hustotu konkrétní třídy částic. Tato hustota se pohybuje mezi hustotou lipidů (<99 g/ml) a hustotou bílkovin (>1,28 g/ml). Rozdíly v hustotě jsou způsobeny různým poměrem protein-lipid (P/L) v jednotlivých částicích. Čím větší obsah lipidů, tím lehčí částice. 14.5.3. Metabolismus lipoproteinů je komplikovaný Během metabolismu lipoproteinů dochází v krevním řečišti k intenzivním výměnám mezi jednotlivými třídami lipoproteinů, a to jak apoproteinů (zejména C rodiny), tak lipidů (cholesterolu, triacylglycerolů, fosfolipidů). Tyto výměny úzce souvisí s intravaskulární degradací lipoproteinů a jejich využitím periferními tkáněmi. Je důležité připomenout si, že regulace metabolismu plazmatických lipidů je jednou ze tří hlavních funkcí apoproteinů, bílkovinné složky lipoproteinu. Klíčovou roli v metabolismu lipoproteinů hrají lipoproteinové receptory Lipoproteinové receptory na povrchu buněk jsou rozhodující pro udržení homeostázy plazmatických lipoproteinů a pro buněčný metabolismus. CHYLOMIKRA VLDL LDL HDL Apoprotein C, B, A C, B (E, D, A) B (C, E, D, A) A (C, B, D, E) Triacylglyceroly 0,86 0,53 0,06 0,04 Cholesterol 0,02 0,07 0,08 0,04 Cholesterol-ester 0,03 0,14 0,42 0,15 Fosfolipidy 0,07 0,18 0,22 0,30 Proteiny 0,02 0,08 0,22 0,47 Lipoprotein Flotace () v [g/ml] Obsah lipidů (L) [%] Obsah proteinů (P) [%] Poměr P/L Chylomikra 0,95 g 98 – 99,5 9,5 – 2 1 : 100 VLDL 0,95 – 1,006 90 – 92 8 - 10 1 : 9 IDL 1,006 – 1,019 různý různý není konstantní LDL 1,019 – 1,063 80 20 1 : 4 HDL 1,063 – 1,210 50 50 1 : 1 HDL1 (HDLC) 1,055 - 1,085 HDL2 1,063 – 1,120 HDL3 1,120 – 1,210 Lp(a) 1,055 – 1,110 80 20 1 : 4 Klinická biochemie Kapitola 14: Lipidy 14-12 Pavel Nezbeda Nejlépe prozkoumaným je LDL receptor (LDLR, apoB,E receptor). Jedná se o glykoprotein (o 839 aminokyselinách) vyskytující se na většině tělesných buněk. Patří do tzv. rodiny LDL receptorů, která obsahuje celkem sedm členů. Prostřednictvím tohoto receptoru se dostává cholesterol (endocytózou) dovnitř buňky. Pro vazbu na receptor je nutný apoB100, hlavní apoprotein třídy LDL. Receptor rozeznává i apoE, který je součástí chylomikronových zbytků (chylomicron remnants) a IDL (VLDL remnants). Má dvě funkce: poptávkou regulované doručení cholesterolu do buněk a tkání a regulaci hladiny cholesterolu v krevním řečišti. LDL receptory syntetizuje buňka při nedostatečné nabídce cholesterolu. Volný cholesterol inhibuje syntézu jak receptorů, tak HMG-CoA reduktázy (viz), tzn., že počet receptorů je regulován obsahem cholesterolu a požadavky buněk na cholesterol. Nedostatek cholesterolu vyvolá v buňce jak syntézu vlastního cholesterolu, tak syntézu receptorů. Naopak přebytek cholesterolu je acylCoA-acyltransferázou (ACAT) esterifikován mastnými kyselinami a převeden tak na skladovací (depotní) formu. To chrání buňky před jejich zahlcením volným cholesterolem. Za identifikaci LDL receptoru a jeho vztahu k metabolismu cholesterolu a familiární hypercholesterolemii obdrželi v roce 1985 Michael Stuart Brown a Joseph Leonard Goldstein Nobelovu cenu za fyziologii a medicínu. Pro zvídavé studenty: Kromě apoB100, hlavního apolipoproteinu LDL, váže LDL receptor také apoE, a proto se nazývá také apoB100-E receptor. Lipoproteiny bohaté apoE se vážou 100x silněji, čehož výsledkem je akcelerace vychytávání VLDL zbytků a IDL. Nejvyšší hustota receptorů je v nadledvině a ve vaječnících, ale nejvyšší počet receptorů LDL obsahují játra. LDL receptory se kupí v tzv. coated pits (potažených jamkách, viz obrázek na str. 11-31), které se po vazbě LDL dostanou do nitra buňky ve formě endosomů (buněčná organela, do níž putují endocytotické váčky). Uvnitř buňky se receptory oddělí od ligandů a mohou být znovu použity (recyklace receptorů). Endosomy se sloučí (sfúzují) s lyzosomy, které obsahují paletu enzymů, schopných rozštěpit proteiny a lipidy, zvl. estery cholesterolu. Pro zvídavé studenty: Pacienti s kongenitální receptorovou deficiencí jsou schopni katabolizovat chylomikronové zbytky a další lipoproteiny obsahující apoE. Umožňuje to Lipoprotein receptor-related protein (LRP). LRP , který patří do rodiny LDL receptorů, je multifunkční: váže apoE, LPL, HTGL, apoB100 a apo(a). Nachází se v mnoha tkáních včetně neuronů a astrocytů. Vzhledem k velkému počtu ligand je úkol tohoto receptoru zřejmě daleko širší než jen pouhé čištění od chylomikronových zbytků. VLDL receptor je transmembránový lipoprotein, který také patří do rodiny LDL receptorů, se nachází v endoteliálních buňkách mimojaterních orgánů (srdce, kosterní svalstvo, mozek, makrofágy), v játrech se nevyskytuje. Objeven byl v roce 1992. Hraje důležitou roli při metabolismu cholesterolu, metabolismu lipoproteinů bohatých na triaclyglyceroly obsahujících apoE a při neuronové migraci (způsob, kterým neurony cestují z místa svého vzniku do své konečné pozice v mozku) při vývoji mozku. Chylomikrony transportují triacylglyceroly přijaté potravou Chylomikrony jsou bohaté triacylglyceroly (přijaté potravou), které transportují. Z apoproteinů obsahují zejména A-I, A-II, A-IV a B48. ApoB48 se vyskytuje pouze v chylomikronech. Na séru stojícím přes noc při 4 °C tvoří chylomikrony krémovou vrstvu. Chylomikrony se tvoří v tenkém střevě v buňkách střevní mukózy, především jako reakce na lipidy přijaté potravou. Syntéza neprobíhá kontinuálně a závisí na množství neutrálních tuků, které mají být absorbovány. Proteiny a fosfolipidy spolutvořící chylomikrony jsou syntetizovány v enterocytech. Kapacita syntézy je omezena, takže se vrůstající nabídkou triacylglycerolů nedochází k produkci vyššího počtu částic, ale k růstu jejich velikosti (až do 1 m). Chylomikrony vstupují do systémové cirkulace prostřednictvím ductus thoraticus (hrudní mízovod sbírající mízu/lymfu z většiny organismu a ústící do žilního systému) a poté recirkulují do jater. Po vstupu do krve ztrácejí apoA-IV a apoA-I Chylomikron je typickým představitelem lipoproteinových částic M. S. Brown J. L. Goldstein Klinická biochemie Kapitola 14: Lipidy 14-13 Pavel Nezbeda a naopak získávají apoC a apoE z HDL částic.. ApoC-II aktivuje v přítomnosti fosfolipidů lipoproteinovou lipázu (LPL) v kapilární stěně, která hydrolyzuje většinu triaclyglycerolů v jádru chylomikronů. Uvolněné mastné kyseliny jsou vychytávány zejména tukovou tkání a svalovými buňkami, glycerol je dopraven do jater a do ledvin, kde je přeměněn na meziprodukt metabolismu glycidů, dihydroxyaceton fosfát. Během odevzdávání mastných kyselin jsou povrchové komponenty (apoC, apoA-I a také určité množství volného cholesterolu a podstatná část fosfolipidů) uvolněny a převedeny do částic HDL. Ztráta apoC-II zabraňuje lipoproteinové lipáze v další degradaci chylomikronových zbytků (remnants). Chylomikronové zbytky (remnantns), které obsahují zejména estery cholesterolu, apoE a apoB-48, jsou pak transportovány do jater, kde jsou degradovány. Částečně jsou zachytávány i fibroblasty a dalšími buňkami. Vazebné receptory jsou specifické pro apoE, nacházejí se v hepatocytech, fibroblastech i dalších buňkách. Zbytkové (remnantní) chylomikrony jsou pro hepatocyty hlavním zdrojem exogenního cholesterolu. Remnant (angl.) = zbytky, pozůstatky (čeho); zbytek; zbývající. Výslovnost: [remnent] Koncentrace chylomikronů v krvi, jejichž biologický poločas je asi půl hodiny, vrcholí ve zdravém organismu za 3 – 6 hodin po jídle. K úplnému odbourání dochází po 9 hodinách. Přítomnost chylomiker po dvanáctihodinovém lačnění (viz preanalytická fáze při stanovení lipidů – str. 11- 26 ) je patologická a její příčinou může být nedodržení zásad preanalytické fáze (nedodržení stanovené doby pro příjem potravy), nadměrný příjem alkoholu v předchozích dnech, případně chronický alkoholismus s jaterní steatózou, dekompenzovaný diabetes mellitus, nebo může jít o vrozenou vadu, jakou je vrozený defekt lipoproteinové lipázy nebo vrozený defekt apolipoproteinu C-II (jak víme, jde o aktivátor lipoproteinové lipázy). Vlastní chylomikrony nejsou aterogenní, ale jejich zbytky, remnants, jsou silně aterogenní. Mají sice velmi krátký biologický poločas, ale pokud je katabolismus chylomikronů zpomalen, vznikají remnanta bohatší cholesterolem a s menším obsahem triacylglycerolů a tyto částice výrazně zvyšují riziko kardiovaskulárních onemocnění. Laboratorně se mohou v tomto případě nacházet mírně zvýšené koncentrace triacylglycerolů, případně i celkového cholesterolu. játra tenké střevo A B48 Nascentní chylomikron HDL CE A I apoA A C E B48 apoA, C Chylomikron triacylglyceroly cholesterol E Zbytkový chylomikron Mimojaternítkáně Lipoproteinová lipáza mastné kyseliny Glycerol (játra, ledviny) Receptor pro zbytkový chylomikron; LRP (LDL receptor related protein) Lymfatické cesty fosfolipidy cholesterol triacylglyceroly cholesterol triacylglyceroly cholesterol Poznámka: cholesterolem se rozumí volný i esterifikovaný cholesterol; A, C, E, B48 = apolipoproteiny; pod částicemi jsou uvedeny nejvíce zastoupené lipidy v těchto částicích. B48 mastné kyseliny cholesterol apoA, C LRP ve fibroblastech a dalších buňkách Metabolismus chylomikronů Klinická biochemie Kapitola 14: Lipidy 14-14 Pavel Nezbeda VLDL transportují většinu jaterních triglyceridůTvoří se v játrech a transportují většinu triacylglycerolů tvořených (endogenní) lipogenesou, ke které dochází, když příjem tuků a sacharidů překročí potřeby organismu. Cholesterol nutný pro syntézu získávají z chylomikronových zbytků, IDL, LDL, HDL nebo z endogenní syntézy v hepatocytu. Z cirkulujících částic HDL se nově vytvořené částice VLDL také obohacují o apoproteiny C a apoE. Apoproteiny VLDL jsou apoB100, apoC-I, apoC-II, apoC-III a apoE. Kromě triacylglycerolů obsahují také trochu cholesterolu a jeho esterů. Triacylglyceroly jsou dopravovány do různých tkání, přednostně do tkáně svalové a tukové, kde jsou skladovány nebo použity k produkci energie. Předpokládá se, že část VLDL může být katabolizována prostřednictvím zmíněného tkáňového VLDL receptoru, většina VLDL se degraduje na IDL částice. Biologický poločas VLDL je asi 2 – 4 hodiny. VLDL mají menší proaterogenní potenciál než IDL a LDL, jejich zvýšená koncentrace v krvi však znamená také zvýšené riziko kardiovaskulárních onemocnění. Laboratorně se projevuje zvýšenou koncentrací triacylglycerolů, při závažnější poruše i celkového cholesterolu. Příčiny zvýšení frakce VLDL mohou být hypotyreóza, dekompenzovaný diabetes mellitus, hyperkorticizmus, estrogeny, renální insuficience, vysoký přívod sacharidů, obezita, alkoholizmus, vrozená hyperglyceridemie, vrozená kombinovaná hyperlipidemie. IDL se tvoří při metabolismu VLDL Lipoproteiny o střední hustotě, IDL, jsou degradačním produktem metabolismu lipoproteinů VLDL, kterým byla odebrána část triacylglycerolů. U zdravých jedinců se vyskytují ve velmi nízkých koncentracích. Jsou vychytávány převážně játry (receptor pro apoE) a degradovány. Část IDL je působením jaterní lipázy zbavena většiny zbývajících triacylglycerolů (jsou hydrolyzovány) a IDL se mění na částice LDL. Jsou katabolizovány v játrech