Klinická biochemie Kapitola 19. Biomarkery Pavel Nezbeda 19-1 Kapitola 19 Biomarkery Na patologické procesy v organismu lze mnohdy usuzovat z přítomnosti látek (v tělních tekutinách) obecně zvaných markery či biomarkery. Česky bychom asi řekli ukazatelé, resp. bio(logičtí)ukazatelé, i když známějším českým ekvivalentem anglického marker je značkovač, případně i zvýrazňovač (viz obrázek). Od biomarkerů očekáváme zejména časnou informaci o stavu, který by při prodlení nejspíše vedl k fatálním koncům. Časná léčba je mnohdy jedinou možností jak dotyčnému prodloužit život, resp. zlepšit jeho prožívání po ataku choroby či poškození. Jakékoli otálení může být v mnoha případech osudné a zachycení časných známek poruchy normálního stavu se tak stává rozhodujícím. Ne vždy však mají biomarkery pouze tento význam – mohou sloužit i ke sledování průběhu choroby, k identifikaci jejího pozastavení (remisi) či vymizení, ale i jejího návratu. V podstatě veškeré analyty, které v laboratoři testujeme, se kterými jsem se již setkali, i nesetkali, jsou biomarkery. Některé lepší, jiné horší. V této kapitole se zaměříme zejména na typické, případně moderní, nově objevené, markery  maligních procesů (tumorové markery či onkomarkery),  postižení myokardu (ischemie a srdeční nedostatečnosti),  patologie kostního metabolismu,  akutního ledvinového selhání,  zánětu a sepse. Marker [angl.] = ukaz(ov)atel, oznamovatel, popisovač, návěstidlo, značka, značkovadlo 19.1. Nádorové markery Nádorové markery je možno definovat jako laboratorně prokazatelné známky v biologických tekutinách, tkáních nebo buňkách, pomocí kterých je možno prokázat:  riziko vzniku nádoru (tumoru),  přítomnost nádoru  prognózu vývoje onemocnění  účinnost, neúčinnost či škodlivost terapie  vznik metastáz nebo reziduální choroby nádorového onemocnění. Obdobná definice říká, že nádorovým markerem se rozumí substance, která se nachází v nádoru, nebo ji nádor produkuje, nebo je produkována jako odpověď hostitele na přítomnost nádoru, a kterou je možno použít k diferenciaci nádoru od normální tkáně, nebo na základě analýzy tělesných tekutin využít k úvaze o přítomnosti nádoru (tumoru) v organismu. Tato substance je měřitelná. Synonymem názvu je tumorový marker (TM), případně onkomarker. Jako tumorové markery, klinicky užitečné, mohou sloužit i některé genetické abnormality, jejichž užitečnost tkví zejména ve specifikaci abnormality nádorových buněk, která určí způsob léčby. Může se jednat o přímou detekci mutací v DNA, o stanovení proteinových produktů onkogenů, o zjištění postranslačních modifikací proteinových produktů onkogenů v maligní tkání i o nově zjištěné genetické změny v maligní buňce, případně o detekci mutací v tumor supresorových genech. Metody zjišťování těchto TM jsou částečně popsány v kapitole 22. Onkogeny jsou geny, jejichž mutace způsobí neřízené dělení buňky a stává se tak základem pro nádorové bujení. Tumor supresorové geny (antionkogeny) jsou geny, které svou činností vzniku tumoru. Jsou zodpovědné za stabilitu genomu a zabraňují replikaci poškozené DNA. Koncentrace tumorových markerů v séru má obvykle přímý vztah k typu a rozsahu onemocnění. Rozlišovací schopnost nádorových markerů umožňuje v příznivých případech odhalit nádor o hmotnosti 1 mg, tedy asi 10 6 maligních buněk, zatímco klinická diagnóza bývá určena většinou až u nádoru, který obsahuje asi 10 9 buněk. Hlavní rolí nádorových markerů je sledování průběhu choroby a účinnosti terapie. Snaha o systemizaci tumorových markerů je různorodá tak, jak různorodé jsou samotné markery. Nejjednodušší dělení je na tumorové markery produkované  samotným nádorem, které se nazývají antigeny sdružené či asociované s nádorem  jinými tkáněmi (jako odpověď na maligní proces v organismu), což sou indukované nádorové markery, např. proteiny akutní fáze. Asi nejobvyklejší představa markeru – značkovače, zvýrazňovače Klinická biochemie Kapitola 19. Biomarkery Pavel Nezbeda 19-2 Podle výskytu v organismu lze rozlišit tumorové markery  celulární (vyskytují se v tkáni zhoubného nádoru)  humorální (vyskytují se v tělních tekutinách). Užitečné je i dělení na tumorové markery  diferenciační, které slouží k rozlišení typu nádoru  proliferační, podle kterých lze usuzovat na aktivitu nádoru. Tyto principy organizace tumorových markerů jsou využity v následujícím schématu. Tumorové markery Proliferační Diferenciační Celulární Humorální Další metabolity Sérové proteiny Hormony Enzymy S nádorem asociované (Šimíčková, M., Nekulová, M., MOÚ Brno) CEA karcinoembryonální antigen AFP -1-fetoprotein MCA antigen mucinózních karcinomů CYFRA 21-1 fragment cytokeratinu 19 SCCA antigen skvamózních buněk Antigeny CA *) -typu : CA 15-3, CA 72-4, CA 19-9, CA 125, CA 50, CA 549, CA 242, CAM 26, CAM 29 NSE neuron-specifická enoláza TK thymidinkináza PAP prostatická frakce kyselé fosfatázy LD laktátdehydrogenáza hCG lidský choriogonadotropin TG tyreoglobulin CT kalcitonin PRL prolaktin GH růstový hormon PTH parathormon ADH antidiuretický hormon PSA prostata specifický antigen FER feritin B2M 2-mikroglobulin RAF reaktanty akutní fáze CIC cirkulující imunokomplexy Monoklonální imunoglobuliny VMK kyselina vanilmandlová HIOK kyselina hydroxyindoloctová MEL melanogeny UGP močový gonadotropinový peptid NMP-22 proteiny nukleární matrix S-100 protein S-100 ER, PR receptory estradiolu a progesteronu CD katepsin D HER-2/neu (=c-erbB-2) onkoprotein HER-2/neu p53 protein kódovaný tumorsupresorovým genem p53 TPA tkáňový polypeptidový antigen TPS tkáňový polypeptidový antigen (specifický Možné schéma rozdělení nádorových (tumorových) markerů (TM) Klinická biochemie Kapitola 19. Biomarkery Pavel Nezbeda 19-3 Následující schéma ukazuje přístup nedávno zesnulého prof. Masopusta ke klasifikaci tumorových markerů. Asi nejužitečnější (i z hlediska laboratorní praxe) bude přidržet se dělení TM podle „Doporučení“ ČSKB, naznačeného v následujícím schématu a opatřeném odkazy na relevantní místa v učebním textu. Tumorové markery hormony receptory hormonů antigeny faktory transdukce signálu onkogeny a antionkogeny s nádorem sdružené (asociované) nádorem tvořené enzymy Onkofetální (AFP, CEA….) Onkoplacentární (hCG, izoenzymy ALP) „Carcinoma Antigens“ (CA 19-9, CA15-3,…) Paraproteiny Kalcitonin, katecholaminy, metanefriny NSE, LD, TK, PSA, ACPP… CRP, hemoglobin ve stolici (okultní krvácení) BRCA1, p53,… HER2/neu, … Signální transdukce jako obecný mechanismus přenosu informace mezi buňkami jednotlivých soustav hraje klíčovou roli v patogenezi onemocnění. Jako příklady lze uvést zánětlivou odpověď organismu nebo poruchy lipidového metabolismu. Narušení signální transdukce a regulace kaskád je jednou z příčin maligního bujení. Poruchy receptorů na genové úrovni vedou k závažným metabolickým a endokrinním onemocněním, ale také vedou ke změnám kontraktility srdečního svalu. Prof. MUDr Tomáš Zima, DrSc., Doc. RNDr Petr Štern, CSc., Signální transdukce (část II). Prof. MUDr Jaroslav Masopust, DrSc., ÚKBP, 2. lékařská fakulta UK v Praze, Labor Aktuell, 02/04, str. 4-8, Nádorové markery včera, dnes a zítra (1. část) JEDEN Z NÁHLEDŮ NA KLASIFIKACI TUMOROVÝCH MARKERŮ Solubilní nádorové markery Markery vyšetřované z krve Markery vyšetřované z krve i z moče Markery vyšetřované z moče Markery vyšetřované ze stolice Tkáňové a buněčné markery DNA ploidie (počet chromosomů) [mimo rámec tohoto textu] Cirkulující buněčné elementy [mimo rámec tohoto textu] Tumorové markery CEA, AFP, hCGG, CA (19-9, 15-3, 125, 72-4), HE4, PSA, S-100 beta, NSE, SCCA, CYFRA 21-1, TPA, TPS, TK, CgA, P1NP, ICTP, B2M, feritin, LD, kalcitonin, TG, ProGRP, tumor M2-PK, Ihibin, ACTH a ACTH like substance Monoklonální Ig, [kap. 13, str. 13-10] VMA, katecholaminy, metanefriny [kap. 17, str. 17-44] 5-HIAA [kap. 17, str. 17-13] Cirkulující nádorové buňky Cirkulujíčí endotelové buňky (CEC) a cirkulující endoteliální prekursory (EPC) Hb ve stolici (kap 6, str. 6-10) Dělení TM podle „Doporučení k využití nádorových markerů v klincké praxi“ [ČSKB] Klinická biochemie Kapitola 19. Biomarkery Pavel Nezbeda 19-4 19.1.1. Přehled některých tumorových markerů a jejich klinické využití *) CA = carbohydrate antigen, nádorové antigeny definované na podkladě monoklonální protilátky, číslo za zkratkou charakterizuje monoklonální protilátku užitou proti tomuto antigenu v testu; zkratka „CA“ byla převzata z komerčních setů; v poslední době se zkratka vysvětluje i jako „Carcinoma antigens“ differentialis [lat.] = diferenciální, rozlišující ; differentiatio [lat.] = diferenciace, různost, rozlišování, roztřídění proliferatio [lat.] = proliferace, novotvoření, bujení, chorobný růst (např. tkáně) proliferativus [lat. = rostoucí, bující, charakterizovaný bujením, proliferativní, proliferační Nádor Nádorové markery Diferenciační Proliferační Nádory zažívacího traktu Jícnu CA 72-4, SCCA TPS Žaludku CA 72-4, CEA TPA, TK Tlustého střeva CA 19-9, CEA TPS Hepatom AFP Žlučových cest CA 19-9, AFP TPS Pankreatu CA 19-9, CA 72-4 TPA, TK Peritonea CA 125 Nádory močového ústrojí Ledvin NSE, CEA TPA Močového měchýře CEA TPA Prostaty PSA, fPSA *) TPS Nádory varlat Seminomy AFP, -hCG, NSE TK Nonseminomy AFP,-hCG TPS Nádory prsu CEA, CA 15-3 TPS Gynekologické nádory Ovárií serózní CA 125 TPS Ovárií mucinózní CA 72-4, CA 19-9 TPS Ovárií germinativní AFP, -hCG TPS Těla děložního SCCA, CA 125 TPS Ektocervixu SCCA, CEA TPS Endocervixu CEA TPS Vejcovodů CA 125 TPS Nádory plic a pleury Epidermoidní SCCA, CEA, CYFRA 21-1 TPS Malobuněčné NSE, CEA TPS Adeno Ca CEA, CA 125 TPS Velkobuněčné CYFRA 21-1 TPS, TK Pleury CA 125 TPS Maligní lymfomy Hodgkinova choroba -mikroglobulin, ferritin TK Nehodgkinské lymfomy -mikroglobulin TPS Hematologické malignity Plasmocytom -mikroglobulin Leukémie -mikroglobulin, ferritin TPS, TK Nádory CNS Neuroblastom NSE TK Klinická biochemie Kapitola 19. Biomarkery Pavel Nezbeda 19-5 Zvýšené hladiny tumorových markerů v séru se mohou vyskytovat i u některých nemaligních onemocnění, za některých fyziologických stavů či okolností bez vztahu k nádorovému bujení, z čehož jasně vyplývá, že název „tumorové markery“ zcela situaci nevystihuje. Krátký přehled zvýšených hodnot tumorových markerů z různých příčin je uveden v následující tabulce: “ ) Topolčan, O, Holubec, L., jr., Pecen L., Pikner R., Svobodová S.,: Changes in tumor marker values in pregnant women in their IInd trimester, Fakultní nemocnice Plzeň Doposud nebyl objeven žádný univerzální tumorový marker, ani specifita či senzitivita metod nedosahuje 100%. Znamená to tedy, že nezvýšená koncentrace nádorového markeru není ještě důkazem nepřítomnosti maligního onemocnění, a naopak pozitivní výsledek nemusí nutně znamenat zhoubný nádor. NÁDOROVÝ MARKER NEMALIGNÍ ONEMOCNĚNÍ JINÁ PŘÍČINA CEA (karcinoembryonální antigen) zánětlivé choroby jater jaterní cirhóza pankreatitida kouření AFP -fetoprotein) zánětlivé procesy plic, GIT jaterní cirhóza akutní i chronická hepatitida těhotenství *) TPA (tkáňový polypeptidový antigen) infekční procesy obecně jaterní cirhóza pankreatitida CA 15-3 jaterní cirhóza akutní hepatitida postižení ledvinových glomerulů těhotenství *) MCA (antigen mucinózních karcinomů) viz CA 15-3, výraznější CA 125 ovariální cysty záněty adnex choroby jater, pankreatu, žlučníku těhotenství (1. trimestr) CA 19-9 cirhóza jater cholelitiáza chronická hepatitida akutní a chronická pankreatitida choroby žlučových cest diabetes cystická fibróza CA 72-4 benigní mammární nádory těhotenství *) PSA (prostata specifický antigen) benigní hyperplazie prostaty palpace hCG (lidský choriogonadotropin) mola hydatidóza těhotenství -mikroglobulin postižení ledvin TK (thymidinkináza) interference herpes-viry B12 deficience SCCA (antigen skvamózních buněk) záněty plic poruchy ledvin, jater Ferritin záněty obecně poruchy metabolismu železa CYFRA 21-1 (CYFRA = cytokreatin fragments; detekce fragmentů cytokeratinu) choroby urologického traktu myomy, ovariální cysty Klinická biochemie Kapitola 19. Biomarkery Pavel Nezbeda 19-6 Metody stanovení a zjišťování (přítomnosti) tumorových markerů odpovídají jejich charakteru. Vzhledem k různorodosti povahy nádorových markerů, jsou i metody stanovení (resp. průkazu) různorodé. Používají se metody chemické, imunochemické i metody molekulární biologie. Principy většiny používaných metod jsou popsány v tomto učebním textu (viz např. ligandové techniky, kapitola 13, metody analýzy DNA, kapitola 22, kvantitativní stanovení hemoglobinu ve stolici, kapitola 6 a odkazy ve schématu na str. 19-3 ) na některé další bude nutno nahlédnout do příslušné literatury (metody genetiky apod.). Vývoj přístrojové techniky (zejména v oblasti imunochemických metod konstrukcí dokonalých automatických analyzátorů) zpřístupnil stanovení mnohých markerů, včetně tumorových, dříve dislokovaných na specializovaná pracoviště i pracovištím klinické biochemie a stanovení tumorových markerů patří dnes mezi běžné, rutinní analýzy. To ovšem nevylučuje nutnost edukace laboratorních pracovníků na všech stupních právě v tomto oboru *) . *) Základní edukační pomůckou může být již citované Doporučení k využití nádorových markerů v klinické praxi, uveřejněné na stránkách ČSKB (viz). Na pracovištích klinické biochemie se obvykle stanovují solubilní markery ze séra nebo z plazmy (není-li uvedeno jinak, jsou hodnoty pro oba materiály totožné), z moči, případně i z likvoru nebo ze stolice. Vzorky krve většinou vyžadují včasné a důkladné oddělení krevních elementů od séra (plazmy) a zpracování v konkrétním časovém intervalu nebo zamražení biologického vzorku, pokud v tomto časovém intervalu vzorek zpracován nebude. Je důležité důkladně se seznámit s doporučeními a pokyny výrobce dané diagnostické soupravy pro stanovení markeru a dodržovat je, protože některé faktory v preanalytické fázi mohou významně ovlivnit výsledek analýzy. Kromě dodržení času oddělení krevních elementů a průběhu centrifugace (doba a relativní odstředivá síla), je důležité i použití vhodné odběrové nádobky, zejména nádobky se separačním gelem (některé gely se ukázaly být pro imunochemické analýzy některých analytů nevhodné). Rovněž je třeba si uvědomit, že v imunochemii se pracuje s koncentracemi analytů o několik řádů nižšími než v běžné biochemické analýze, takže kontaminace vzorku analyzovaném po předcházejícím vysoce pozitivním vzorku může být významná. Analyzátory tuto záležitost řeší buď dokonalým mytím dávkovačů (patent fy Abbott) nebo používáním jednorázových dávkovacích špiček na dávkovačích (ostatní analyzátory). Kontaminace ale může přijít v preanalytické fázi i ze strany laborantů, nedodržením zásad správné laboratorní práce. Ovlivnění výsledku může nastat i v přípravě pacienta, ale to jsou záležitosti podrobně diskutované v kapitole 2, ze značné části věnované preanalytické fázi. Na obrázcích jsou ukázky dvou nových, moderních imunochemických analyzátorů firem DiaSorin a Siemens. Advia Centaur XPT System Automatický imunochemický analyzátor firmy Siemens LIAISON XL Automatický imunochemický analyzátor firmy DiaSorin Klinická biochemie Kapitola 19. Biomarkery Pavel Nezbeda 19-7 19.1.2. Charakteristika některých vybraných nádorových markerů 19.1.2.1. CEA (karcinoembryonální antigen) Glykoprotein s molekulovou hmotností 180 kDa, z 55% tvořen sacharidy (heterogenní složka), z 45% bílkovinami (homogenní složka). Jsou známy 4 různé geny CEA. Onkofetální bílkovina vyskytující se především v epitelových buňkách trávicího ústrojí a bronchů. V prvním trimestru je obsažen v buněčné cytoplazmě, později je součástí povrchu buněčných membrán u plodu. U dospělých je produkován velmi omezeně, v minimální koncentraci se vyskytuje v krvi, pleurálním výpotku, ascitu a likvoru, nejvyšší koncentrace jsou ve slinných žlázách. Fyziologická funkce není známa (ani u plodu, ani u dospělých). Biologický poločas je 14 dnů. Referenční hodnoty: 0 - 5 g/l Hraniční hodnoty: 5 - 8 g/l Patologické hodnoty: > 8 g/l Indikace - nádory:  zažívacího traktu (žaludku, tlustého střeva, peritonea)  močového ústrojí (močového měchýře)  prsu  gynekologické nádory (ekto- a endocervixu)  plic a pleury (epidermoidní, malobuněčné, adeno Ca) 19.1.2.2. AFP (alfa1-fetoprotein) Glykoprotein o molekulové hmotnosti přibližně 70 kDa. Obsahuje asi 4,5% sacharidů, patří mezi onkofetální antigeny, strukturou je podobný albuminu. Je produkován žloutkovým vakem a později játry plodu. Přechází i do plodové vody. Ve fetální plazmě je nevyšší koncentrace AFP mezi 10. - 13. týdnem těhotenství (asi 3 g/l), podobně v plodové vodě (v 15. týdnu asi 40 mg/l), v termínu porodu je ve fetální plazmě asi 80 mg AFP/l. Ve 2 letech je hladina AFP pod 10 g/l, pod touto hranicí jsou i hladiny AFP u zdravých dospělých jedinců. V mateřském séru se hladina AFP zvyšuje, maxima dosahuje 1 - 2 měsíce před porodem (asi 400 g/l). Fyziologická funkce - u plodu zprvu nahrazuje albumin a jeho transportní funkce. U dospělých není jasná. Biologický poločas je 3 - 6 dnů Referenční hodnoty: 0 - 5 kIU/l Hraniční