i v mimojaterních tkáních. Část IDL se působením jaterní lipázy, která z nich odštěpuje další část triacylglycerolů, mění na lipoproteiny o nízké hustotě, LDL. IDL mohou výrazně akcelerovat aterosklerózu, vzhledem k velmi krátkému biologickému poločasu se však u zdravého jedince tímto způsobem neprojevují. Opačně tomu je v případě, že jejich koncentrace v krvi je zvýšená, jako tomu může být při vrozené hyperlipotroteinémii typu III (izolované zvýšení IDL), případně u hypotyreózy nebo zvýšené syntéze či zpomalené degradaci VLDL (zde jsou zvýšeny i další lipoproteiny). játra C E B100 Nascentní VLDL HDL CE A I apoA C E B100 apoC VLDL triacylglyceroly cholesterol E Zbytkový VLDL (IDL) Mimojaternítkáně Lipoproteinová lipáza Mastné kyselinyGlycerol (játra, ledviny) LDL receptory (apoB, E receptory) fosfolipidy cholesterol triacylglyceroly cholesterol triacylglyceroly cholesterol B100 mastné kyseliny cholesterol apoC, E B100 cholesterol Konečné odbourání v játrech, mimojaterních tkáních (např. lymfocyty, fibroblasty) pomocí endocytózy výměna apoproteinů LDL Metabolismus VLDL Klinická biochemie Kapitola 14: Lipidy 14-15 Pavel Nezbeda LDL přenášejí většinu cholesterolu nacházejícího se v krvi LDL jsou degradačním produktem IDL. Obsahují jediný apoprotein, apoB100. Přenášejí většinu cholesterolu nacházejícího se v krvi a dodávají ho periferním tkáním. Do buněk vstupují prostřednictvím LDL receptorů (zvaných též apoB,E receptory), na které se váže apoB100. LDL částice se liší ve velikosti, hustotě, složení a fyzikálně chemických vlastnostech. Lze rozlišit až 15 různých frakcí, ale většinou se rozlišují velké lehké LDL1 (obsahují kolem 2750 molekul cholesterolu na jednu apoB molekulu), malé husté LDL3, (obsahují kolem 650 cholesterolových molekul na molekulu apoB) a intermediární LDL2, s vlastnostmi mezi výše jmenovanými LDL. Složení v LDL částicích se liší od osoby k osobě. U lidí s normálními hodnotami lipidů se nachází přibližně stejné množství velkých a malých LDL. LDL3 obsahují méně cholesterolu než ostatní dvě skupiny a i při jejich zvýšené hodnotě v krvi může být cholesterolémie normální, což neplatí pro apoB100, jehož hodnoty bývají v těchto případech často zvýšeny. LDL3 mají zpomalený metabolismus, snadno pronikají přes cévní endotel, snadno podléhají oxidacím. Jsou velmi aterogenní. LDL jsou odbourávány v játrech (asi 2/3) a v periferních buňkách (asi 1/3). LDL pozměněné (např. glykací nebo oxidací) LDL receptory nerozpoznají a jsou katabolizovány tzv. scavengerovými receptory (viz obrázek na str. 11-16). Přes scavengerové receptory jsou odbourávány i malé densní částice LDL (LDL3). Tyto receptory se nacházejí na makrofázích a na buňkách cévního endotelu. Tato cesta katabolismu LDL urychluje rozvoj aterosklerózy. Příčinou zvýšené koncentrace LDL v krvi může být strava bohatá na cholesterol a nasycené tuky, obezita, hypotyreóza, nefrotický syndrom, familiární hypercholesterolémie, familiární defekt apoB100, polygenní hypercholesterolémie, vrozená kombinovaná hyperlipidémie aj. Poslední výzkumy ukazují, že mohutným zdrojem malých částic LDL je strava bohatá na sacharidy. Pro zvídavé studenty: LDL dopravuje do periferních buněk cholesterol a další LDL složky, včetně vitamínů rozpustných v tucích, velká část LDL však znovu prochází játry. Přibližně 60-90% katabolismu LDL je zprostředkováno receptory, 10- 40% je odstraňováno z plazmy tzv. odklízecí/scavenger cestou (ta je částečně znázorněna na obrázku na str. 11-15 a popsána na str. 11- 16). Rozsah katabolismu LDL závisí jak na apoB,E receptorech, tak na afinitě ligandu apoB. Bodová mutace genu produkujícího apoB100 má za následek značně sníženou schopnost vazby LDL na receptor. Vzhledem k tomu, že každá LDL částice obsahuje pouze jednu apoB100 molekulu, může tato mutace ovlivnit polovinu všech LDL částic. Tyto částice pak v krvi převládají, protože jsou degradovány mnohem pomaleji. Malé částice LDL se vážnou méně efektivně prostřednictvím receptoru B100 E, přežívají tedy v krevním oběhu déle, více podléhají změnám, a proto jsou více aterogenní než velké částice LDL. Tyto malé LDL částice jsou rovněž spojeny s diabetem mellitus. Jejich přítomnost je předzvěstí vzniku diabetu 2. typu. Při převaze malých LDL částic se rovněž vyskytuje hypertriglyceridemie a snížená koncentrace HDL cholesterolu. Zvýšený výskyt malých LDL částic je spojen jak s již zmíněným diabetem 2. typu, tak se vzrůstajícím věkem, s nesprávnou dietou (dieta se sníženým obsahem tuků vede k redukci těchto částic), do určité míry je i geneticky předurčen. Jediným apoproteinem, který v částici během celého procesu zůstává, je apoB, který se v závěru stává prakticky jediným apoproteinem v LDL. Dá se říci, že apoB100 je exkluzivním apolipoproteinem LDL částic. Nedávné studie prokazují, že vše je trochu jinak - vznik malých hustých částic LDL je spojen s příjmem sacharidů, přičemž cholesterol a nasycené tuky nehrají tak vážnou roli jak se dosud předpokládalo. HDL představuje velmi heterogenní populaci lipoproteinů Tvoří se v prekurzorové formě (prvotní diskoidní forma) v tenkém střevě a v játrech a částečně při metabolismu chylomikronů a je přeměňován na konečnou (sférickou) formu v plazmě. HDL představují velmi heterogenní populaci lipoproteinů. Jednotlivé částice mají různou velikost, různý proteinový obsah a lipidovou skladbu a zřetelně se liší ve svých funkcích. Podle složení, morfologie a funkčních vlastností se rozlišují tři subfrakce: HDL1, zvaná též HDLC, dále HDL2 a HDL3. Přitom neobsahují žádnou specifickou složku, která by zůstávala v částici v konstantním množství. Vystopovat metabolické cesty HDL je proto velmi nesnadné. HDL částice mají několik funkcí  jednou z hlavních je získávání cholesterolu z periferních tkání a jeho transport zpět do jater, kde může být s konečnou platností přeměněn na žlučové kyseliny a vyloučen; této roli se říká reverzní transport Jednotlivé barvy představují tmavě modrá = fosfatidylcholin světle modrá = sfingomyelin tmavě žlutá = estery cholesterolu červená = cholesterol zelená = triacylglyceroly šedá = apolipoprotein B-100 Zdroj: http://www.lce.hut.fi/research/sys bio/biospectroscopy/lipoprotein/ Schematický molekulární model LDL částice Klinická biochemie Kapitola 14: Lipidy 14-16 Pavel Nezbeda cholesterolu (RCT) a představuje hlavní ateroprotektivní funkci této třídy lipoproteinů; tuto funkci dále posiluje skutečnost, že HDL částice vykazují, zejména díky přítomnosti výše jmenovaných enzymů a faktorů, také protizánětlivé, antioxidační a vasodilatační účinky; nejmarkantnější ateroprotektivní účinky mají malé husté částice, označované jako HDL3  další důležitou funkcí HDL je fungovat jako cirkulující zásobárna apoC-I, apoC-II a apoE  HDL částice vykazují navíc i vlastnosti antiapoptotické, antitrombotické a antiinfekční. Prvotní proteinovou složkou HDL je apoA-I, který se tvoří v játrech a v enterocytech tenkého střeva. Nejprve vytváří částice téměř bez volného cholesterolu a jeho esterů. Postupný sběr lipidů a cholesterolu z periferních tkání vede k tvorbě nascentního (tj. nově vytvořeného) diskoidního HDL: lipidy jsou uspořádány do dvou vrstev, obtočených (nejčastěji) dvěma provazci bílkovin, takže výsledná konstituce se v elektronovém mikroskopu jeví jako disk. Proto se nazývá diskoidní HDL. Při svém dalším účinkování se HDL chová jako podomní obchodník, který cestou sbírá volný cholesterol z periferních buněk, upravuje ho (tvorba esterů cholesterolu) a (v této formě) uskladňuje, aby ho vzápětí vyměnil za triglyceridy, a přitom si také čile vyměňuje s ostatními lipoproteiny své proteinové složky, apolipoproteiny. Diskoidní HDL Legenda k obrázku pro zvídavé studenty HDL se tvoří v játrech a ve střevu ve formě diskoidních struktur bohatých na proteiny, tvořených primárně z apoA-I. ApoA-I interaguje s přenašečem ABCA1 (tak, jak je na obrázku naznačeno pro makrofág) a extrahuje cholesterol z buněk. Cholesterol spojený s apoA-I je účinkem LCAT esterifikován. Tento proces vede k tvorbě částic HDL3. Částice HDL3 se postupně obohacují cholesterolem a (účinkem LCAT) estery cholesterolu. Dále během cesty interagují s IDL a LDL, což je zprostředkováno CETP, který vyměňuje estery cholesterolu v HDL za triacylglyceroly z LDL. Tak se změní HDL3 na HDL2. HDL může získávat cholesterol z buněk také interakcí s ABCG1 (viz poznámka 1 dole). Tímto způsobem získává HDL z buněk přibližně 20% cholesterolu. Z oběhu je HDL vyjmut vazbou na jaterní scavenger/odklízecí receptor SR-B1. Cholesterolem bohaté IDL a LDL se mohou vrátit do jater vazbou na receptor pro LDL (LDLR). Tvorba ROS vede k oxidaci lipidových složek LDL a tvorbě oxidovaných LDL (oxLDL), které jsou odstraňovány makrofágy prostřednictvím scavengerových/odklízecích receptorů FAT/CG36. Úloha ABCA1 v reverzním transportu cholesterolu je zřejmá u jedinců s defektem příslušného genu. Tito jedinci trpí Tangierovou chorobou, která je typická dvěma klinickými znaky, tonzilami přesycenými lipidy a nízkou hladinou sérového HDL. HRHL = heparinem uvolnitelná jaterní lipáza; LCAT = lecitin cholesterolová acyltransferáza; LPL = lipoproteinová lipáza; HRHL hydrolyzuje triacylglyceroly, ale také fosfolipidy na povrchu HDL2, uvolňuje cholesterol, který je zachycen játry, což umožňuje tvorbu malých a hustších HDL3. Aktivitu HRHL zvyšují androgeny a snižují estrogeny (vyšší koncentrace plazmatických HDL2 u žen). Metabolismus HDL HDL3 CE HDL2 CE tenké střevo játra SR-B1 apoA-I fosfolipid LCAT diskoidní HDL CL, VLDL syntéza zbytky + glycerol + volné mastné kyseliny LPL tkáně cholesterol + estery, fosfolipidy; fosfolipidy; apoA-I cholesterol + estery, fosfolipidy; apoA-I Zbylé povrchové složky chylomikronů a VLDL syntéza apoA-I apoA-I LCAT LCAT tkáně cholesterol žlučový cholesterol a žlučové kyseliny odbourání HRHL Klinická biochemie Kapitola 14: Lipidy 14-17 Pavel Nezbeda U poruch lipidového metabolismu (viz str.11 - 25) může být hladina HDL změněna, tzn. zvýšená, nebo snížená, může být ale i normální. Zvýšení koncentrace HDL v krvi mohou mít na svědomí jak genetická determinace, tak pravidelná fyzická aktivita, strava bohatá na vícenenasycené mastné kyseliny, alkohol a estrogeny. Naopak snížení HDL může být způsobeno také genetickým základem, fyzickou inaktivitou, stravou bohatou na nasycené mastné kyseliny, kouřením, androgeny, hyperglyceridémií. Nejdůležitější biologickou funkcí HDL je udržení cholesterolové homeostázy, tj. odnímání volného cholesterolu periferním buňkám a jeho esterifikace, aby mohl být přenesen do VLDL, IDL a zbytků chylomiker a transportován do jater k eliminaci, kde mohou přímo končit i samotné HDL2 částice. Tento děj je řízen tzv. komplexem reverzního transportu cholesterolu, který sestává z lecitin cholesterolové acyltransferázy (LCAT), apoproteinů A-I, E a D, proteinů přenášejících lipidy (protein přenášející estery cholesterolu – CETP) a systému monocyty/makrofágy. Scavenger podle anglického slovníku znamená mrchožrout, zvíře živící se odpadem, počišťovač ulic, vybírač popelnic („kontyšák“) ap., což významově odpovídá úloze scavengerových receptorů. Výslovnost: [skævindže]. Poznámka pro zvídavé studenty: ABCA1, ABCG1, patří do tzv. ABC rodiny, resp. superrodiny, transportérů/přenašečů membránových proteinů, vyžadujících ke své činnosti energii z ATP. Obsahují oblast, na kterou se ATP váže. Energie získaná hydrolýzou ATP slouží k přenosu různých molekul přes buněčné membrány. Dělí se do sedmi skupin, značených písmeny A – G a každý člen má ještě své pořadové číslo (např. ABCG1, ABC přenašeč rodiny G, pořadové číslo 1. Právě přenos cholesterolu z povrchu buněčné membrány do HDL částic zahrnuje činnost ABCG1. Stránka o HDL a video: http://www.ks.uiuc.edu/Research/Lipoproteins/ Lipoprotein(a), Lp(a), obsahuje apoprotein(a) Lp(a) = s lipoproteinem asociovaný antigen); má obdobné složení jakou mají částice LDL, kromě apoB obsahuje navíc také apoprotein(a). O metabolismu lipoproteinu(a) je známo poměrně málo. Pro zvídavé studenty: Apo(a)-mRNA se nachází v játrech, ve stopách v mozku a ve varlatech. Význam přítomnosti této nukleové kyseliny v posledních dvou jmenovaných orgánech je nejasný. Jediným významným místem syntézy apo(a) jsou játra. Játra jsou i nejvýznamnějším producentem apoB100, druhého apoproteinu nacházejícího se v Lp(a). Výsledky experimentů naznačují, že apo(a) je secernován hepatocyty a na LDL částice se váže extracelulárně. Degradační cesta Lp(a) není jasná. Principiálně může být Detaily interakcí mezi HDL a LDL apoAI VLDL LDL HDL3 CE HDL2 CE IDL OXLDL OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 LCAT arteriální LPL ROS arteriální LPL střevo játra CETP cholesterol SR-B1 apoB-100 apoB-100 apoB-100 ABCA1 ABCG1 FAT_CD36 Makrofág LCAT LDLR apoA-I apoA-I apoA-I cholesterol nascentní HDL, pre-HDL HRHL LCAT = lecitin cholesterolová acyltransferáza; HRHL = heparinem uvolnitelná jaterní lipáza; CETP = protein přenášející estery cholesterolu; ABCA1 = ASTP-binding cassette transport protein A1t; ABCG1 = ASTP-binding cassette transport protein G1t; ROS = reactive oxide specimens, tj. látky s reaktivním kyslíkem, např. kyslíkové ionty a peroxidy; LDLR = receptor pro LDL (apoB,Ereceptor); FAT_CD36 = odklízecí receptor; SR-B1 = jaterní odklízecí receptor Klinická biochemie Kapitola 14: Lipidy 14-18 Pavel Nezbeda Lp(a) vychytáván LDL receptorem, ale zdá se, že tato degradační cesta hraje pouze podřadnou roli in vivo. Do nedávna se předpokládalo, že místem degradace Lp(a) mohou být další členové rodiny LDL receptorů (tj. VLDL receptor, receptor pro protein příbuzný LDL, megalin). Bez ohledu na otázku molekulárního receptoru pro Lp(a) není zodpovězena ani otázka orgánu, ve kterém je Lp(a) štěpen. Pozornost se nyní upírá na ledviny, jako možné místo katabolismu Lp(a). Lp(a) může mít přímý aterogenní účinek. Díky své strukturální podobnosti s plasminogenem může mít apo(a) trombogenní účinek. Mechanismus účinku aterogenního efektu však dosud není znám, existují vysvětlující hypotézy, které mají svá pro i proti. Každopádně platí, že lidé s vysokým Lp(a) (nad 300 mg/l) a zvláště lidé s vysokým Lp(a) i LDL současně mají obzvláště vysoké riziko kardiovaskulárního onemocnění. Přehled enzymů a transportní proteinů v lipoproteinovém metabolismu V předchozím textu jsme se setkali s některými enzymy a transportními proteiny důležitými v metabolizmu lipoproteinů a jejichž narušení může vést k patologickým stavům. Přehled a základní funkce jsou uvedeny v tabulce. Enzym/protein Kofaktor Funkce Postheparinové lipázy (PHL) Lipoproteinová lipáza (LPL) Jaterní triacylglycerolová lipáza (HTGL) Fosfolipázy ApoC-II Žádný kofaktor Hydrolýza exogenních triacylglycerolů v chylomikrech. Hydrolýza triacylglycerolů a fosfolipidů v IDL a HDL. Hydrolýza fosfolipidů, nejasná funkce v metabolismu lipoproteinů Lecitin-cholesterol-acyltransferáza (LCAT) ApoA-I (ApoA-IV, C-I, D) Tvorba více jak 80% esterů cholesterolu z volného cholesterolu a lecitinu, konverze HDL3 na HDL2 Přenašečové proteiny Protein přenášející estery cholesterolu Protein přenášející fosfolipidy Reaktant HDL/LCAT komplexu, výměna esterů cholesterolu z HDL za triacylglyceroly VLDL, výměna a přenos lipidů z jádra/core (částice) Výměna fosfolipidů mezi lipoproteinovými třídami, účast v transportu vitamínů rozpustných v tucích (tj. vitamínu E) Klinická biochemie Kapitola 14: Lipidy 14-19 Pavel Nezbeda Předchozí dílčí schémata vzájemných přeměn lipoproteinů jsou v následujícím schématu sloučena do zjednodušujícího přehledu. Odklízecí receptor = scavenger receptor periferní buňka střevní buňka jaterní buňkaLDL B100 10010 010 010 0 VLDL B100 1001 001 00 10 0 EC CHYLOMIKRONY B48 A CE C E chol+ estery fosfolipidy chol+ estery fosfolipidy cholesterol cholesterol TG TG odklízecí receptor Vysvětlivky: hlavní metabolická cesta; vzájemná výměna komponent (apoB se nevyměňuje!) LDL je částečně zpracováván játry odklízení nadbytku částic (přes tzv. „scavenger“ receptory) MK = (volné) mastné kyseliny; G = glycerol; kroužek s písmeny A, B48, B100, C, E = konkrétní apoprotein Tvorba A-I, A-II, B- 100, B-48, C-I, C-II, C-III, E, apo(a); z cholesterolu tvorba žlučových kyselin a odpad do střeva žlučovou cestou A A HDL3 A E C VLDL zbytek/ IDL B100 10010 010 010 0 TG MK = tuková či svalová tkáň G = ledviny 13 - 15% 80% 5- 7% LPL B48 CHOLE LPL HDL2 A E C LPL LCAT C E B48 CE A C A chol+ estery fosfolipidy LRP receptor MK = tuková či svalová tkáň G = ledvinynascentní HDL Chylomikronové zbytky Tvorba A, B48 TG; chol. TG Přehledné schéma metabolismu lipoproteinů Klinická biochemie Kapitola 14: Lipidy 14-20 Pavel Nezbeda 14.5.4. Metody stanovení lipoproteinů Ultracentrifugace tj. centrifugace s vysokou odstředivou silou (g), v hustotním gradientu, v běžné rutinní praxi se nepoužívá; dělení do tříd je uvedeno výš, jednotlivé frakce se dělí podle své hustoty. Elektroforetické dělení na různých nosičích. Elektroforeticky se rozdělí lipoproteiny do čtyř tříd, které odpovídají dělení podle výsledků ultracentrifugace (viz závorka): - chylomikrony (chylomikrony) - -lipoproteiny (LDL) směr - pre--lipoproteiny (VLDL) dělení - -lipoproteiny (HDL) Na základě ultracentrifugace a tomu odpovídajícího elektroforetického dělení (sér pacientů s poruchami metabolismu lipidů), rozlišoval Fredrickson pět typů hyperlipoproteinémií. Jednotlivé třídy se lišily podle obsahu příslušných lipoproteinů. Toto dělení se dnes již neužívá, elektroforéza lipoproteinů se však stále běžné provádí. start, chylomikrony -lipoproteiny, LDL pre--lipoproteiny, VLDL -lipoproteiny, HDL - + Schéma elektroforézy lipoproteinů normální Typ I Typ II Typ III Typ IV Typ V Vysvětlivky a poznámky představuje start dělení, případně na tomto místě zůstávají chylomikrony pre- jsou beta, pre-beta a alfa lipoproteiny (toto pojmenování je odvozeno právě z elektroforetické pohyblivosti: „alfa“ putují nejdál, před „beta“ jsou „pre-beta“).Charakter jednotlivých „čar“ na schématu naznačuje obrazec po výsledném barvení elektroforeogramu lipidovými barvivy (např. Sudanovou černí) Na obrázku vlevo je reálný elektroforeogram dělení lipoproteinů a Lp(a) na folii s agarosovým gelem Hydraqel 15 LIPO + Lp (a) firmy Sebia Lipoprotein (a) se stanovuje elektroforeticky nebo imunochemicky. Poloha frakce při elektroforetickém dělení je znázorněna na obrázku vlevo. Klinická biochemie Kapitola 14: Lipidy 14-21 Pavel Nezbeda 14.5.4.1. Metody stanovení HDL-cholesterolu HDL-cholesterol (HDL-C) je cholesterol nacházející se v HDL částicích. Stanovení cholesterolu bylo popsáno na začátku kapitoly. Problémem je, jak odlišit cholesterol právě v těchto částicích (totéž platí, jak uvidíme dále, pro cholesterol v částicích LDL). Hledaly se různé cesty jak jednotlivé frakce lipoproteinů oddělit, či vyloučit nebo separovat, aby stanovený cholesterol pocházel právě z těchto částic. V rutinní praxi zvítězily přímé metody stanovení HDL cholesterolu. Podobně existují metody pro stanovení cholesterolu v LDL částicích. Pro stanovení cholesterolu v částicích VLDL zatím metody nemáme. Precipitační frakcionace Pro oddělení frakce s HDL-cholesterolem se používají různá srážecí činidla, nejčastěji je používán roztok chloridu hořečnatého a kyseliny fosfowolframové. Po centrifugaci je HDL-cholesterol obsažen v supernatantu (nad sraženinou částic LDL a VLDL – viz dál), kde se stanoví buď neenzymově, nebo enzymově; dalším srážedlem jen např. směs dextransulfátu, heparinu s manganatými ionty a PEG 6000 a další Elektroforetické stanovení HDL je v -frakci; kvantifikace je možná při použití enzymových reagencií (cholesterolesteráza, cholesterol oxidáza, peroxidáza), případně kombinace cholesterolreduktázy s nitrotetrazoliovou modří (NBT); metoda poskytuje informace i o přítomnosti abnormálních lipoproteinů, např. Lp(a) Gradientová gelová elektroforéza (GGE) tj. ELFO v gradientovém polyakrylamidovém gelu,dělení probíhá podle velikosti částic Kapilární izotachoforéza Dělení se děje podle efektivní pohyblivosti částic mezi vedoucím a koncovým elektrolytem Vysokoúčinná gelová chromatografie (HPGC) dělení podle velikosti částic v gelově permeačních kolonách Imunochemická separace dělení podle různého obsahu apolipoproteinů za použití protilátek proti apoA-I, apoA-II a apoE; používá se imunoafinitní chromatografie nebo imunoelektroforetické techniky Ultracentrifugace v hustotním gradientu dělení podle rozdílů v hustotě lipoproteinů Homogenní metody (přímé metody) Existuje celá řada metod, které lze seřadit podle různých principů. Existuje jistě i jiné dělení než dále uvedené, ale můžeme uvést, jako velmi jednoduché, např. toto rozdělení metod:  metody blokovací  metody imunoinhibiční  metody eliminační. V principu se vždy jedná o to, nějakým způsobem zabránit reagování cholesterolu obsaženého v jiných frakcích, než je frakce HDL (čili ve frakcích non-HDL), s činidlem pro stanovení cholesterolu. Podle způsobu provedení této zábrany, se metoda jmenuje.  