hodnoty: 5 - 10 kIU/l Patologické hodnoty: > 10 kIU/l Indikace – nádory:  zažívacího traktu (hepatom, žlučových cest)  varlat (seminomy a nonseminomy)  gynekologické nádory (ovárií germinativní); germinom = novotvar ze zárodečných buněk 19.1.2.3. PSA, fPSA (prostata specifický antigen) Glykoprotein s molekulovou hmotností 34 kDa, z 90% tvořen jednoduchým polypeptidickým řetězcem 238 AK a z 10% sacharidy. Patří do skupiny kalikreinů (serinových endopeptidáz). Je specifickým produktem prostatické tkáně zdravé i zhoubné. Je přítomen v prostatické tekutině, seminální plazmě, ve zdravé, hyperplastické i maligní prostatické tkáni a v metastázách prostatického původu. Je produkován i paraureterálním žlázami a je přítomen ve velice nízkých koncentracích i u žen. V séru je přítomen v několika formách, tři hlavní jsou: volný PSA (fPSA), vázaný na 2-makroglobulin a na 1-antichymotrypsin. Volný PSA a komplex s antichymotripsynem jsou imunologicky detekovatelné. Formy PSA PSA volný (fPSA) PSA vázaný na 2-makroglobulin PSA vázaný na 1-antichymotrypsin Klinická biochemie Kapitola 19. Biomarkery Pavel Nezbeda 19-8 Volný PSA (fPSA), který představuje asi 15% celkového či komplexního PSA (cPSA) se vyskytuje v několika různých formách: BPSA, proPSA a jako intaktní (nezměněný). Kromě proPSA v nativní formě existují i tzv. zkrácené formy, z nichž [-2]proPSA je nejstabilnější a bude mít zřejmě i klinické využití v diagnostice nádoru prostaty. Fyziologická funkce: PSA je serinovou proteázou a je zodpovědný za ztekucení semenné plazmy. Biologický poločas: PSA 2 - 3 dny, fPSA 7 hodin Norma hodnot PSA: 0 - 4 g/l Hraniční hodnoty: 4 - 10 g/l Patologické hodnoty: > 10g/l Indikace – nádory prostaty. fPSA (stanovuje se u hodnot PSA 4 - 10 g/l; hodnotí se poměr koncentrací fPSA/PSA v %) Maligní nádor: 0 - 15% Hraniční hodnoty: 15 - 20% Benigní onemocnění: > 20% Příklad postupu při testování PSA: Pacient (starší 40 let) odpoví na tři otázky týkající se  Kvality močení (včetně osobních pocitů)  Výskytu rakoviny prostaty v příbuzenstvu  Event. obsahu krve v moči Kladná odpověď na alespoň jednu z uvedených otázek znamená indikaci k vyšetření PSA podle uvedeného schématu. Poznámka: v poslední době se význam screeningu hladiny PSA zpochybňuje; důvodem je skutečnost, že z hladin PSA se obtížně odlišuje benigní hyperplazie prostaty od zhoubného nádoru; muži se zvětšenu prostatou jsou pak přehnaně diagnostikování a léčeni. (ZN, 43/2009, str.11) 19.1.2.4. hCG (lidský choriogonádotropní hormon - viz kapitola 14., str. 14-35) Glykoprotein o relativní molekulové hmotnosti asi 40 kDa. Tvoří se v trofoblastických buňkách placenty v průběhu těhotenství a stimuluje růst žlutého tělíska. V krvi a v moči se nacházejí jak intaktní molekula hCG, tak - ipodjednotky a štěpné produkty-podjednotky: free- a -core. Biologický aktivní je pouze intaktní molekula hCG. Pro nádorovou diagnostiku se jeví specifičtější stanovování -podjednotky (-hCG). Fyziologická funkce - v těhotenství slouží k imunotoleranci plodu imunitním systémem matky Biologický poločas: 1,5 - 2,5 dne Referenční hodnoty: 0 - 5 IU/l Hraniční hodnoty: 5 - 10 IU/l Patologické hodnoty: > 10 IU/l Indikace – nádory:  nádory varlat (seminomy i nonseminomy)  gynekologické nádory (ovárií germinativní) Schéma testování PSA PSA < 3 Negativní PSA ≥ 10 Pozitivní 3 ≤ PSA < 10 Zkontrolovat fPSA fPSA/PSA ≥ 0,25 Negativní fPSA/PSA ≤ 0,14 Pozitivní Zkontrolovat za 2 roky Vyšetřit urologem 0,14 ≤ fPSA/PSA < 0,25 Zkontrolovat za 2 roky Vyšetřit urologemZkontrolovat za 6 měsíců PSA Formy fPSA Klinická biochemie Kapitola 19. Biomarkery Pavel Nezbeda 19-9 19.1.2.5. CA 15-3 Monoklonální protilátkou definovaný nádorový marker mucin-glykoproteinové struktury s molekulovou hmotností 300 - 450 kDa. Patří mezi onkofetální nádorové markery. U plodu se vyskytuje v epitelových buňkách bronchů a jater, u dospělých je povrchovým antigenem žlázových buněk ve vývodech mléčné žlázy. Fyziologická funkce není známa. Biologický poločas: 7 dní Referenční hodnoty: 0 - 22 kIU/l Hraniční hodnoty: 22 - 30 kIU/l Patologické hodnoty: > 30 kIU/l Indikace – nádory prsu. 19.1.2.6. CA 125 Monoklonální protilátkou definovaný nádorový marker mucin-glykoproteinové struktury s molekulovou hmotností kolem 200 kDa. Patří mezi onkofetální nádorové markery. U plodu se vyskytuje v epiteliálních buňkách dýchacího a trávicího ústrojí, u dospělých v epiteliálních buňkách dýchacího ústrojí, vysoké hodnoty se nacházejí s séru těhotných žen a v mateřském mléce. Fyziologická funkce - během vývoje plodu funguje jako diferenciační antigen coelomových tkání [coelom = pravá tělní dutina (vznikající při vývoji mnohých živočichu), obklopená buňkami mezodermálního původu] Biologický poločas: 4 dny Referenční hodnoty: 0 - 30 kIU/l Hraniční hodnoty: 30 - 40 kIU/l Patologické hodnoty: > 40 kIU/l Indikace – nádory:  zažívacího traktu (peritonea)  gynekologické (ovárií serózní, těla děložního, vejcovodů); serózní ovariální nádory = patří mezi nádory z povrchového epitelu  plic a pleury/pohrudnice (adeno Ca, pleury) 19.1.2.7. CA 19-9 Monoklonální protilátkou definovaný mucin-sialo-glykolipid s molekulovou hmotností nad 500 kDa. Patří mezi onkofetální nádorové markery. Výskyt tohoto markeru úzce souvisí s Lewis(a) determinantou krevní skupiny. U plodu se vyskytuje v epitelových buňkách trávicího ústrojí, pankreatu a jater. U dospělých je velice omezeně produkován epiteliálními buňkami bronchů a trávicího ústrojí. V minimálních koncentracích se vyskytuje v krvi, pleurálním výpotku, ascitu a mozkomíšním moku. Eliminuje se výhradně žlučí. Fyziologická funkce není známa. Biologický poločas: 5 dní Referenční hodnoty: 0 - 30 kIU/l Hraniční hodnoty: 30 - 40 kIU/l Patologické hodnoty: > 40 kIU/l Indikace – nádory:  zažívacího traktu (tlustého střeva, žlučových cest, pankreatu)  gynekologické nádory (ovárií mucinózní); mucinózní ovariální nádory = patří mezi nádory z povrchového epitelu 19.1.2.8. CA 72-4 Monoklonální protilátkou definovaný glykoprotein mucinového typu s molekulovou hmotností okolo 400 kDa. Patří mezi onkofetální nádorové markery. U plodu intenzívně produkují tuto bílkovinu povrchové epiteliální struktury jícnu, žaludku a pankreatu, u dospělých se to děje velmi omezeně. Fyziologická funkce není známa. Referenční hodnoty: 0 - 3 g/l Hraniční hodnoty: 3 - 6 g/l Patologické hodnoty: > 6 g/l Indikace – nádory:  zažívacího traktu (jícnu, žaludku, pankreatu)  gynekologické nádory (ovárií mucinózní) Klinická biochemie Kapitola 19. Biomarkery Pavel Nezbeda 19-10 19.1.2.9. SCCA (antigen skvamózních buněk; SCC antigen) Glykoprotein o molekulové hmotnosti 48 kDa, patří do skupiny onkofetálních antigenů. Je produkován dlaždicovými epidermoidními buňkami plodu i dospělých osob. Je přítomen ve středních vrstvách epitelu. Fyziologická funkce - zřejmě hraje důležitou roli při diferenciaci epidermoidních tkání. Biologický poločas: 20 minut Referenční hodnoty: 0 - 1,5 g/l Hraniční hodnoty: 1,5 - 2 g/l Patologické hodnoty: > 2g/l Indikace – nádory:  zažívacího traktu (jícnu)  gynekologické nádory (těla děložního, ektocervixu)  nádory plic a pleury (epidermoidní) 19.1.2.10. NSE (neurospecifická enoláza) Enzym katalyzující přeměnu 2-fosfoglycerátu na fosfoenolpyruvát (viz glykolýza v biochemii). U plodu se vyskytuje v nervové a plicní tkání, u dospělých především v neuroendokrinních strukturách. Fyziologická funkce spočívá v účasti v glykolýze. Referenční hodnoty: 0 - 10 g/l Hraniční hodnoty: 10 - 12,5 g/l Patologické hodnoty: > 12,5 g/l Indikace – nádory:  močového ústrojí (ledvin)  varlat (seminomy)  nádory plic a pleury (malobuněčné)  CNS (neuroblastom) 19.1.2.11. TK (thymidinkináza) Enzym, který za přítomnosti ATP katalyzuje přeměnu thymidinu na thymidinmonosfosfát (TMP). Nazývá se též "záchranný enzym" (salvage enzyme). Je to nespecifický tumorový marker schopný indikovat maligní růst v různých orgánech. U zdravého dospělého jedince se nacházejí jen nízké koncentrace, vyšší hodnoty se mohou vyskytnout i u některých nemaligních onemocnění. Biologický poločas: 2 dny Referenční hodnoty: 0 - 5 U/l Hraniční hodnoty: 5 - 10 U/l Patologické hodnoty: > 10 U/l 19.1.2.12. TPA (tkáňový polypeptidický antigen); TPS (tkáňový polypeptidický specifický antigen) Fragmenty cytokeratinových podjednotek intermediárních filament. Do tělních tekutin se uvolňují pravděpodobně během proliferace nádorových buněk či během nekrózy buněk. TPA detekuje fragmenty cytokeratinů 8, 18 a 19, TPS pouze fragmenty