Blokovací metody (princip: maskování non-HDL, tj. všech tříd lipoproteinů kromě HDL, blokovacím činidlem) - LDL, VLDL a CHM vytvoří s blokovacím činidlem komplexy neschopné reakce s enzymovým činidlem; to reaguje pouze s cholesterolem obsaženým v HDL Výrobci souprav: Roche (HDL-C Plus Assay), Sentinel, Dialab - blokovací činidlo se adsorbuje na povrch LDL, VLDL a chylomikronů a převede je na rozpustné komplexy odolné denaturaci; naopak HDL se zdenaturuje a cholesterol uvolněný z HDL se enzymaticky stanoví Výrobci souprav: Dajichi Pure Chemicals Company, Japonsko; Genzyme Corporation, Cambridge, Velká Británie  Imunoinhibiční metody (princip: maskování non-HDL pomocí specifické protilátky) - za použití činidla obsahujícího protilátky proti apoB a apoC-III dojde k tvorbě komplexů všech tříd lipoproteinů kromě HDL; potom se enzymaticky stanoví cholesterol v HDL Výrobci souprav: International Reagent Corporation, Japonsko (IRC) - činidlo s obsahem protilátek proti lidským -lipoproteinům vytvoří s non-HDL LP rozpustné komplexy, které nereagují s enzymatickým činidlem; s tím naopak reaguje cholesterol obsažený v HDL (tzv. imunoseparační metoda) Výrobci souprav: Wako Pure Chemical Industry, Japonsko Klinická biochemie Kapitola 14: Lipidy 14-22 Pavel Nezbeda  Eliminační metoda (princip: postup zahrnující odstranění non-HDL a v nich obsaženého cholesterolu) - Pufr o specifické iontové síle rozruší non-HDL, cholesterol v nich obsažený je enzymaticky pozměněn a uvolněný peroxid vodíku rozložen katalázou; v dalším kroku dojde k inhibici katalázy azidem sodným, k rozpuštění HDL-cholesterolu v detergentu a jeho následnému enzymatickému stanovení Výrobci souprav: Denka Seiken Co., Japonsko; Randox Laboratories Limited, Velká Británie Souhrn  non-HDL vytvoří s blokovacím činidlem (blokovací metody) nebo s protilátkami (imunoinhibiční metody) nerozpustné nebo rozpustné komplexy (v nich obsažený cholesterol nereaguje) a enzymaticky se stanoví cholesterol v HDL  non-HDL se rozruší pufrem, non-HDL cholesterol je pozměněn a enzymaticky se stanoví cholesterol v HDL (eliminační metoda) Principy metod u dvou konkrétních diagnostických souprav od dvou výrobců - Diagnostická souprava firmy Sentinel, HDL Cholesterol, Direct Liquid D.P.R., využívá ve vhodném prostředí (pufru a tzv. tenzidů – povrchově aktivních látek – se specifickou afinitou k jednotlivým třídám lipoproteinů) sérii enzymatických reakcí k eliminaci cholesterolu v částicích LDL a VLDL a další sérii enzymatických reakcí k převedení HDL-cholesterolu na chinonové barvivo, jehož intenzita zbarvení se fotometruje (eliminační metoda); fotometrie při 600 nm - Diagnostická souprava firmy PLIVA-Lachema Diagnostika, HDL Cholesterol Direct Liquid 80, používá protilátku proti lidským lipoproteinům, která reaguje se všemi lipoproteiny kromě HDL. Vzniklé imunokomplexy nemohou reagovat v následné reakci využívající cholesteroloxidázu a peroxidázu (viz enzymové stanovení cholesterolu) a reaguje pouze cholesterol v HDL částicích. Vzniklý peroxid vodíku reaguje v pozměněné Trinderově reakci na modré barvivo, které se fotometruje při 593 nm (imunoseparační metoda) Referenční metody využívají kombinace ultracentrifugace, selektivní precipitace a stanovení cholesterolu s využitím AbellovyKendallovy metody (viz Cholesterol) Kromě absolutní hodnoty je důležitý i vztah k ostatním běžně stanovovaným lipidům (cholesterolu a TG) a relativní obsah HDL-cholesterolu v celkovém cholesterolu. Obecně platí – čím vyšší podíl HDL-cholesterolu a čím méně celkového cholesterolu, tím lépe. Vychází se z toho, že HDL částice plní roli „odklízeče“ cholesterolu (buňky obsahující přebytek cholesterolu mohou HDL částicím nadbytečný cholesterol odevzdat). 14.5.4.2. Metody stanovení LDL-cholesterolu LDL-cholesterol (LDL-C) je cholesterol nacházející se v LDL částicích. Vše, co bylo řečeno o stanovení HDL cholesterolu, platí prakticky i pro stanovení LDL cholesterolu, kromě výpočtu, který metody stanovení oproti stanovení HDL cholesterolu rozšiřuje. Výpočet koncentrace LDL-C Friedewald, W.T. (1972): LDL-C = cholesterol - (TG x f) [mmol/l], kde f = VLDL-C/VLDL-TG = 0,45 Jiná forma této rovnice: LDL-C = cholesterol - ((TG/2,22) + HDL-C) Podmínka platnosti výpočtu: triacylglyceroly < 5,6 mmol/l Existuje několik možností výpočtu, což jsou modifikace původního Friedewaldova vzorce, které zahrnují hladinu celkového cholesterolu, HDL-cholesterolu a triacylglycerolů. Výpočty jsou více či méně ovlivněny hypertriacylglycerolémií. Ultracentrifugační separace lipoproteinů Rozdělení/separace lipoproteinů v solném gradientu na základě jejich flotace (viz tabulka na str. 2). Neužívá se rutinně (v běžné praxi zdravotnické laboratoře). Hodnoticí meze: Dolní mez [mmol/l] Horní mez mmol/l] Muži 1,00 2,10 Ženy 1,20 2,70 Klinická biochemie Kapitola 14: Lipidy 14-23 Pavel Nezbeda Vysokoúčinná gelová chromatografie (HPGC) Principem je dělení na základě velikosti molekul, na výstupu kolony je spřažená enzymatická reakce s fotometrií při 550 nm; výhodou je stanovení LDL-C bez Lp(a) Precipitace sulfatovanými polyanionty Principem je selektivní precipitace HDL-C látkami jako jsou dextran, polyvinylsulfát, heparin) Příklady použití u některých výrobců dg. souprav: - heparin v citrátovém pufru (Merck) - polyvinylsulfát v přítomnosti EDTA a polyetylenglykolmetyléteru (ROCHE) Elektroforetické stanovení LDL-C Principem je separace lipoproteinů v agarosovém gelu v barbitalovém pufru o pH 8,6, s enzymatickým vybarvením frakcí. Imunoseparační metoda Principem je selektivní imunoprecipitace VLDL, IDL a HDL pomocí polystyrenových latexových částic s navázanými polyklonálními protilátkami proti apoA-I a apoE. Precipitované částice se zachytí na filtru, LDL a Lp(a) zůstávají ve filtrátu a v nich obsažený cholesterol se enzymaticky měří. Homogenní (přímé) metody (srovnej též stanovení HDL-C)  Metody využívající polyétery v kombinaci se sulfatovanými cyklodextriny: non-LDL vytvoří neprecipitující komplexy s cyklodextrinsulfátem, cholesterol v těchto komplexech enzymatické reakci nepodléhá; pomocí neionogenního detergentu se rozpustí LDL a cholesterol v nich obsažený se stanoví enzymaticky (blokační metoda) Výrobci souprav: Kyowa Medex, Japonsko; Roche  Eliminační metoda (detergent assay): činidlo obsahující kombinaci polyaniontu a amfoterního detergentu rozruší non-LDL částice a rozpuštěný cholesterol je enzymaticky pozměněn za tvorby peroxidu, který je rozložen katalázou; v dalším kroku se přidá reagencie s neionogenním detergentem, dojde ke zrušení "blokování" LDL a k rozpuštění LDL-cholesterolu, který se stanoví enzymaticky Výrobci (dodavatelé) souprav: Wako, Randox, BioVendor, PLIVA-Lachema Diagnostika aj.  Homogenní zákalová metoda (turbidimetrie): non-LDL částice jsou zamaskovány dipolárním detergentem, současně je jim tak také zabráněno tvořit komplexy. Po přidání směsi pufr/polyanion/detergent/Mg 2+ vytvoří LDL částice s polyaniontem (který má tvar vlákna, nazývá se tentacle, což doslova přeloženo znamená chapadlo) specifické komplexy, které jsou zesíťovány pomocí hořečnatých kationtů (polyanion omotá LDL částice a mezi vlákny i v samotném vláknu se vytvoří můstky pomocí Mg 2+ ) . Vzniklá turbidita se měří fotometricky. Elektroforeogram dělení cholesterolu na foliích s agarosovým gelem Hydragel LDL/HDLCHOLDirect 15/30 fy Sebia Heparin je glykosaminoglykan (GAG), Tyto GAG představují komplex heterogenních směsí opakujících se disacharidových jednotek složených z uronových kyselin (kyseliny D-glukuronová nebo L-iduronová) a D-glukosaminu nebo N-acetyl-Dglukosaminu. Každá monosacharidová jednotka může být sulfatována, přičemž stupeň sulfatace je různý – od žádné sulfátové skupiny na monosacharidu po tři skupiny na jednom monosacharidu. O S O O O n Obecný vzorec polyvinylsulfátu Klinická biochemie Kapitola 14: Lipidy 14-24 Pavel Nezbeda Poznámka: tentacle („chapadlový“) polyaninon = PAMPS, tj. kyselina poly-(2-akrylamido-2-methyl-1-propansulfononová) Referenční metoda Referenční metodou je tzv. beta-kvantifikace, která kombinuje ultracentrifugaci, precipitaci (heparin + MgCl2) a referenční metodu stanovení cholesterolu podle Abella-Kendalla. Z metod nejvíce používaný výpočet je v poslední době postupně nahrazován přímým stanovením LDL-C (homogenní metody). Hodnoticí meze: Dolní mez: 1,20 mmol/l Horní mez: 3,00 mmol/l Obecně platí, že hodnota LDL-cholesterolu by měla být co nejnižší. Vychází se z toho, že LDL částice transportují cholesterol do tkání (srovnej schéma metabolismu lipoproteinů). 14.5.4.3. Klinické poznámky Hladina cholesterolu v séru vykazuje pozitivní korelaci s výskytem aterosklerózy a koronárním srdečním onemocněním. Totéž však platí i o triacylglycerolech. U pacientů s cévními chorobami mohou být zvýšeny VLDL (hladina LDL normální), LDL (hladina VLDL normální), LDL i VLDL. Diabetes mellitus, lipoidní nefróza, hypotyreoidismus a jiné stavy hyperlipidémie, tj. choroby s dlouhodobě zvýšenými hladinami VLDL, IDL nebo LDL jsou často provázeny předčasnou nebo velmi závažnou aterosklerózou. Nízká hladina krevního cholesterolu je typická pro hypertyreoidismus. Dojde-li k poruše rovnováhy mezi rychlostí tvorby triacylglycerolů a jejich degradací či odsunem, může dojít ke ztučnění jater. Příčinou mohou být stoupající hladina volných mastných kyselin v plazmě (mobilizace tuku v tukové tkání, hydrolýza lipoproteinů, hydrolýza triaclyglycerolů v chylomikronech, potrava s vysokým obsahem tuku, hladovění) nebo metabolický blok produkce plazmatických lipoproteinů (zablokování syntézy apolipoproteinů, zastavení syntézy lipoproteinu z lipidu a apoliproteinu, nedostatek fosfolipidů, které jsou součástí lipoproteinů, špatný sekreční mechanismus). Syntézu apoproteinů mohou blokovat i např. některá antibiotika (puromycin), ale také tetrachlormetan, chloroform, fosfor, arsen, olovo a jiné látky. Pro zvídavé studenty. Pro snižování sérového cholesterolu mají význam  změna stravy; jedná se zejména o náhradu některých nasycených mastných kyselin polyenovými mastnými kyselinami a mastnými kyselinami s jednou nenasycenou vazbou, tedy o zařazení přirozeně se vyskytujících olejů s polyenovými mastnými kyselinami (slunečnicový, kukuřičný, sójový) či olejů s mastnými kyselinami s jednou nenasycenou vazbou (olivový) do jídelníčku. Podstata účinku těchto kyselin není známa, předpokládá se účinek na metabolismus (zrychlení katabolismu LDL) prostřednictvím ovlivnění LDL- receptoru aj.  způsob života; hladina cholesterolu je ovlivňována hladinou mastných kyselin, které zase reagují např. na nikotin (kouření), psychické stresy, fyzickou inaktivitu apod.  léčba (nepomohou-li předchozí dvě aktivity). Zde se zasahuje do metabolismu cholesterolu např. cholestyraminovou pryskyřicí (Questran), která přeruší enterohepatální oběh žlučových kyselin (tyto produkty LDL Apo B LDL Apo B LDL Apo B Mg 2+ - - - Mg 2+ - - Mg 2+ - - záporný náboj na polyaniontu PAMPS (tentacle polyanion) Schéma tvorby specifického komplexu LDL částic s polyaniontem a hořečnatými ionty Vysvětlivky k obrázku vlevo: Mg 2+ hořečnaté ionty (Mg2+ ) Klinická biochemie Kapitola 14: Lipidy 14-25 Pavel Nezbeda degradace cholesterolu se nevyloučí stolicí zcela, ale část se vrací enterohepatálním oběhem do jater a zpětnou vazbou snižují přeměnu cholesterolu na žlučové kyseliny; po přerušení tohoto působení pryskyřicí nebo chirurgicky, probíhá přeměna cholesterolu na žlučové kyseliny zvýšenou měrou). Resorpci z gastrointestinálního traktu může snižovat sitosterol, rostlinný sterol. Některá léčiva působí na různých úrovních biosyntézy cholesterolu jako inhibitory (mevastatin a lovastatin z hub). Klofibrát a gemfibrozil ovlivňují sekreci VLDL z jater. Nejnovější technikou pro stanovení lipoproteinů je nukleárně magnetická rezonanční spektroskopie NMR-spektroskopii (Nuclear Magnetic Resonance Spektroskopy; viz str. 11-32), k tomuto účelu poprvé použil v devadesátých létech minulého století James D. Otvos, Ph.D., profesor biochemie, který touto technikou studoval proteiny. Vyvinul techniku, kterou se dají relativně levně stanovit přímo lipoproteinové částice, zejména LDL. Vzhledem k tomu, že aterogenní jsou primárně právě tyto částice, konkrétně apoproteiny, nikoliv samotný cholesterol (ten případně až následně po oxidaci), je to přímá cesta zjištění kardiovaskulárního rizika, přesnější a správnější než měření prostřednictvím cholesterolu. Komerční test fy LipoScience, Inc.: NMR LipoProfile ® test pro stanovení LDL-P (LDL- částic, P = particle, částice) Na principu NMR-spektroskopie pracuje automatický analyzátor Vantera ® Clinical Analyzer, který identifikuje a kvantifikuje lipoproteinové částice (viz str. 11-32). 