cytokeratinů 8 a 18. Jsou to nespecifické nádorové markery indikující maligní růst v různých orgánech. Fyziologicky jsou produkovány trofoblastem placenty, v játrech, plicích, střevě a ledvinách vyvíjejícího se plodu. U zdravých dospělých se TPA a TPS vyskytují v epiteliální výstelce mléčné žlázy, močového měchýře, v plicích a v orgánech trávicího traktu. Fyziologická funkce je nejasná. Biologický poločas: 7 dní Intermediární (též střední) filamenta chrání buňky a buněčné membrány před roztržením vyvolaném tahem. Existují tři třídy těchto filament, jednu z nich tvoří keratinová filamenta v epiteliálních buňkách. V různých epitelech se nacházejí různé soubory keratinů. Existuje vzácné genetické onemocnění člověka, epidermolysis bullosa simplex, které je důsledkem mutací v keratinových genech, následkem je nemožnost tvorby kreatinových filament v pokožce. Kůže postiženého člověka není odolná proti mechanickému namáhání, i velmi slabý tlak na kůži způsobuje popraskání buněk a tvorbu puchýřů. Stavba keratinů je popsána dále v textu na str. 19-?). TPA TPS Referenční hodnoty: 0 - 120 kIU/l 0 - 85 kIU/l Hraniční hodnoty: 120 - 140 kIU/l 85 - 95 kIU/l Patologické hodnoty: > 140 kIU/l > 95 kIU/l Klinická biochemie Kapitola 19. Biomarkery Pavel Nezbeda 19-11 19.1.2.13. CYFRA 21-1 Fragmenty cytokeratinových podjednotek intermediárních filament (podobně jako u TPA a TPS). Detekují se fragmenty cytokeratinu 19. Cytokeratin 19 je kyselý protein s molekulovou hmotností 40 kDa. CYFRA 21-1 se vyskytuje v buňkách plicní tkáně, dělohy a trávicího ústrojí. Slouží jako ukazatel degradace maligních tkání a buněčné nekrózy. Fyziologická funkce je nejasná. Referenční hodnoty: 0 - 2,5 g/l Hraniční hodnoty: 2,5 - 3,5 g/l Patologické hodnoty: > 3,5 g/l Indikace – nádory: plic a pleury (epidermoidní, velkobuněčné) 19.1.2.14. HE4 Lidský epididymální protein 4 (HE4, resp.WFDC2 – od „whey acidic four-disulfide core“ = WFDC, rodina příbuzných proteinů, „2“ v názvu odkazuje na přítomnost dvou WFDC domén), molekulová hmotnost mezi 20 – 25 kD. epididymis [ř.] = nadvarle whey [angl.] = syrovátka; core{ [angl.] = jádro, střed; podstata Fyziologická funkce Proteinová doména whey acidic protein (WAP) byla identifikována jako hlavní protein syrovátky (mléčného séra), který hraje důležitou roli v regulaci proliferace epiteliálních buněk mléčné žlázy. Fyziologickou funkcí je pravděpodobně aktivita obdobná aktivitě inhibitorů proteáz. Whey acidic protein-type 4-disulphide core (WFDC) je předpokládaným prototypem členů rodiny WAP proteinů; doména sestává z 8 cysteinových zbytků spojených disulfidickými vazbami v ustáleném uspořádání . WFDC1 (prostate stromal protein 20 kDa, PS20) a WFDC2 (major human epididymis-specific protein E4, HE4) jsou užitečnými biomarkery pro detekci tumorů. HE4 se nachází ve vysoké koncentraci u pacientek s karcinomem ovarií. Je to jediný nádorový marker s vysokou senzitivitou pro detekci epiteliálního karcinomu ovarií (EOC), zejména v I. stadiu, kde ostatní markery selhávají. Přitom diagnostika EOC v raném stadiu vývoje nádoru je podmínkou vyléčení. HE4 je novým markerem pro ovariální karcinom, ale pro screening rakoviny vaječníků nelze použít. Pro posouzení rizika ovariálního karcinomu je nutno současně stanovit hodnoty CA125 a HE4 v séru a vypočítat tzv. ROMA skóre, ve kterém se berou v úvahu naměřené hodnoty CA125 a HE4 a menopauzální status u dané pacientky. ROMA™ je zkratkou Risk Of Ovarian Malignancy Algorithm, tj. algoritmus (postup, výpočet) pro zjištění rizika ovariální malignity. Kombinace uvedených prvků v tomto algoritmu/výpočtu, se zdá být v současnosti nejlepším testem pro zjištění rizika malignity tohoto typu: vykazuje vysokou diagnostickou senzitivitu i specifitu. Důležitá je zejména vysoká hodnota senzitivity, protože v tomto případě nebude rozpoznáno jen velmi málo nemocných (vysoké procento záchytu nemoci). Falešná pozitivita u zdravých bude vyloučena následným vyšetřením. Referenční hodnoty: Žena před menopausou Žena po menopause ≥7% vysoké riziko nálezu EOC ≥25,3% vysoké riziko nálezu EOC <7% nízké riziko nálezu EOC <25,3% nízké riziko nálezu EOC Kalkulátor pro výpočet ROMA s hodnotami ARCHITECT HE4 A CA125 si můžete vyzkoušet na adrese: http://www.abbottdiagnostics.com.au/products/Instruments_by_Platform/roma.cfm Z ostatních frekventovanějších TM je to např. S-100 beta protein, popsaný poprvé v nervové tkáni. Vyskytuje se ve formě homoa heterodimerů tvořených z podjednotek  a . Využívá se při monitorování nemocných s maligním melanomem, zvýšené hodnoty lze nalézt i u mozkových maligních nádorů ektodermálního původu, ale mohou být způsobeny i akutním poškozením mozku, kostními zlomeninami, zánětlivým a infekčním onemocněním. Pro screening a diagnostiku se neužívá. Dalším příkladem TM je CgA (Chromogranin A), kyselý glykoprotein z granulí normálních i neoplastických neuroendokrinních tkání. Zvýšené hodnoty se nalézají u nemocných s neuroendokrinními malignitami, u sporadických gastroenteropankreatických neuroendokrinních tumorů i dědičných mnohočetných endokrinních neoplasií typu 1 (MEN), u dětských neuroblastomů, u neuroendokrinní diferenciace karcinomu prostaty nereagující na hormonální léčbu, i v při terapii kortikoidy, poruchách ledvin a jater. Endokrinní neoplasie: Vzácné onemocnění při němž je současně postiženo několik endokrinních žláz. Vyskytuje se sporadicky; většinou jde o hereditární postižení autosomálně dominantního typu. Celá definice (včetně MEN-1, Wernerova syndromu) např. v Medicabáze.cz Klinická biochemie Kapitola 19. Biomarkery Pavel Nezbeda 19-12 19.2. Markery postižení myokardu V této podkapitole se zaměříme na dvě závažné okolnosti omezující, či znemožňující srdeční činnost: ischemii, která může vyústit až v infarkt myokardu a srdeční selhání. 19.2.1. Troponiny Infarkt myokardu je složitá klinická jednotka určená řadou patologických, elektrokardiografických (EKG), biochemických a klinických charakteristik. Asi v 10% případů jsou příznaky mírné, případně žádné – jedná se o tzv. „němý infarkt“. Patofyziologicky je infarkt myokardu definován jako akutní ložisková ischemická nekróza srdečního svalu, během níž dochází k uvolnění řady proteinů z kardiomyocytů do krevního oběhu. Některé z nich mohou být následně detekovány jako tzv. kardiomarkery. I když základem diagnostiky při prvním kontaktu s nemocným zůstává stále EKG, pro definitivní diagnózu je základem průkaz biochemických markerů. Za markery infarktu myokardu (IM) považovány bílkoviny troponinového komplexu. Nespecifický myoglobin, CK-MB/CK-MB mass a LD se již považují za obsolentní. V současné době existuje tzv. Třetí univerzální definice infarktu myokardu, v české verzi možno nalézt např. zde. Troponinový komplex je tvořen třemi strukturními bílkovinami, troponinem T, troponinem I a troponinem C, které jsou vázány na tropomyozin příčně pruhovaného svalu a mají vztah k regulaci síly svalové kontrakce. Troponiny z kosterního svalstva a ze srdečního svalu lze rozlišit imunochemicky. V praxi se stanovují kardiální troponin T (cTnT) a kardiální troponin I (cTnI). Pro troponiny je typické, že ve zdravém organismu se nevyskytují v séru ve zvýšených hodnotách. Výskyt troponinu (T, I) znamená, že byl poškozen myokard, i když nutně nemusí jít o IM. Např. mírně zvýšené hodnoty troponinu T u pacientů s nestabilní anginou pectoris svědčí o špatné prognóze onemocnění (dochází k ischemiím a následným nekrózám myokardu). Také myokarditida, plicní embolie, srdeční selhání, septické stavy aj. mohou mít za následek zvýšení (elevaci) hladin cTn (kardiálních troponinů). V těchto případech dochází k poškození myokardu i bez přítomnosti ischemie, čili kromě nekrózy kardiocytů, se na zvýšení hladiny Tn podílejí jevy jako je apoptóza, zvýšení permeability buněčné membrány, aktivní sekrece partikulí troponinu aj., a tyto skutečnosti je třeba mít na paměti při interpretaci výsledků, kterou by měl lékař provádět vždy s ohledem na klinický stav pacienta. Kardiální troponiny se objevují v narůstající koncentraci 3,5 – 4 hodiny po srdeční příhodě (pro cTnI se uvádí 4 – 6 hodin po příhodě), (myoglobin 0,5 – 2 hodiny po příhodě, není však specifický pro myokard), maximum je asi po 18 ( cTnI 8 – 28) hodinách a návrat k původnímu stavu po 7 – 20 (cTnI 3 – 10) dnech Na obrázcích je znázorněna vazba aktinu, troponinu a tropomyosinu s myosinem v myofibrile (žlutočervený obrázek nahoře) a vlastní podrobněji popsaný troponinový komplex (na spodním modrozeleném obrázku). helical = spirálový, šroubovitý; strand = vlákno, šňůra, větev Klinická biochemie Kapitola 19. Biomarkery Pavel Nezbeda 19-13 (troponiny se tedy nehodí ke stanovení opakovaného infarktu, pokud k němu dojde v průběhu několika dní po první koronární příhodě). Biologický poločas cTnI je 2 - 4 hodiny, skutečnost, že cTnI přetrvává dny po příhodě v krevním oběhu svědčí o tom, že dochází ke kontinuálnímu vyplavování tohoto proteinu z poškozených myofilament komplexu. Metody stanovení troponinů Troponiny se stanovují imunochemickými metodami (ligandovými technikami). Na trhu nejdéle známou metodou je metoda pro stanovení troponinu T od firmy ROCHE (dříve Boehringer Mannheim), která má výrobu souprav pro stanovení cTnT na svých analyzátorech (např. Elecsys, Cobas) chráněnou patenty. V současnosti existuje několik firem, které dodávají na trh metody na stanovení troponinu I (malý protein o molekulové hmotnosti přibližně 24 kDa). Je to např. firma ABBOTT Laboratories s.r.o., která dodává soupravy pro stanovení cTnI na analyzátoru AxSym a nověji i na analyzátorech řady Architect, firma Siemens se soupravami pro analyzátory Immulite, Vista, Centaur aj. a řada dalších firem. Referenční hodnoty se liší podle jednotlivých výrobců souprav. V roce 2000 došlo k definování akutního koronárního syndromu (ACS) a bylo doporučeno používat jako (jedinou) diskriminační hodnotu hodnotu 99. percentilu referenční populace, s precizností stanovení VK% ≤ 10. V současnosti jsou do rutinní praxe zaváděny tzv. high sensitive – hs/HS diagnostické soupravy (běžně se mluví o stanovení high sensitive troponinů), což znamená, že tyto soupravy splňují požadavky na preciznost stanovení. Přesné uplatnění, zhodnocení a interpretace výsledků stanovení nízkých hladin troponinů v diagnostickém a terapeutickém procesu se sice stále ještě hledá a konkretizuje, ale základní představy o přínosu stanovení těchto nízkých hladin troponinů již existují: lze, s dostatečnou přesností, identifikovat menší poškození myokardu, a to dříve, tj. v časnějších fázích vývoje těchto poškození, než to dovolovaly metody předchozí: Týká se to jak akutních (AKS, plicní embolie, myokarditis apod.), tak chronických onemocnění myokardu (při srdečním selhání, u nemocných se stabilní anginou pectoris, u jedinců s prokazatelnými aterosklerotickými změnami koronárního řečiště, ale bez klinických či anamnestických symptomů aj.). Dá se shrnout, že v současnosti se přínos HS/hs metod vidí zejména ve včasnějším průkazu nekrózy myokardu, v příspěvku k rychlejší a dokonalejší diferenciaci nestabilní anginy pectoris (diferenciální diagnostika akutních koronárních syndromů) a v prognostickém významu tohoto stanovení (z charakteru změn v koncentraci troponinů v krvi lze usuzovat na riziko kardiovaskulární morbidity a mortality). Praxe mimo jiné ukázala, že je třeba používat různé hodnoty cut off pro muže a pro ženy. Kupodivu se také ukázalo, že stanovení troponinů s velmi nízkou fyziologickou koncentrací nepřineslo s sebou posun těchto hodnot, tzn., že prakticky nedochází k nárůstu (falešně) pozitivních výsledků. Z původně předpokládaného „zlatého standardu“ pro diagnostiku AIM se stal biomarker obecně pro ischemii srdečního svalu, včetně IM. Více o srdečním infarktu a troponinech lze nalézt např. na adrese: http://www.roche-diagnostics.cz/prolekare/infark.aspx O vysoce citlivém (HS = high sensitivity) troponinu fy Siemens viz video: http://usa.healthcare.siemens.com/clinicalspecialities/cardiology/cardiovascular-disease/educational-videos-modules. Rovněž firma Abbott Laboratories má ve svém portfoliu hs TnI. Podrobnosti o hs troponinech a dalších kardiomarkerech lze nalézt také na adrese http://www.ceva- edu.cz/mod/forum/search.php?id=1&search=Troponin 19.2.2. Kopeptin Kopeptin (copeptin) je kyselý glykopeptid složený z 39 aminokyselin, který tvoří C-terminální část prekursoru vasopresinu. Je stabilním a citlivým zastupujícím markerem cirkulujícího adiuretinu/vasopresinu. Je markerem endogenního stresu a jeho hladina bezprostředně vzrůstá po ataku akutního infarktu myokardu (AMI) a pak plynule klesá. Vzhledem k tomu, že troponin, specifický marker myokardiální nekrózy vykazuje určité zpoždění v nárůstu po ataku AMI („slepá troponinová perioda“), představují tyto dvě látky svým způsobem komplementární biomarkery a jejich kombinace by mohla výrazně zrychlit diagnózu AMI, zejména v negativním smyslu, tj. vyloučením infarktu myokardu: negativní troponin + negativní kopeptin = nejedná se o AMI. Poznámka: Potřebné reagencie vyrábí pro imunochemické stanovení na analyzátoru Kryptor fa BRAHMS a na českém trhu dodává fa Lacomed s.r.o.; ELISA soupravy vyrábí např. fa Uscn Life Science Inc. 1 2 3 4 Pre-Pro-Vazopresin: 1 signální molekula 2 vazopresin 3 neurofyzin II 4 kopeptin Klinická biochemie Kapitola 19. Biomarkery Pavel Nezbeda 19-14 19.2.3. Natriuretické peptidy Srdeční selhání je syndrom způsobovaný celou řadou různých stavů, např. onemocněním koronárních artérií, hypertenzí, vadou srdečních chlopní, myokarditidou atd. Srdeční selhání je přesněji definováno jako zhoršující se stav, kdy srdeční komory nejsou schopny zásobovat krví plíce a/nebo periferní oblasti těla. Natriuretické peptidy tvoří „rodinu“ hormonálně aktivních látek, které jsou tvořeny 17členným kruhem spojeným disulfidickým můstkem a postranními řetězci, jejichž počet a délka se různí u jednotlivých zástupců. Do této rodiny se počítají i prekurzory a deriváty, které mohou mít význam buď jako hormony, nebo mají význam diagnostický, případně obojí. Známy jsou natriuretické peptidy ANP, BNP, CNP, DNP, VNP a urodilatin. Tvoří se v srdečních síních (ANP, který je zde skladován ve formě granulí), v endotelu (CNP) i v jiných tkáních. Ovlivňují srdeční tkáň, hormonální systém, imunitní systém a mají i další účinky. Hlavními producenty jednotlivých peptidů jsou pro ANP – srdeční síně a komory a ledviny; BNP – srdeční síně a komory, přičemž v komorách se tvoří řádově větší množství; CNP – kosti, mozek, endotel, srdce Ovlivnění ledviny natriuretickými peptidy je přehledně znázorněno na následujícím schématu Zástupci rodiny natriuretických peptidů ANP, BNP, CNP-53 a CNP-22 ANP/BNP glomerulus tubuly juxtaglomerulární aparát NPR-A/B NPR-A/B NPR-A/B cGMP cGMP cGMP aferentní vazodilatace eferentní vazodilatace blokování transportu sodíku a vody (proximální tubuly) amilorid-senzitivní epiteliální Na+ kanálek (proximální tubuly) PKGII blokování tvorby reninu - snížená koncentrace reninu vzestup glomerulární filtrace zvýšení natriurézy a diurézy NPR-A/B : receptor pro natriuretický peptid A/B (A nebo B); cGMP: cyklický guanosinmonofosfát; PKGII: proteinkináza G typu II. Amilorid: slabé diuretikum, které ale snižuje ztráty draslíku močí. Text i schéma podle Prof. MUDr. Antonín Jabor, CSc., Natriuretické peptidy, Roche s.r.o., Diagnostics Division, Praha, 2010; ISBN 978-80-254-7929-2, str.69-70 Klinická biochemie Kapitola 19. Biomarkery Pavel Nezbeda 19-15 Natriuretické peptidy působí prostřednictvím receptorů v ledvinách, cévách, mozku a dalších orgánech. V ledvinách ovlivňují vazodilataci a vazokonstrikci působením na svalové buňky vas afferens resp. vas efferens, relaxaci a zvýšení filtrace prostřednictvím mesangiálních buněk, působí také na buňky proximálního tubulu (malý vliv), buňky Henleovy kličky, distálního tubulu a sběrného kanálku. Natriuretické peptidy jsou v podstatě antagonisty systému renin-angiotenzin. 