14.6. Co jsou to lipidové indexy Posuzování hladiny celkového cholesterolu nestačí, vždy je nutno sledovat i ostatní parametry, tj. hladinu triacylglycerolů a HDL a LDL cholesterolu. Využívají se i tzv. lipidové indexy Poměr [cholesterol] / [HDL-C] Tento ukazatel vyjadřuje podíl HDL cholesterolu k cholesterolu ve všech lipoproteinech (zejména v LDL). U mužů má mít tento poměr hodnotu menší jak 5,0 (lépe pod 4,5), u žen má mít hodnotu pod 4,0 (lépe pod 3,5). Někdy je tento poměr definován opačně, tj. [HDL cholesterol] / [cholesterol], hodnota pak v podstatě vyjadřuje procentový (jednicový) obsah HDL cholesterolu v celkovém cholesterolu: muži by měli mít alespoň 20% HDL cholesterolu z celkového obsahu cholesterolu, ženy alespoň 25% Aterogenní index (KLIMOV) = (cholesterol – HDL-C) / HDL-C Hodnoticí meze: 1 - 4,5 Hodnoty mezi 4 - 5 tvoří tzv. šedou zónu, hodnoty nad 5 jsou výrazně patologické. Podmínka platnosti výpočtu: cholesterol > 0,8 mmol/l ; HDL cholesterol > 0 mmol/l Poměr LDL / HDL = LDL-C / HDL-C Hodnoticí meze: 1 - 3 (v podstatě doplněk, koreluje s Klimovem) Poměr TG / HDL = triacylglyceroly / HDL-C Hodnoticí meze: 0,5 - 2,5 (nový index, nepřináší nové informace) Poměr apoA-I / apoB = apolipoprotein A-I / apolipoprotein B Hodnoticí meze: 1,4 - 1,6 (platí obecná zásada - čím vyšší hodnota poměru, tím lepší); někdy se používá tento poměr opačný, pak platí i opačné hodnocení. Body Mass Index (BMI)= hmotnost [kg] / povrch těla [m 2 ] Hodnoticí meze: BMI > 25 nadváha BMI > 30 obezita Nověji: muži BMI > 28 obezita ženy BMI > 27 obezita Vysvětlení nesouhlasu mezi stanovením LDL částic prostřednictvím cholesterolu (LDL-C) a NMR-spektroskopií, která stanovuje přímo LDL částice (LDL-P) Obsah cholesterolu v lipoproteinových částicích přirozeně kolísá, proto zjištěné hodnoty LDL-C a LDL-P jsou velmi často v zájemném rozporu. Z klinického hlediska, tzn. z hlediska správného stanovení kardiovaskulárního rizika a následné adekvátní léčby, je vhodnější stanovení LDL-P. Může se totiž stát, že hladina LDL-C bude hodnocena jako příznivá, přitom skutečný obsah částic, čili LDL-P, bude v oblasti zvýšeného rizika kardiovaskulárního onemocnění. LDL-C: Cholesterol estimates LDL levels = odhad hladiny LDL na základě stanovení cholesterolu LDL-P: Particles directly quantify LDL levels = přímá kvantifikace hladiny LDL zjištěním počtu částic Klinická biochemie Kapitola 14: Lipidy 14-26 Pavel Nezbeda 14.7. Poruchy metabolismu lipidů se týkají transportu nebo ukládání lipidů Poruchy metabolismu lipidů (lipoproteinů) se týkají transportu lipidů (dyslipoproteinémie) nebo ukládání lipidů v buňkách (sfingolipidózy). 14.7.1. Poruchy transportu lipidů Poruchy metabolismu lipidů, dyslipoproteinemie (DLP), patří mezi nejčastěji se vyskytující metabolické poruchy v populaci. Jsou jednou z příčin kardiovaskulárních onemocnění, především ischemické choroby srdeční. Dyslipoproteinemie představuje celou řadu poruch metabolismu lipidů, které mohou mít mnoho příčin. Na jejím vzniku se prakticky vždy podílí nejméně dva faktory – genetické a zevního prostředí (kouření, fyzická inaktivita, strava). Jsou charakterizovány změnami v koncentracích cirkulujících lipoproteinů. Jedná se o specializovanou a složitou problematiku, takže v tomto textu se omezíme pouze na informace dostatečné pro základní, v podstatě laickou, orientaci v dané oblasti. Prvním laboratorním nálezem u dyslipoproteinemií je nejčastěji zvýšená hladina cholesterolu a/nebo triacylglycerolů a/nebo zvýšená či snížená koncentrace HDL cholesterolu. Zvýšení hladiny LDL cholesterolu a triacylglycerolů a snížená hladina HDL cholesterolu jsou nezávislými rizikovými faktory pro vznik ischemické choroby srdeční. Obecně platí, že pro prevenci ischemické choroby srdeční je žádoucí, aby byla hladina  celkového cholesterolu < 5,0 mmol/l  LDL cholesterolu < 3,0 mmol/l  triacylglycerolů < 2,0 mmol/l  HDL cholesterolu > 1,0 mmol/l a  poměr cholesterol/HDL-C < 5 Přesnější hodnoticí meze jsou uvedeny v textu a shrnuty jsou v následující tabulce. Poznámka: Ve skutečnosti jsou průměrné hodnoty v české populaci jiné - průměrné hodnoty cholesterolu jsou u mužů cca 5,9 mmol/l a u žen cca 5,8 mmol/l a koncentrace LDL zhruba 3,8 mmol/l u mužů a 3,7 mmol/l u žen. Společné doporučení České společnosti klinické biochemie ČLS JEP a České společnosti pro aterosklerózu ČLS JEP ke sjednocení hodnoticích mezí krevních lipidů a lipoproteinů pro dospělou populaci (odkaz) Analyt jednotka dolní mez horní mez Celkovy cholesterol (mmol/l) 2,90 5,00 LDL cholesterol (mmol/l) 1,20 3,00 HDL-cholesterol muži (mmol/l) 1,00 2,10 HDL-cholesterol ženy (mmol/l) 1,20 2,70 Triacylglyceroly (mmol/l) 0,45 1,70 apolipoprotein B (g/l) 0,5 1,00 apolipoprotein A 1 muži (g/l)* 1,00 * 1,70 * apolipoprotein A 1 ženy (g/l)* 1,10 * 1,90 * Legenda: *dolní a horní meze pro apolipoprotein A 1 nejsou hodnotami podle doporučení pro prevenci kardiovaskulárních onemocnění; pro tento analyt žádná doporučená hodnota neexistuje. Hodnoty uvedené v tabulce jsou hodnotami, které výbor ČSKB doporučuje uvádět na nálezových listech. Dyslipoproteinemie (DLP) můžeme dělit podle různých principů  Podle jejich etiologie (příčiny), které jsou vrozené a sekundární  Podle laboratorního nálezu, klasifikace Frederiksonova a klasifikace terapeutická Vrozené DLP Je popsáno několik desítek poruch v metabolismu lipidů; v ČR asi 2% populace s touto poruchou. Dělí se na a) monogenní (způsobené mutací v jednom genu) i) familiární hypercholesterolemie ii) familiární defekt apoB100 iii) familiární hyperchylomikronemie b) polygenní (způsobené mutací ve více genech) i) polygenní hypercholesterolemie ii) polygenní familiární hypertriglyceridemie iii) familiární kombinovaná hyperlipidemie Klinická biochemie Kapitola 14: Lipidy 14-27 Pavel Nezbeda iv) familiární dysbetalipoproteinemie v) vrozená hyperlipoproteinemie typu V Sekundární DLP se mohou rozvíjet zevními příčinami a/nebo účinkem jiných akutních či chronických onemocnění (endokrinní, diabetes mellitus, onemocnění jater, ledvin, akutní a chronická infekční onemocnění, obezita, poruchy příjmu potravy, ale i při fyziologických stavech (těhotenství), také účinkem léků a toxinů (i alkoholu). DLP podle laboratorního nálezu a. Klasifikace Fredericksonova (původní dělení dyslipopoteinemií, hyperlipoproteinemií). Klasifikace vycházela z Fredericksonova elektroforetického schématu (viz str. 11-18). Jedná se o tzv. „fenotypizační klasifikační schéma“:  Typ I, primární hyperchylomikronémie (zvýšení chylomikronů)  Typ IIa, primární hypercholesterolémie (zvýšení LDL)  Typ IIb, primární kombinovaná hyperlipoproteinémie (zvýšení VLDL + LDL)  Typ III, primární dysbetalipoproteinémie (zvýšení VLDL)  Typ IV, primární hypertriacylglycerolémie (zvýšení VLDL)  Typ V, primární kombinovaná hyperlipoproteinémie (zvýšení VLDL + chylomikronů) Protože tato klasifikace neodpovídá zcela genotypu, tj. genetická porucha se může projevit různě, či dokonce v průběhu choroby může jeden fenotyp přecházet v druhý, byla toto typizace postupně opuštěna. b. Terapeutická klasifikace: jak vyplývá z předchozího textu, dyslipoproteinémie jsou především hyperlipidémie (hypolipidémie jsou vzácné):  Hypercholesterolémie (též izolovaná hypercholesterolémie): izolované zvýšení celkového cholesterolu, převážně v LDL  Kombinovaná hyperlipidémie: současné zvýšení cholesterolu i triacylglycerolů  Hypertriacylglycerolémie=hypertriglyceridemie (též izolovaná hypertriacylglycerolémie případně izolovaná hypertriglyceridémie): izolované zvýšení triacylglycerolů Základním laboratorním vyšetřením je stanovení hladin celkového cholesterolu a triacylglycerolů. Pro přesnější rozlišení poruchy - se stanovují hladiny cholesterolu v HDL a v LDL (HDL-C a LDL-C,) apoA-I a apoB100, případně dalších apolipoproteinů - může se provést elektroforéza lipoproteinů - mohou se provést další specializovaná vyšetření krevních lipidů. Specializovaná vyšetření krevních lipidů Dostupná pouze na několika specializovaných pracovištích  Vyšetření DNA metodami molekulární biologie (defekt genu pro apoB100 a defekt genu pro LDL receptor) pro upřesnění diagnostiky familiární hypercholesterolémie  Vyšetření apoE (na izoformy E2, E3, E4) u dysbetalipoproteinemie  Vyšetření defektu lipoproteinové lipázy, jaterní lipázy, apoC-II, LCAT, CETP pro potřeby diagnostiky některých vzácných poruch metabolismu lipidů  Vyšetření funkční aktivity LDL receptorů (stupeň postižení LDL receptorů) u nemocných s familiární hypercholesterolemií Vzhledem k závažnosti dopadů je sledování poruch metabolismu lipidů velmi důležité a je žádoucí, aby příslušná laboratoř dodávala relevantní výsledky analýz. Poznámka: Nutno dodat, že názory mnohých odborníků se od uvedených (včetně „Doporučení“) diametrálně liší a za původce poruch lipidového metabolismu jsou považovány (velmi zjednodudšeně řečeno) zejména „AGE´s“ (viz. str. 14-25 a 14-26 v kapitole 14) a cukr, jako takový. Klinická biochemie Kapitola 14: Lipidy 14-28 Pavel Nezbeda Stanovení lipidů - prepreanaltytická fáze: Pacient před odběrem krve má být lačný po dobu 12 – 14 hodin, předchozí 2 – 3 dny má být vynechán alkohol. Před vlastním odběrem je nutná poloha v klidu v sedě po dobu nejméně 10 minut. Vyšetření nemá být prováděno, když pacient  nedodržoval 2 týdny před odběrem krve svůj běžný životní styl  nedávno proběhlo nebo je přítomno akutní či subakutní onemocnění  je dekompenzovaný diabetes mellitus  pacientka je těhotná nebo je v období do ½ roku po porodu. Vyšetření u pacienta dosud neléčeného na dyslipoproteinémie musí být zopakováno v období 1 – 8 týdnů v téže laboratoři a pacient během této doby nesmí změnit své stravovací návyky a hmotnost. 14.7.2. Poruchy z ukládání lipidů Poruchy z ukládání lipidů mají svůj původ v defektech buněčných enzymů zúčastněných v přeměnách lipidů. Dělí se na  metabolické poruchy katabolismu cholesterolu o Wolmanova choroba, vzácná dědičná porucha metabolismu, při níž se ukládají estery cholesterolu a triacylglyceroly do buněk jater, ledvin, nadledvin, hematopoetického systému a do tenkého střeva o Familiární deficit LCAT, další vzácná dědičná porucha, v séru jsou zvýšeny triacylglyceroly, hladina cholesterolu je variabilní, chybí estery cholesterolu, lipidy se ukládají na rohovce, která je mléčně zakalena, v glomerulární membráně (dochází k proteinurii), v kostní dřeni a ve slezině (sea blue histiocyty), v erytrocytech (anémie), v cévní stěně (ateromy), dochází i ke změnám v plazmatických lipoproteinech (abnormální charakter elektroforézy lipoproteinů)  poruchy v přeměně sfingolipidů – sfingolipidózy. Jedná se o skupinu dědičných poruch sfingolipidů, (membránových lipidů). Tyto lipidy se hromadí v různých orgánech. Jména chorob jsou podle ukládajícího se lipidu (gangliozidóza, glukocerebrozidóza, galaktosylceramidóza, ceramidtrihexosidóza, sfingomyelinóza, ceramidóza), případně podle autora, který ji první popsal (glukocerebrozidóza – Gaucherova choroba, ceramidtrihexosidóza – Fabryho choroba apod.). Tyto choroby se vyskytují většinou v několika formách, prakticky vždy vedou k mentální retardaci, degeneraci nervového systému, poškození zraku a dalším závažným defektům. DLP Genetické vlivy Vlivy zevního prostředí Vlivy jiných onemocnění hypercholesterolémie  HDL-C CHOL Kombinovaná DLP Hypertriglyceridemie  HDL-C CHOL Mechanismus rozvoje DLP Klinická biochemie Kapitola 14: Lipidy 14-29 Pavel Nezbeda 14.8. Klíčovou úlohu v ateroskleróze hraje zánět Na rozdíl od skutečné infekce, kde zánět pomáhá odrazit invazi mikroorganismů, v tomto případě působí škodlivě (podobně jako např. u revmatoidní artritidy a jiných chorob zánětlivého původu). Souhrn  Ateroskleróza = nebezpečné hromadění tukovitých depozit (plátů) v tepnách. Tento děj je podporován zánětem.  Zánět je i příčinou toho, že některé pláty pukají: na povrchu rozpadlých plátů dochází k torbě krevních sraženin, které mohou artérie ucpávat a vést tak k srdečnímu infarktu nebo mozkové mrtvici  Nadbytek LDL může ve stěnách tepen spouštět zánětlivou reakci. Tlumení této reakce léky je podstatou současné léčby aterosklerózy. Současně se hledají cesty, jak zabránit zánětu jiným způsobem  Kromě stanovení cholesterolu se hledají další testy popisující stav aterosklerózy (např. stanovení hladiny CRP) Markerem nestability aterogenního plátu je především myeloperoxidáza (MPO), lyzosomální enzym ze skupiny peroxidáz, přítomný v primárních (azurofilních) granulích leukocytů (podrobnosti viz např. zde). Pro zvídavé studenty. Vznik plátu v cévní stěně Tukovitá depozita čili pláty vznikají v cévní stěně. Cévní stěnu tvoří tři vrstvy:  Intima, která je tvořena především endotelovými buňkami vystýlajícími cévy. Tyto buňky jsou uloženy na tenké vrstvě mezibuněčné hmoty (matrix) řídkého vaziva protkaného tu a tam málo diferencovanými elementy hladkého svalstva (produkují matrix)  Media, obsahuje zejména buňky hladké svaloviny  Adventia, což je vnější vrstva cévy. Při normálních koncentracích LDL-cholesterolu v krvi, může LDL-cholesterol volně přecházet do intimy i z ní volně odcházet. Je-li LDL-cholesterolu v krvi nadbytek, začne se v mezibuněčné hmotě intimy hromadit. Lipidy v LDL částici postupně začnou podléhat oxidaci, mění se jejich struktura. Současně dochází ke glykosylaci bílkovinné složky LDL (významné zejména u diabetiků). Buňky cévní stěny vnímají tyto změny jako podnět k aktivaci obranného systému organismu. Postupně dochází k těmto dějům  Na svém povrchu obráceném do krevního řečiště začnou buňky cévní stěny vystavovat adhezivní molekuly, které ulpívají na monocytech. Díky tomu monocyty vypadávají z krevního proudu, koulejí se po vnitřním povrchu cévy, až přilnou k arteriální stěně.  Endotelové buňky a elementy hladkého svalstva intimy začnou produkovat chemokiny, které přitahují monocyty a způsobí, že monocyty začnou pronikat do intimy  Chemokiny a ostatní látky vznikající v endotelu v buňkách hladkého svalstva přimějí monocyty k dělení a diferenciaci v aktivní makrofágy. Makrofágy se na svém povrchu vybaví speciálními receptory a s jejich pomocí začnou čistit cévní stěnu a pohlcují pozměněné částice LDL. Výsledkem je makrofág přeplněný tukovými kapénkami – pěnová buňka (viz též str. 11-15)  Působením adhezivních molekul a chemokinů pronikají do intimy i Tlymfocyty, které uvolňují cytokiny (přenášejí signál mezi buňkami imunitního systému a organizují jejich činnost), jež posilují zánětlivou reakci normální arterie střední ateroskleróza těžká ateroskleróza Vznik plátu Klinická biochemie Kapitola 14: Lipidy 14-30 Pavel Nezbeda tepenné stěny.  Kombinací pěnových buněk s menším počtem T-lymfocytů vznikají tzv. tukové proužky, předchůdci komplexních plátů, které posléze deformují artérie. Progrese plátu  Zánětlivé molekuly mohou iniciovat další růst plátu a utváření vláknité čapky nad lipidovým jádrem. V podstatě se jedná o hojivý proces. Buňky hladké svaloviny medie migrují na povrch intimy, kde se množí a produkují tuhou vláknitou (kolagenovou) matrix, která drží buňky pohromadě. Čapka zvětšuje plát, ale současně ho bezpečně odděluje od krve. Prasknutí plátu  Zánětlivé látky vylučované pěnovými buňkami mohou zeslabit čapku natrávením molekul matrix a ohrožením buněk hladké svaloviny, které potom nejsou schopny čapku opravit. Na zánětlivých procesech uvnitř artérií se mohou podílet i některé viry a baktérie (herpetické viry, Chlamydia pneumoniae), snad i vzdálená infekce. Narušení plátu vlivem zánětu je proces velmi rychlý, trvá nejdéle dva dny. Pěnové buňky mohou na svém povrchu vystavit tkáňový faktor, který je mocným iniciátorem srážení. Děje se tak např. působením T-buněk (na plátu) na makrofágy, které pak vytvářejí vysoké hladiny tohoto faktoru. Při případném prasknutí plátu dojde k tvorbě sraženiny (trombu), která může zastavit tok krve v artérii a způsobit infarkt nebo mrtvici. Kladná úloha HDL lipoproteinů v ateroskleróze (podrobněji viz úvodní články této kapitoly o apolipoproteinech, lipoproteinech a jejich metabolismu)  Brání oxidaci LDL, protože mohou přepravovat antioxidační enzymy schopné odbourávat oxidované lipidy. Tím se potlačuje zánět.  Dopravují cholesterol do jater za účelem odstranění nebo recyklace. Pouze asi 15% infarktů je způsobeno ucpáním cévy plátem. V ostatních případech rostou pláty spíše dovnitř cévní stěny a příčinou infarktu je vznik trombu popsaný výš v textu. Potlačení zánětu např. aspirinem má kladný vliv na potlačení rizika vzniku AIM. Hodnota CRP může napovídat o probíhajícím zánětu v organismu a o výši rizika AIM i při normální hladině cholesterolu. Pláty, které vyčnívají do tepenného lumen způsobují anginu pectoris, tj. pocity tísně, bolesti nebo tlaku, obvykle pod hrudní kostí, zvl. při zvýšených nárocích na dodávku krve (námaha, stres). Pláty, které nevyčnívají do prostoru cévy, ale jsou uvnitř stěny, jsou při prasknutí příčinou nečekaného infarktu, bez předchozích varování (jako je tomu např. u anginy pectoris). Dále jsou příčinou toho, že léčebné postupy zaměřené na rozšíření cévního průsvitu (balónová angioplastika, zasouvání drátěných klecových stentů) nebo chirurgicky vytvořený bypass sice omezí bolesti na hrudníku, ale často nezabrání dalšímu infarktu. Ošetřené arterie se často brzy znovu ucpávají – zřejmě následkem silného zánětu, který může vzplanout po léčebném zákroku. Peter Libby, Ateroskleróza: Nový pohled, Scientific American, české vydání, květen 2002 str. 29 – 37 Prasknutí plátu Progrese plátu Klinická biochemie Kapitola 14: Lipidy 14-31 Pavel Nezbeda 14.9. Několik slov o polyenových mastných kyselinách Na závěr ještě několik slov pro zvídavé studenty o určitých nenasycených mastných kyselinách, diskutovaných zvláště v souvislosti s předchozím tématem. Jedná se o tzv.(neboli n-3) a -6 (neboli n-6) nenasycené mastné kyseliny, se nazývá poslední uhlík v mastné kyselině (srovnej též s výkladem na str. 11-21). 14.9.1. Omega-3-nenasycené mastné kyseliny (n-3 kyseliny) mají nejvzdálenější dvojnou vazbu na třetím uhlíku od koncové (tj. „omega“) methylové skupiny. Vyskytují se v tuku mořských živočichů a některých rostlinných olejích. Tyto mastné kyseliny mohou modulovat složení leukotrienů (hormony lipidové povahy odvozené od kyseliny arachidonové, se třemi dvojnými vazbami, stimulují uvolňování prostaglandinů), ovlivňovat syntézu prostaglandinů, inhibovat agregaci destiček a zvyšovat poměr HD k LD lipoproteinům, zatímco obecná hladina lipidů (zvláště triglyceridů) klesá. Existují důkazy, že mohou inhibovat některé typy rakoviny. 14.9.2. Omega-6 nenasycené mastné kyseliny (n-6 kyseliny) mají nejvzdálenější dvojnou vazbu na šestém uhlíku od koncové methylové skupiny. Vyskytují se převážně v rostlinných olejích a olejích ze semen. Některé lékařské výzkumy svědčí o tom, že vysoký poměr hladin n-6 mastných kyselin vzhledem k n-3 mastným kyselinám může zvyšovat pravděpodobnost výskytu různých chorob a depresí (nepříznivé působení při ateroskleróze, astma, artritidě, cévních chorobách, trombóze, imunitně-zánětlivých onemocněních, při růstu nádorů). Vedou se diskuse o tom, jaký poměr těchto kyselin je „ideální“. Faktem je, že s postupem času se v lidském jídelníčku prosazují více n-6 mastné kyseliny, na úkor kyselin n-3. Některé názory tvrdí, že není třeba se starat o hladinu n-6 kyselin, ale stačí zajistit vysokou koncentraci n-3 kyselin. Z pozitivních účinků se uvádí např. působení tkáňové kyseliny arachidonové, která konvertuje na n-6 prostaglandiny a n-6 leukotrienové hormony a tím vytváří značný počet cílů na které se mohou zaměřit účinky léčiv a takto se minimalizují jinak nepříznivé účinky n-6 látek. O OH CH3 Kyselina -linolenová (Kyselina all-cis-oktadeka-9,12,15-trienová; esenciální) O OH CH3 EPA (EicosaPentaenoicAcid) (Kyselina all-cis-eikosa-5,8,11,14,17-pentaenová) CH3 O OH DHA (DocosaHexaenicAcid) (Kyselina all-cis-dokosa-4,7,10, 13, 16, 19-hexaenová) O OH CH3 Kyselina linolová (Kyselina cis,cis-oktadeka-9,12-dienová) CH3 O OH Kyselina arachidonová (Kyselina all-cis-eikosa-5, 8,11,14-tetraenová) CH3 O OH Kyselina -linolenová (Kyselina all-cis-oktadeka-6,9,12-trienová) O OH CH3 Kyselina dihomo -linolenová (Kyselina all-cis-eikosa-8,11,14-trienová) označuje 3. uhlík od „omega“ konce označuje 6. uhlík od „omega“ konce Klinická biochemie Kapitola 14: Lipidy 14-32 Pavel Nezbeda 14.10. Dodatky 14.10.1. Coated pits čili potažené jamky Na obrázku je znázorněna receptory zprostředkovaná endocytóza, se kterou jsme se již setkali při výkladu o metabolismu železa. Obrázek je dostatečně názorný k pochopení pojmu coated pits (potažené jamky). Vysvětlivka: Klathrin (clathrin) je bílkovina, která se zúčastňuje tvorby váčků při receptorem zprostředkované endocytóze. Ilustrační obrázek k pojmu coated pits Receptory zprostředkovaná endocytóza Klinická biochemie Kapitola 14: Lipidy 14-33 Pavel Nezbeda 14.10.2. NMR-spektroskopie Nukleární magnetická rezonanční spektroskopie Nukleární magnetická rezonanční spektroskopie patří mezi analytické optické metody založené na absorpci elektromagnetického záření. Jádra některých atomů mohou, díky svému magnetickému momentu, absorbovat v silném magnetickém poli elektromagnetické záření, odpovídající vlnovou délkou rádiovým vlnám (kmitočet 60 – 1000 MHz). Absorpční maxima v příslušném spektru informují o struktuře zkoumané sloučeniny. Obecně podává NMR spektroskopie komplexní informace o vnitřní struktuře a uspořádání hmoty. Působením magnetického