19.2.4. BNP a NT-proBNP Markerem srdečního selhání je mozkový natriuretický peptid (BNP – Brain Natriuretic Peptide), objevený a popsaný Boldem a spolupracovníky v roce 1981 a degradační fragment NT-proBNP (N-Terminalprohormone BNP). Název „mozkový“ vychází ze skutečnosti, že byl poprvé izolován z prasečí mozkové tkáně. Navzdory tomu, hlavním zdrojem BNP je srdce. V srdečních myocytech je syntetizován preproBNP složený ze 134 aminokyselin a je přeměňován na molekulu prekurzoru BNP, tj. na proBNP (108 AK). ProBNP je dále štěpen endopeptidázou corinem, příp. furinem na fyziologicky aktivní (hormon) BNP (32 AK) a na degradační fragment NT-proBNP (76 AK). BNP je syntetizován a uvolňován do krve při zvýšené objemové zátěži nebo stavech způsobujících přetížení komor. Řídí zde homeostázu tekutin a elektrolytů interakcí se systémem renin-angiotensin-aldosteron, tzn. zejména natriurézu, čili vylučování natria močí (což současně vede k odvodnění – viz předchozí schéma), zábranu jeho resorpci (inaktivací adiuretinu), snížení tlaku zvětšením objemu cév a utlumení pocitu žízně. Výsledkem je snížení objemové zátěže organismu a optimalizace žilního návratu. Z oběhu je BNP odstraňován specifickými buněčnými receptory a neutrálními endopeptidázami, přičemž jeho biologický poločas je přibližně 23 minut. BNP s vyšší molekulovou hmotností byly detekovány v periferní krvi. Klinické využití BNP a NT-proBNP Četné studie naznačily, že měření BNP lze u pacienta využít ke stanovení diagnózy, prognózy a ke sledování léčby (monitorování terapie). Bylo prokázáno, že hladiny BNP jsou zvýšené u pacientů se srdeční dysfunkcí. Měření hladin BNP v plazmě poskytuje klinicky užitečné informace ohledně diagnostikování a péče při dysfunkci levé srdeční komory a srdečním selhání, čímž doplňuje ostatní diagnostická vyšetření (např. elektrokardiogramy, rentgen hrudníku a echokardiogramy). Na základě hladin BNP lze určit závažnost srdečního selhání. Hladiny BNP v plazmě se zvyšují také při snížení fyziologické funkční kapacity srdce. V podstatě totéž platí i pro NT-proBNP. V klinické praxi jsou důležité negativní hodnoty testu (tzv. „rule out“ test, čili vylučovací test). . Hodnoty BNP v ng/l Diagnóza <100 srdeční selhání nepravděpodobné >100 chronické srdeční selhání >500 akutní srdeční selhání >800 srdeční selhání prognosticky závažné Evropská kardiologická společnost (European Society of Cardiology) zařadila využití testování na stanovení natriuretických peptidů (např. BNP) do svých metodických doporučení pro diagnostikování nebo vyloučení srdečního selhání. Předběžné studie prokázaly možnost využití měření BNP k optimalizaci léčby a péče o pacienty po srdečním selhání. Zde je důležité srovnání hodnot BNP při příjmu pacienta a po léčbě (pro dobrou prognózu by hodnoty po léčbě preproBNP (134 AK) proBNP (108 AK) NT-proBNP (76 AK) MARKER BNP (32 AK) HORMON/MARKER SRDCE (kardiomyocyt) PERIFERNÍ KREV (cirkulace) corin/furin (endopeptidáza) Klinická biochemie Kapitola 19. Biomarkery Pavel Nezbeda 19-16 měly být <100 ng/l). Diskutuje se, zda vyšetřovat BNP či NT-pro BNP; v odborném tisku i na odborných setkáních jsou probírány přednosti i záporné stránky obou metabolitů, výhody či nevýhody jejich stanovení. Metodami stanovení pro BNP i NT-proBNP jsou ligandové techniky (např. soupravy ABBOTT pro stanovení BNP na analyzátorech řady Architect, soupravy firmy Roche pro stanovení NT-proBNP na analyzátoru Elecsys, Cobas a jiné). Více o srdečním selhání a natriuretických peptidech viz např. na adrese: http://www.roche-diagnostics.cz/prolekare/srdecni.aspx, resp.http://www.cskb.cz/cskb.php?pg=doporuceni--kardialni-markery#5 Novým markerem akutního srdečního selhání je DC146, známý také pod názvem melanoma cell adhesion molecule (MCAM, adhesní molekula melanomových buněk), objevený belgickou firmou Pronota NV z Ghentu. DC146 doplňuje BNP a NT-proBNP, jeho plné využití je však ještě ve stadiu zkoumání. Perspektivními biomarkery akutního srdečního selhání se zdají být i galectin-3, malý peptid (cca 30kDa) z rodiny lektinů, proadrenomedulin, vazoprezorický peptid s hormonálními účinky syntetizovaný řadou tkání a ST-2, protein z receptorové rodiny interleukinu-1. 19.3. Markery zánětu [inflammatio (l), flogósis (ř) – zánět] Každý organismus si chrání svoji celistvost, svou integritu. Při poškození odpovídá organismus zánětem což je, řečeno ústy imunologa 1 , „ jedinečný a fylogeneticky nejstarší typ obranné a reparační reakce, kterou organismus odpovídá na poškození různými noxami. Úkolem zánětlivé reakce je destrukce a odstranění poškozujícího agens, lokalizace zánětlivých dějů na místo poškození, podpora specifické imunitní odpovědi a regenerace poškozené tkáně“. Poškozujícími agens mohou být různé škodlivé infekční i neinfekční stimuly, jakými jsou bakteriální infekce, viry, paraziti, houby, toxiny, cizorodé látky (bílkoviny, pyl, silikát...),tkáňové nekrózy (způsobené rakovinou, anoxií, popáleninami...),záření, extrémní teploty, trauma, tělu vlastní noxy (rozpadající se nádorové buňky, extravaskulární krev, autoimunitní reakce, krystaly vzniklé vypadnutím z roztoku látek tělu vlastních – kyselina močová, šťavelan vápenatý, cholesterol...),atd. Smyslem zánětlivé reakce je, jak již bylo uvedeno, zničení a odstranění poškozující příčiny a obnova původního stavu, regenerace poškozené oblasti, v horším případě alespoň ohraničení poškozené oblasti a eliminace příčiny. Při zánětu dochází k mnoha změnám jak v postižené oblasti (lokální reakce – bolest, otok, zarudnutí, zvýšení teploty), tak často i ve vzdálených tkáních a orgánech těla. Dostatečně silný zánět vyvolá celkovou reakci organismu, odpověď systému, tj. organismu, na zánět, vyvolá systémovou odpověď (Systemic Inflammatory Response) což znamená, že organismus se začne bránit jako celek. Průvodními jevy systémové odpovědi jsou horečka, buněčná odpověď (leukocytóza), hormonální odpověď (produkce cytokinů, stresových hormonů, aj.), změna koncentrace tzv. reaktantů akutní fáze, což jsou bílkoviny produkované játry. Systémovou odpovědí se zabývaly American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine, které v roce 1992 stanovily kriteria pro Syndrom systémové zánětlivé reakce (SIRS, Systemic Inflammatory Response Syndrome), což je nespecifická zánětlivá reakce celého organismu. Je důsledkem každého primárního inzultu, jehož intenzita způsobí poškození, které se neomezí pouze na vlastní zasaženou ohraničenou oblast. SIRS je charakterizovaný nejméně dvěma z následujících kritérií:  teplota nad 38 °C nebo pod 36 °C  tep nad 90/min  dechová frekvence nad 20/min nebo PCO2 pod 4,3 kPa (32 torr)  leukocyty nad 12.10 3 /μl nebo pod 4.10 3 /μl nebo víc jak 10 % nezralých forem. Při SIRS dochází ke ztrátě kontroly nad normální zánětovou odpovědí, zánět ztrácí svůj původní obranný charakter a mění se v delokalizovaný a deregulovaný autoagresivní proces. Je to závažný stav, který může nastat jak na infekční, tak neinfekční podnět. SIRS s akutní orgánovou dysfunkcí se označuje jako závažný SIRS. Septický SIRS, tj. SIRS vyvolaný, nebo provázený diseminovanou mikrobiální infekcí, se nazývá sepse. Těžká sepse je spojena s orgánovou dysfunkcí, hypoperfúzí tkání nebo hypotenzí. Septický šok je těžká sepse s hypotenzí, která nereaguje na doplnění objemu, projevují se známky hypoperfúze. 1 MUDr. Karel Nouza, DrSc. http://www.anamneza.cz/Zanet-obecne-Zanet/nemoc/237 Klinická biochemie Kapitola 19. Biomarkery Pavel Nezbeda 19-17 V zánětové odpovědi jsou produkovány dva typy mediátorů – s prozánětlivými a s protizánětlivými účinky, jejichž vzájemný poměr je nutno zpětnovazebnými mechanismy udržet na úrovni umožňující omezit zánětovou reakci pouze na oblast poškozených tkání. Nerovnováha těchto dějů vede k neblahým důsledkům:  Nadměrná zánětová odpověď (hyperkativní SIRS) vede k nárůstu prozánětlivých mediátorů (je přítomna „cytokinová smršť“, cytokine storm), výsledkem je generalizovaný systémový prozánětlivý stav, dochází k rozvratu tkáňového metabolismu a cirkulace, stresovému katabolismu a posléze k selhání orgánů.  Nadměrná protizánětová odpověď (syndrom kompenzační protizánětové odpovědi, CARS), nepřiměřená obrana organismu, má, podobně jako nepřiměřená obrana v občanském životě, neblahé následky. Vede k nárůstu protizánětlivých mediátorů, výsledkem je inhibice buněk a mechanismů nespecifické i specifické imunity, imunosuprese s nekontrolovaným množením mikroorgasnismů , průnik patogenů z intestinálního traktu a rozvoj sepse, septického šoku a posléze selhání orgánů.  