pole na atom se mění energetická hodnota tzv. jaderného spinu. Dojde k rozštěpení jednotné hladiny energie spinů na dvě, nižší a vyšší. Při ozáření atomů s takto rozdělenými spiny radiofrekvenčním zářením může dojít k absorpci tohoto záření a přechodu jednotlivých spinů na vyšší hladinu. NMR spektroskopie se v chemii využívá ke studiu nízkomolekuárních látek i k objasňování struktury velkých molekul, např. bílkovin a nukleových kyselin, své uplatnění nalezla i ve farmacii a v potravinářském průmyslu. V lékařství je hojně využívaná zobrazovací technika založená na nukleárně magnetické rezonanci známá jako magnetická rezonance, resp. jako MRI (magnetic resonance imaging) v anglosaském světě. V poslední době našla analytická metoda založená na nukleární magnetické rezonanci své místo i v klinické laboratorní analytice (identifikace a kvantifikace lipoproteinových částic). NMR spektrometr INCA od fy Bruker Vantera ® Clinical Analyzer (LIPOSCIENCE) Stolní přístroj Pulsar (OXFORD Instruments) Ukázka NMR spektra a naznačení identifikace atomů a skupin Stolní přístroj Fourier 60, vhodný pro výuku (BRUKER) Klinická biochemie Kapitola 11. Lipidy a lipoproteiny 14-34 11.10.3. Kardiolipin Esterifikací glycerolfosfátu dvěma mastnými kyselinami s dlouhými řetězci vzniká kyselina fosfatidová (viz také kapitola 15, str. 15-18). Esterifikací glycerolu dvěma fosfatidovými kyselinami vzniká složený lipid difosfatidylglycerol (glycerofosfolipid), zvaný kardiolipin. Ten je důležitou součástí vnitřní mitochondriální membrány. U savců mají většinou mastné kyseliny v kardiolipinu 18 uhlíků s dvěma nenasycenými vazbami v každé z nich. Předpokládá se, že tato struktura, tzn. 18 uhlíků a 2 dvojné vazby ve 4 acylových řetězcích, podmiňuje vysokou afinitu kardiolipinu k proteinům vnitřní mitochondriální membrány savců. Kardiolipin je poměrně činný:  jako lapač elektronů se zúčastňuje oxidační fosforylace  přechodem do vnější mitochondriální membrány spouští apoptózu  přenáší cholesterol z vnější do vnitřní mitochondriální membrány  aktivuje tzv. P450scc, což je enzym, který aktivuje konverzi cholesterolu na pregnenolon (srovnej reakci dole a schéma v kapitole 14, na str. 14-34)  jako aktivátor mitochondriálního rýhování  při přenosu proteinů do mitochondriální matrix  má antikoagulační funkci. Klinický význam má kardiolipin  u vzácného genetického onemocnění známého jako Barthův syndrom, kde je postižena biosyntéza kardiolipinu, což vede ke snížené produkci ATP a v důsledku ke kardiomyopatii a všeoghecné slabosti postiženého jedince  u Parkinsonovy a pravděpodobně i Alzheimeroy choroby, kde jsou pozorovány nižší koncentrace kardiolipinu, což je provázeno vyšším stresem z volných radikálů  u nealkoholického tukového postižení jater (NAFLD, nonalcoholic fatty liver disease) a u srdečního selhání (HF, heart failure), úloha kardiolipinu v těchto případech je však zatím nejasná a předmětem diskuse  u Tangierovy choroby, charakterizované nízkými hodnotami plazmatického HDL-cholesterolu; na rozdíl od Barthova syndromu, je u Tangierovy choroby syntéza kardiolipinu zvýrazněna (3 – 5x vyšší hladiny)  u diabetu v raných stádiích jsou pozorovány nižší hladiny kardiolipinu, což vede ke kardiovaskulárním komplikacím  u syfilidy, kdy se ve Wassermannově testu na syfilidu používá jako antigen kardiolipin z hovězího srdce (reagují však i jiné protilátky, včetně systémového lupus erythematosus, malarie a tuberkulosy), takže test není specifický  u HIV-1, nádorových bujení (rakovin) a u antifosfolipidového syndromu. R1 O O P O O P O O O O R2 OH O OH O R4 OH O O O R3 O Kardiolipin; 1,3-bis(sn-3´-fosfatidyl)sn-glycerol Glycerol Kyselina fosfatidová O O O O R OR P O OH OH Kyselina fosfatidová Kyselina fosfatidová OH CH3 CH3 O CH3 Pregnenolon OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 Cholesterol P450scc P450scc je jiné označení pro cholesterol side-chain cleavage (akronymem druhé části názvu je „scc“), celý název naznačuje, že enzym je členem superrodiny cytochromu P450. Klinická biochemie Kapitola 11. Lipidy a lipoproteiny 14-35 O antifosfolipidovém syndromu se hovoří u pacientů s antikardiolipinovými protilátkami Ty mohou být infekčního původu (syfilis) nebo autoimunního (sklerosa, lupus). Pacienti mohou mít opakované trombotické příhody, často i v období středních až pozdních „teenagerských“ let. Tromby se mohou objevovat i v cévách, ve kterých je trombóza poměrně neobvyklá, např. v jaterních či ledvinových. Antikardiolipinové protilátky jsou často zvýšeny u mladých žen s opakovanými spontánními aborty. Příčinou může být mutace v Apo-H, jehož jednou funkcí je i vazba kardiolipinu. Klinická biochemie Kapitola 11. Lipidy a lipoproteiny 14-36 14.11. Stručné shrnutí kapitoly  Lipidy jsou různorodé látky, jejichž společným jmenovatelem je nerozpustnost ve vodě a rozpustnost v tzv. tukových rozpouštědlech.  Většinu lipidů tvoří estery mastných kyselin s glycerolem nebo se sfingosinem, mnoho s nich obsahuje dále různé cukry, kyselinu fosforečnou, případně i další složky, jakými jsou etanolamin, cholin, serin, kyselina sírová, étery aj.  Tělesné tuky (estery mastných kyselin s glycerolem) pocházejí z potravy, kdy ovšem prošly chemickou úpravou v organismu a z vlastní biosyntézy ze sacharidů a proteinů.  Lipidy jsou pro organismus významné jako zdroj (i zásobní) energie, jako strukturní součásti membrán, jako izolační prvek a cholesterol jako prekurzor steroidních hormonů.  Z klinicko-biochemického hlediska mají význam především cholesterol, triacylglyceroly, mastné kyseliny, fosfolipidy a sfingolipidy. Z hlediska rutinní laboratorní praxe pak zejména cholesterol a triacylglyceroly, jejichž stanovení se provádí denně ve významných množstvích.  Metody stanovení cholesterolu a triacylglycerolů v moderním provedení používají specifické enzymy, vyústěním reakce je modifikovaná Trinderova reakce.  Pro pohyb ve vodném prostředí (zejména krve a lymfy) využívají lipidy proteinové nosiče, apoproteiny (apolipoproteiny), se kterými tvoří lipoproteiny. Apoproteiny tvoří třídy značené velkými písmeny abecedy, případné další dělení využívá římské a arabské číslice.  Apoproteiny mají několik důležitých funkcí: transport lipidů (jako strukturální součást amfipatických lipoproteinů), vazba na specifické receptory, kofaktory lipolytických enzymů (některé apoproteiny).  Existuje polymorfismus některých apoproteinů, výsledkem je různá afinita produktu alely k receptoru rezultující v poruchu metabolismu lipidů.  Různé třídy apoproteinů jsou typické pro různé třídy lipoproteinů. Apoproteiny jsou většinou při metabolismu lipoproteinů směnitelné, kromě apoB.  Apolipoproteiny se stanovují pomocí specifických protilátek.  Lipoproteiny se dělí do skupin na základě ultracentrifugace v hustotním gradientu (chylomikrony, VLDL, LDL, HDL) nebo elektroforetického dělení (chylomikrony, -lipoproteiny, pre-lipoproteiny, - lipoproteiny)  Metabolismus lipoproteinů je komplikovaný. Prvotní formou vstřebaných lipidů (zejména tuků) jsou chylomikrony, které postupně odevzdávají tkáním triacylglyceroly a částicím HDL cholesterol, estery cholesterolu a fosfolipidy. Chylomikronové zbytky končí převážně v játrech. Zde dochází k syntéze tuků tělu vlastních, které ve formě VLDL opouštějí játra a výměnou apolipoproteinů i lipidového obsahu postupně přecházejí na IDL a LDL. Prostředníkem v těchto dějích jsou částice HDL. V principu HDL „odklízí“ z buněk a LDL „přiváží“ do buněk, zejména cholesterol. LDL mohou vstoupit do jater a tam být degradovány. Důležitou roli v odklízení zbytků hrají i makrofágy a speciální bílkovinné molekuly, patřící do tzv. ABC superrodiny membránových transportérů-přenašeců. V celém metabolismu se uplatňuje i řada enzymů, jejichž postižení může podstatně metabolismus lipidů ovlivnit.  Různé lipoproteiny mají různou afinitu k cévnímu endotelu, podle toho vykazují různou aterogenitu, čili riziko ohrožení aterosklerózou. Nejvyšší aterogenitu vykazuje lipoprotein(a).  Metody stanovení lipoproteinů jsou ultracentrifugace v hustotním gradientu, elektroforéza lipoproteinů a imunochemické metody.  Imunochemické metody se využívají ke stanovení HDL a LDL cholesterolu, přičemž moderní metody jsou homogenní (přímé), nevyžadující žádné separace či oddělené kroky analýzy a jsou snadno proveditelné na biochemických analyzátorech. Fungují na různých principech, kdy cíl je vždy stejný – zamezit reakci non-HDL, resp. non-LDL částic. K tomu se využívají zejména blokovací činidla (blokační metody), protilátky (imunoinhibiční metody) nebo rozrušení non-částic specifickou reagencií (eliminační metody).  Moderní metodou je stanovení LDL-částic (partikulí) nukleárně magnetickou rezonanční spektrometrií.  Poruchy metabolismu lipidů se týkají transportu lipidů (dyslipoproteinémie) nebo ukládání lipidů (sfingolipidózy).  Dyslipoproteinémie patří mezi nejčastěji se vyskytující metabolické poruchy v populaci, jsou jednou z příčin kardiovaskulárních onemocnění. Je to skupina poruch metabolismu lipidů, na jejichž vzniku se vždy podílí nejméně dva faktory - genetické a zevního prostředí. Jsou charakterizovány změnami v koncentracích cirkulujících lipoproteinů. Dělí se podle příčiny (vrozené a sekundární) a podle Klinická biochemie Kapitola 11. Lipidy a lipoproteiny 14-37 laboratorního nálezu (zastaralá Fredericksonova klasifikace, moderní terapeutická klasifikace).  Poruchy z ukládání lipidů mají svůj původ v defektech buněčných enzymů zúčastněných v přeměnách lipidů a dělí se na metabolické poruchy katabolismu cholesterolu (Wolmanova choroba, familiární deficit LCAT) a na poruchy v přeměně sfingolipidů, sfingolipidózy . Názvy chorob jsou podle ukládajícího se lipidu (gangliozidóza, glukocerebrozidózy, sfingomyelinóza, ceramidóza aj.) nebo podle autora, který ji první popsal (Gaucherova choroba, Fabryho choroba apod.).  Vyšetření krevních lipidů vyžaduje speciální přípravu (preanalytickou fázi), zahrnující hladovění vyšetřované osoby po určitou dobu a vystříhání se některých činností a potravin.  Při poruchách metabolismu lipidů se mohou kromě základních stanovení (celkový cholesterol, HDL a LDL cholesterol, případně apoA-I a apoB100) provádět i specializovaná vyšetření krevních lipidů, většinou dostupná pouze na specializovaných pracovištích (DNA metody pro odkrytí defektu příslušných genů, vyšetření izoforem apoE, vyšetření defektu příslušných enzymů a proteinových přenašečů, vyšetření funkční aktivity LDL receptorů aj.).  Aterosklerózou se rozumí nebezpečné hromadění tukovitých depozit (plátů) v tepnách. Tento děj je podporován zánětem. Zánět může spouštět např. nadbytek LDL částic ve stěnách tepen. O probíhajícím zánětu informuje stanovení CRP. Pokud je plát vytvořen, lze stupeň jeho nestability zjistit stanovením myeloperoxidázy (MPO).  Existuje Společné doporučení České společnosti klinické biochemie ČLS JEP a České společnosti pro aterosklerózu ČLS JEP ke sjednocení hodnotících mezí krevních lipidů a lipoproteinů pro dospělou populaci, kde jsou (mimo jiné¨) uvedeny i tzv. „hodnoticí meze“, jakési „cílové hodnoty“ pro krevní lipidy. Má se za to, že nepřekročení těchto mezí snižuje ohrožení organismu aterosklerózou.  