Dynamická rovnováha mezi SIRS a CARS procesy vyúsťuje ve stav zvaný syndrom smíšené antagonistické odpovědi (MARS, Mixed Antagonistic Response Syndrom), kdy výsledným obrazem je kombinace syndromů SIRS a CARS s různými projevy obou těchto komponent (SIRS + CARS = MARS). SIRS i septický SIRS (sepse), mohou vést (mechanismy popsanými výše) k selhání životně důležitých orgánů, tj. k rozvoji syndromu multiorgánové dysfunkce (MODS) a ke smrti. MODS (Multiple Organ Dysfunction Syndrome, česky syndrom multiorgánové dysfunkce) je známý také pod dřívějším označením jako MOF (multiple organ failure), případně i jako MSOF (multisystem organ failure). MODS je časté onemocnění léčené na JIP, s nákladnou léčbou. Jedná se o stav s poruchou funkce dvou a více životně důležitých orgánů u akutně nemocného pacienta, kdy tělo nedokáže zajistit homeostázu bez zevní intervence. Může se jednat o následek primárního poškození orgánů, např. úrazem (primární MODS), častěji se však jedná o těžké poškození na vzdáleném místě, sekundárně vyvolané primárním poškozením (sekundární MODS). Typické pro MODS jsou hyperkinetická cirkulace a hypermetabolismus. Vztahy mezi SIRS a MODS jsou mnohotvárné, mezi standardní patří vývoj SIRS v sekundární MODS, případně vývoj primárního MODS do SIRS. SIRS i MODS mohou vyústit v uzdravení i smrt. Jak vidno, zánět je sice nejvýznamnější obranou, ale také sebepoškozující reakcí organismu. Nekontrolovaná, či špatně kontrolovaná zánětlivá odpověď může vést nakonec ke smrti. Včasná a správná diagnostika SIRS a včasné zachycení sepse, jsou z klinického hlediska velmi důležité předpoklady úspěšné léčby těchto stavů. Uvádí se, že každý třetí pacient postižený sepsí umírá, incidence sepse za poslední léta, navzdory spoustě nových léčebných postupů, soustavně roste a počet úmrtí na sepsi v zemích západního typu je v souhrnu větší než počet úmrtí na zhoubné nádory prsu, plic a gastrointestinálního traktu dohromady. Vzhledem ke komplikovaným vztahům v SIRS je léčba tohoto onemocnění velmi obtížná a v rozvinuté fázi (momentálně) nemožná. Jsou tedy zapotřebí včasné markery nástupu SIRS a sepse. V současné době jsou jako markery k dispozici zejména proteiny akutní fáze a cytokiny (markery zánětu), k určení SIRS a septického stavu pak prokalcitonin (PCT) a presepsin. 19.3.1. Proteiny akutní fáze Časná fáze systémové zánětlivé reakce byla nazvána reakcí či odpovědí akutní fáze (APR, acute phase reaction) a zahrnuje sérii lokálních a systémových klinických, biochemických a buněčných změn. Odpovědi akutní fáze zahrnují:  změny v koncentracích proteinů syntetizovaných v játrech (tzv. proteinů či reaktantů akutní fáze)  změny v neuroendokrinním systému (horečka, spavost, nechutenství, nárůst kortikoliberinu, adrenokortikotropního hormonu, vazopresinu, produkce stresových hormonů - katecholaminů, kortizolu, pokles trojódtyroninu a tyroxinu, aj.)  změny v hematopoeze (anemie, leukocytóza, trombocytóza)  změny v metabolismu (negativní dusíková bilance, útlum glukokoneogeneze, aktivace i útlum enzymatických dějů, snížení koncentrací zinku a železa, zvýšení koncentrace mědi, retinolu a glutathionu, osteoporóza, zvýšení lipolýzy v tukové tkáni, kachexie). SIRS prim. MODS sek. MODS uzdravení smrt Klinická biochemie Kapitola 19. Biomarkery Pavel Nezbeda 19-18 Mezi proteiny (reaktanty) akutní fáze se řadí proteiny, jejichž koncentrace v plazmě se v akutní fázi zánětu změní (minimálně o 25%, nárůst nebo pokles.) Některé proteiny vykazují zhruba 50% změnu (nárůst ceruloplasminu) jiné vykazují změnu mnohonásobně vyšší, až tisícinásobnou (CRP, amyloid A). Produkce proteinů akutní fáze je spouštěna řadou cytokinů (kapitola 14 Hormony, str. 14-45), uvolňovaných převážně aktivovanými buňkami monocyto-makrofágové řady, zúčastněnými v zánětlivé reakci. Různé cytokiny a jejich působení se vzájemně kombinují a výsledným efektem je aditivní, synergický nebo inhibiční efekt (např. pro indukci tvorby CRP je nutná součinnost IL-6 s IL-1 nebo IL-6 s TNF-a). V akutní fázi zánětu se uplatňují zejména IL-6 (nejvýznamnější stimul pro většinu proteinů akutní fáze), IL-1b, TNF-a, IFN-g, TGF-b a IL-8. Rozlišují se pozitivní a negativní reaktanty akutní fáze. 19.3.1.1. Pozitivní reaktanty akutní fáze Koncentrace těchto reaktantů/bílkovin se v akutní fázi zvyšuje () (proto tzv. „pozitivní“ reaktanty akutní fáze). Patří sem  inhibitory proteáz (-inhibitor proteáz, 2-makroglobulin),  složky koagulačního a fibrinolytického systému (fibrinogen, plazminogen, tkáňový aktivátor plazminogenu, protein S aj.),  CRP (C-reaktivní protein, tj. protein reagující s polysacharidem pneumokoků C),  transportní bílkoviny (ceruloplasmin, haptoglobin, hemopexin),  některé složky komplementového systému (C3, C4, C9, inhibitor C1, lektin vázající manózu) a  některé další (ferritin, sérový amyloid A, orosomukoid, apod.). Nejrychleji reaguje CRP, jeho koncentrace stoupá nejvíce (tzv. reaktanty akutní fáze s rychlou odpovědí). 19.3.1.2. Negativní reaktanty akutní fáze Koncentrace těchto bílkovin se v akutní fázi snižuje (). Typickými představiteli jsou albumin, prealbumin, transferin, alfa-fetoprotein, globulin vázající tyroxin aj. Klinické využití proteinů akutní fáze Mnohé reaktanty akutní fáze se stanovují jak u akutních tak u chronických zánětů. C-reaktivní protein (CRP), je z proteinů akutní fáze v praxi užíván asi nejvíce. Biologickou funkcí CRP je vazba na mnoho endogenních i exogenních ligandů. Jedná se o poškozené vlastní buňky a jejich produkty, které by mohly působit jako alergeny, z exogenních ligandů opsonizuje mikroorganismy. Syntézu CRP podporuje zvýšená hladina cytokinů (prozánětlivé mediátory), zejména IL-6. V případě poškození organismu je při vypuknutí zánětlivé reakce syntetizován v hepatocytech a uvolňován z nich do krve. Plazmatické hodnoty CRP jsou  zvýšeny u zánětů, bakteriálních infekcí, infarktů, malignit, cholestázy, hypotyreózy a  sníženy např. u Wilsonovy choroby, nefrotického syndromu a malnutrice. Mírně zvýšené hodnoty indikují přítomnost chronického zánětu. CRP je popsán také v kapitole 13 Bílkoviny na str. 13-9, kde je možno shlédnout i obrázek molekuly CRP. Referenční hodnoty (přesněji:cut off) CRP: ≤ 3 mg/l Hodnoty >100 mg/l provázejí bakteriální infekce, u virových infekcí bývají hodnoty < 50 mg/l. Sledování nízkých (mírně přesahujících cut off CRP, soupravami hsCRP, high sensitive CRP, vysoce senzitivní CRP) jako ukazatelů chronického zánětu spolu s markery aterosklerózy (celkový cholesterol, HDL- a LDL-cholesterol a triacylglyceroly) má význam pro odhad rizika koronární příhody a rizika ischemické mozkové příhody (srovnej s článkem Ateroskleróza v kapitole 11 Lipidy, na str.11-28). Prokalcitonin (PCT) – polypeptid, prekurzor kalcitoninu. Citlivý indikátor bakteriální infekce, zejména těžkých sepsí. PCT,který se nachází během zánětu v plazmě není produkován C-buňkami štítné žlázy, jeho hlavním zdrojem jsou hepatocyty, produkují ho však i další buňky různých orgánů. Kvantitativně lze stanovit imunochemicky, semikvantitativně na principu imunochromatografie. Kolorimetrická stupnice semikvantitativního imunochromatografického testu fy BRAHMS (viz obrázek vpravo) má čtyři rozlišující hodnoty: < 0,5 g/l  0,5 g/l  2 g/l  10g/l jejichž interpretace je v následující tabulce na str. 19-19. Kazeta s výsledkem Stupnice Klinická biochemie Kapitola 19. Biomarkery Pavel Nezbeda 19-19 PATHFAST imunochemický minianalyzátor Cartridge („strip“) pro stanovení presepsinu na přístroji PATHFAST Presepsin (solubilní CD14 subtyp, sCD14-ST; CD = cluster of differentiation) je v literatuře uváděn jako nový marker sepse. Na povrchu buněčných membrán monocytů a makrofágů je exprimován receptor CD14, který má vysokou afinitu k lipopolysacharidu (LPS) a LPS vázajícím proteinům (LPBP). Vazbou LPBP komplexu na receptor se aktivuje TLR4-specifická prozánětlivá signalizační kaskáda a tím začíná zánětlivá reakce hostitele proti infekčnímu agens. Komplex LPS-LPBD-CD14 je uvolňován do krevního oběhu a vlivem plazmatických proteáz štěpen na stanovitelný (rozpustný) sCD14-ST, presepsin. Bylo zjištěno, že hladiny presepsinu jsou signifikantně vyšší u septických pacientů než u pacientů se SIRS. Z prvních srovnávacích měření se jeví, že presepsin reaguje citlivěji na sepsi než PCT a mohl by být použit pro časnou diagnostiku sepse, její prognózu a ke sledování průběhu onemocnění a odpovědi na léčbu. Protilátka proti presepsinu je základem pro imunochemického stanovení, které nabízí v ČR fa Medesa, pod názvem PATHFAST Presepsin. (Podrobnosti: http://www.procalcitonin.com/default.aspx?tree=_2_2&key=aboutpct1; kvantitativní stanovení na analyzátoru miniVidas viz na adrese: http://www.asclsmn.org/uploads/6_nancy_migliano_-_color.pdf) Diskriminační hodnota pro rozlišení zdravých a nemocných se sepsí je 337 ng/l. Hodnota 1858 ng/l predikuje vysokou pravděpodobnost mortality (60%). Sérový amyloid A (SAA) je sumární název pro skupinu plazmatických lipoproteinů; součást HDL3, prekurzor amyloidu A. Existuje několik variant SAA, biologická funkce není zcela poznána. Je syntetizován zejména v játrech, v aktivovaných makrofázích a fibroblastech. Významný pozitivní reaktant akutní fáze, může sloužit i jako test poskytující informaci o možných komplikacích v časném pooperačním období. Paralelní stanovení SAA s CRP zvyšuje citlivost vyšetření proteinů akutní fáze a umožňuje časné stanovení nástupu zánětlivého procesu (např. neonatální sepse). Referenční