Nejdůležitější hodnoticí meze: Celkový cholesterol (mmol/l) 2,90 5,00 LDL cholesterol (mmol/l) 1,20 3,00 HDL-cholesterol muži (mmol/l) 1,00 2,10 HDL-cholesterol ženy (mmol/l) 1,20 2,70 Triacylglyceroly (mmol/l) 0,45 1,70  Moderní názory myšlenky na původ aterosklerózy poněkud upravují. Zpochybňují např. úlohu cholesterolu v procesu aterosklerózy (netýká se nadbytečného zoxidovaného cholesterolu při poruchách lipidového metabolismu), uvádí se, že vyšší hodnoty sérového cholesterolu v seniorském věku korelují se zachováním lepších kognitivních schopností, se zábranou demence apod. Tyto názory je ještě potřeba potvrdit nebo vyvrátit. Klinická biochemie Kapitola 11. Lipidy a lipoproteiny 14-38 14.12. Kontrolní otázky 1. Jaká společná vlastnost sdružuje „lipidy“ do této skupiny? 2. Jak se lipidy dopravují v krevní plasmě? 3. Co jsou to apo(lipo)proteiny, jak se rozdělují? K čemu slouží? Liší se jejich složení podle původu částic (např. podle původu triglyceridů)? Jak se označují třídy apoproteinů? 4. Co je to lipoprotein? Znáte názvy skupin lipoproteinů a původ těchto názvů (zkratek)? 5. Jaký je význam lipoproteinových receptorů? Jaké mají funkce? 6. Chápete alespoň rámcově metabolismus lipoproteinů? Dochází během metabolismu lipoproteinů k výměnám apoproteinů? Všech? 7. Je HDL uniformní, jednotná skupina lipoproteinů? Z čeho se HDL částice skládají? Jakou mají HDL částice fyziologickou funkci? 8. Jak byste stanovili jednotlivé apo(lipo)proteiny? 9. Víte jak se rozdělují lipoproteiny v homogenním stejnosměrném elektrickém poli? Jaký je vztah výsledku tohoto dělení k dělení lipoproteinů ultracentrifugací v hustotním gradientu? 10. Jak se stanovuje celkový cholesterol? 11. Jaký je rozdíl mezi celkovým, HDL a LDL cholesterolem? Tušíte jejich fyziologickou funkci? 12. Chápete obecný princip přímého stanovení HDL a LDL cholesterolu? Jakou roli v tom hrají metody na stanovení celkového cholesterolu? 13. Nebylo by lepší vymyslet metodu na úplné odstranění cholesterolu z organismu (než na jeho snižování)? Každou odpověď zdůvodněte. 14. Co jsou to triaclyglyceroly? Jakou mají fyziologickou funkci? Kde se skladují? 15. Co víte o tukové tkáni? 16. Jak se stanovují triacylglyceroly? 17. Co jsou to „omega 3“ a „omega 6“ kyseliny? 18. Víte co jsou to dyslipoproteinemie? Jak se rozdělují? Jak vznikají? Jaké jsou jejich důsledky? Jak a kde se vyšetřují? Co z toho můžete vyšetřit v „běžné“ klinicko-biochemické laboratoři? Jakými metodami? 19. Existují i jiné choroby s původem v tukovém metabolismu? 20. Dokážete rozdělit lipidy do jednotlivých skupin? Jak se tyto skupiny jmenují? Jaké mají společné znaky? Zopakujte si co jsou to estery, co je to glycerol, sfingosin... Užitečné adresy: http://erkki.kennesaw.edu/schem220/lipoprotein.gif http://search.live.com/images/results.aspx?q=lipoprotein&FORM=BIRE# Vybrané obrázky Klinická biochemie Kapitola 11. Lipidy a lipoproteiny 14-39 OBSAH: Kapitola 14 Lipidy ........................................................................................................................................ 14-1 14.1. Cholesterol je živočišný sterol........................................................................................................ 14-2 14.1.1. Metody stanovení cholesterolu............................................................................................... 14-3 Neenzymové metody stanovení cholesterolu a jejich principy....................................................... 14-3 Referenční metoda pro stanovení celkového cholesterolu ........................................................... 14-3 Princip enzymových metod stanovení cholesterolu ....................................................................... 14-4 14.2. Triacylglyceroly jsou estery glycerolu a mastných kyselin............................................................. 14-4 14.2.1. Metody stanovení triacylglycerolů .......................................................................................... 14-5 14.3. Volné mastné kyseliny ................................................................................................................... 14-6 14.4. Fosfolipidy jsou estery mastných kyselin se sfingosinem nebo s glycerolem ............................... 14-7 14.5. Všechny plazmatické lipidy se vážou na bílkoviny ........................................................................ 14-7 14.5.1. Apoproteiny a jejich základní charakteristiky.......................................................................... 14-9 14.5.1.1. Metody stanovení apolipoproteinů ................................................................................ 14-10 14.5.2. Lipoproteiny a jejich základní charakteristiky ....................................................................... 14-11 14.5.3. Metabolismus lipoproteinů je komplikovaný ......................................................................... 14-11 HDL představuje velmi heterogenní populaci lipoproteinů........................................................... 14-15 Lipoprotein(a), Lp(a), obsahuje apoprotein(a).............................................................................. 14-17 14.5.4. Metody stanovení lipoproteinů.............................................................................................. 14-20 Ultracentrifugace .......................................................................................................................... 14-20 Elektroforetické dělení.................................................................................................................. 14-20 14.5.4.1. Metody stanovení HDL-cholesterolu ............................................................................. 14-21 Precipitační frakcionace........................................................................................................... 14-21 Elektroforetické stanovení........................................................................................................ 14-21 Gradientová gelová elektroforéza (GGE)................................................................................. 14-21 Kapilární izotachoforéza........................................................................................................... 14-21 Vysokoúčinná gelová chromatografie (HPGC) ........................................................................ 14-21 Imunochemická separace ........................................................................................................ 14-21 Ultracentrifugace v hustotním gradientu .................................................................................. 14-21 Homogenní metody (přímé metody)............................................................................................. 14-21 Referenční metody ....................................................................................................................... 14-22 14.5.4.2. Metody stanovení LDL-cholesterolu.............................................................................. 14-22 Výpočet koncentrace LDL-C .................................................................................................... 14-22 Ultracentrifugační separace lipoproteinů ................................................................................. 14-22 Vysokoúčinná gelová chromatografie (HPGC) ........................................................................ 14-23 Precipitace sulfatovanými polyanionty..................................................................................... 14-23 Elektroforetické stanovení LDL-C ............................................................................................ 14-23 Imunoseparační metoda .......................................................................................................... 14-23 Referenční metoda....................................................................................................................... 14-24 14.5.4.3. Klinické poznámky......................................................................................................... 14-24 Nejnovější technikou pro stanovení lipoproteinů je NMRS .......................................................... 14-25 14.6. Co jsou to lipidové indexy ............................................................................................................ 14-25 Aterogenní index (KLIMOV) = (cholesterol – HDL-C) / HDL-C.............................................. 14-25 Poměr LDL / HDL = LDL-C / HDL-C ........................................................................................ 14-25 Poměr TG / HDL = triacylglyceroly / HDL-C ............................................................................ 14-25 Poměr apoA-I / apoB = apolipoprotein A-I / apolipoprotein B.................................................. 14-25 14.7. Poruchy metabolismu lipidů se týkají transportu nebo ukládání lipidů ........................................ 14-26 14.7.1. Poruchy transportu lipidů...................................................................................................... 14-26 Specializovaná vyšetření krevních lipidů...................................................................................... 14-27 14.7.2. Poruchy z ukládání lipidů...................................................................................................... 14-28 14.8. Klíčovou úlohu v ateroskleróze hraje zánět ................................................................................. 14-29 14.9. Několik slov o polyenových mastných kyselinách ....................................................................... 14-31 14.9.1. Omega-3-nenasycené mastné kyseliny (n-3 kyseliny)......................................................... 14-31 14.9.2. Omega-6 nenasycené mastné kyseliny (n-6 kyseliny) ......................................................... 14-31 14.10. Dodatky...................................................................................................................................... 14-32 14.10.1. Coated pits čili potažené jamky.......................................................................................... 14-32 14.10.2. NMR-spektroskopie ............................................................................................................ 14-33 11.10.3. Kardiolipin ........................................................................................................................... 14-34 14.11. Stručné shrnutí kapitoly ............................................................................................................. 14-36 14.12. Kontrolní otázky ......................................................................................................................... 14-38