hodnoty do 6,4 mg/l. IL-6, cytokin syntetizovaný v monocytech, fibroblastech, endoteliálních buňkách, keratinocytech, Tbuňkách a v mnoha tumorových buňkách. Působí prozánětlivě, indukuje syntézu proteinů akutní fáze, působí také jako diferenciační faktor pro B-lymfocyty a aktivační a diferenciační faktor pro T lymfocyty. Zvýšené hodnoty se vyskytují u sepsí, autoimunitních nemocnění, lymfomů, AIDS, rejekcí transplantátů aj. V kombinaci s CRP, resp. SAA je nejlepším markerem novorozenecké sepse. Referenční hodnoty do 11 ng/l Elastáza z granulocytů, enzym, který má využití při diferenciální diagnostice zánětů včetně bakteriálních. Neopterin, purinový derivát produkovaný makrofágy. Měřítko aktivace buněčné imunity. Pacienti PCT (g/l) Normální osoby < 0,5 Chronické zánětlivé procesy a autoimunitní choroby < 0,5 Virové infekce < 0,5 Malé bakteriální lokální infekce < 0,5 SIRS, polytraumata, záněty 0,5 - 2 Závažné bakteriální infekce,sepse, multiorgánové selhání (MODS) > 2 (často 10 - 100) Klinická biochemie Kapitola 19. Biomarkery Pavel Nezbeda 19-20 19.4. Markery akutního selhání ledvin Stanovení kreatininu (nejčastěji reakcí Jaffé z roku 1886) je doposud jedinou stálicí na „nebi“ biochemického sledování funkčního stavu ledvin. Akutní poškození a selhání ledvin však představují závažný problém současné medicíny a úspěšná léčba v těchto případech více než jinde závisí na včasné diagnostice, nejlépe již ve fázi počínajícího rozvoje poškození. Objev nových biomarkerů vhodných pro časnou diagnostiku akutního poškození a selhání ledvin by byl určitě významným přínosem jak pro lékaře, tak pro pacienty. 19.4.1. Kritéria pro hodnocení poškození funkce ledvin Akutní selhání ledvin (ASL) bylo do roku 2004 definováno asi 30 formulacemi, pak bylo nahrazeno definicí jedinou a stanovena stádia onemocnění, podle kritérií RIFLE. RIFLE je akronym, složený ze začátečních písmen slov charakterizujících stav ledviny:  Risk, riziko (poškození)  Injury, poškození  Failure, selhání  Loss, ztráta (funkce)  ESRD, End Stage Renal Disease, konečné stadium ledvinového onemocnění . Základními laboratorními charakteristikami definujícími stadia poškození ledvin jsou hodnoty sérového kreatininu a diuréza, jinými slovy, jednotlivým kriteriím odpovídají hodnoty sérového kreatininu a diurézy. V roce 2007 byl název akutní selhání ledvin (ASL) nahrazen pojmem akutní poškození ledvin (Acute Kidney Injury, AKI) a bylo doporučeno poněkud upravit stávající kriteria RIFLE: místo R, I a F používat 1, 2 a 3, L a E opustit. AKI se rozumí „náhlý (během 1 – 7 dnů) a přetrvávající (více jak 24 hodin) pokles ledvinových funkcí“. Některé příčiny akutního selhání ledvin vyžadující dialyzační léčbu (pouze ilustrativní vyjmenování):  chirurgické (operativní výkony, močová obstrukce, pankreatitidy, popáleniny)  interní (sepse, akutní postižení jater)  přímé postižení renálního parenchymu (glomerulonefritidy, hemolyticko-uremický syndrom, HUS)  gynekologické  otravy U všech případů, které přinášení riziko AKI, je žádoucí mít k dispozici biomarker, který zavčas upozorní na hrozící nebezpečí. Jako velmi nadějný z tohoto pohledu se jevil nový marker z rodiny lipokalinů, malých sekrečních proteinů, účastnících se převážně transmembránových přenosů lipofilních substancí, neutrofilní lipokalin asociovaný s gelatinasou/želatinázou (NGAL), součást antioxidačního ochranného systému ledviny, jehož hladina v moči i v plazmě se oproti hladině S-kreatininu v případě hrozícího AKI zvyšuje podstatně rychleji, řádově v hodinách. Současné zkušenosti v klinické praxi jsou prozatím poněkud rozpačité, pro použití NGAL v diagnostice AKI existuje řada argumentů pro i proti. Nicméně existuje silná skupina expertů toto použití obhajující. Navíc se objevily nové možnosti použití NGAL jako biomarkeru v dalších oblastech: sepse, nemoci myokardu, kardiorenální syndrom, transplantace, systémová onemocnění a další. Jako první začala dodávat komerční vazebný test firma Abbott pro své systémy Architect. Albumin možná hraje v ledvině ochrannou roli, o čemž svědčí jeho svýšená syntéza u AKI a jeho výpovědní hodnota u experimentální AKI byla podobná jako vykazoval NGAL. Možnost využití albuminu v této souvislosti se diskutuje. Další, snad perspektivní, molekulou je molekula poškození ledvin 1 (KIM-1; kidney injury molecule), transmembránový protein, jehož proteolyticky upravená molekula se dostává do moči při ischemickém nebo nefrotoxickém AKI. Je zřejmě poměrně specifická právě pro ischemické poškození ledvin a může sloužit k diferenciální diagnostice typu poškození ledviny. O cystatinu C byla již zmínka v kapitole 7. Metabolity, v odstavci věnovanému kreatininu a kreatininové clearance (viz). V tomto případě se jedná o citlivý ukazatel poklesu glomerulární filtrace, nikoliv o ukazatel vlastního poškození ledvin. Interleukin 18 (interleukiny viz kapitola 14 Hormony, str. 14-45 až 14-47) je poměrně specifický ukazatel ischemického poškození ledvin a nabízí i prognostické informace týkající se závažnosti a mortality již v době stanovení diagnózy AKI. Podrobnosti k problematice viz Prof. MUDr. Vladimír Teplan, DrSc., RNDr. Jan Trbušek, Ph.D., Akutní poškození a selhání ledvin: nové biomarkery v časné diagnostice, Postgraduální medicína, 2010, 12, č. 9 NGAL model molekuly Klinická biochemie Kapitola 19. Biomarkery Pavel Nezbeda 19-21 19.5. Markery metabolismu kostí Kost je pevná pojivová tkáň, která tvoří převážnou část kostry většiny obratlovců. Skládá se z organických látek (buňky a matrix) a z látek anorganických či minerálních. Matrix je tvořena především kolagenem. V matrix jsou uloženy minerální látky, tj. Ca 2+ , fosfát, ve formě hydroxylapatitu (Ca10(PO4)6(OH)2 a uhličitanů (Ca 2+ , Mg 2+ a Na + ), které dávají kosti pevnost (srovnej s textem a obrázkem na str. 11-1).  , colagené (ř.) = klihodárný 19.5.1. Kolagen a další bílkoviny obsažené v kostech Kolageny jsou proteiny v lidském organismu nejvíce zastoupené (asi 1/3 všech proteinů). Jako strukturální bílkoviny jsou hlavní organickou složkou kostí, vazů, chrupavek, šlach, vaziva a kůže, tedy podpůrného systému živočišného organismu. Navíc jsou významnou složkou cévních stěn, bazálních membrán, rohovek a některých orgánů těla. Patologické a degradační formy kolagenu jsou příčinou řady nemocí pojivových tkání (skupina tzv. kolagenových chorob), které postihují klouby, srdce, cévy, svaly, kůži. Kolagen hraje významnou roli i v procesu stárnutí. V době psaní textu bylo známo nejméně 27 různých typů kolagenů (typ I až typ XXVII). Typy  I, II, III, V, XI, XXIV a XXVII tvoří vlákna  IV, VIII a X tvoří sítě  XIII, XVII, XXIII a XXV jsou transmembránové kolageny  IX, XII, XIV, XIX, XX, XXI a XXII tvoří rodinu Fibril-associated collagens with interrupted triple helix (s vláknem spojené/asociované kolageny s přerušenou trojitou šroubovicí, tzv. FACIT). Tyto relativně krátké kolageny se nacházejí na površích kolagenových vláken (fibril), které spojují s ostatními molekulami matrix.  XV, XVIII, XXVI a XXVIII - o těchto kolagenech se toho ví poměrně málo. Nejvíce jsou zastoupeny typy I, II a III. V kostech se nachází výlučně typ I, který se tvoří ve fibroblastech a osteoblastech. Všechny typy kolagenu mají strukturu trojité šroubovice, tzn., že tři peptidické řetězce se stáčejí podobně jako lano a vytvářejí tyčinkovitou strukturu, molekulu kolagenu. Každá polypeptidová podjednotka (-řetězec) je stočena do levotočivé spirály, tři alfa řetězce jsou vzájemně stočeny do pravotočivé šroubovice. Alfa řetězce v molekule mohou být stejné, nebo různé. Např. v kolagenu I jsou dva řetězce stejné a jeden odlišný. Molekuly kolagenu se skládají do větších svazků – kolagenových vláken (fibril), kde jsou jednotlivé molekuly kolagenu vzájemně posunuty o ¼ své délky a vzniká tak příčně pruhovaná struktura. Syntéza kolagenu obecně vychází z prokolagenu. První částí nového peptidového řetězce je vedoucí či signální sekvence na N-terminálním konci, která zodpovídá za nasměrování vytvořeného pre-pro-peptidu (pre-pro-kolagenu) do endoplazmatického retikula, kde dochází k postranslačním změnám a tvoří se-peptid: signální peptid na N-terminálním konci je odstraněn a vzniklá molekula se nazývá propeptid (nikoliv prokolagen). Prolylhydroxyláza a lyzylhydroxyláza hydroxylují prolin a lyzin za vzniku hydroxyprolinu a hydroxylyzinu, což dále umožňuje stočení řetězců a tvorbu příčných vazeb (cross-links) mezi -peptidy. Při těchto enzymatických reakcích je vyžadována přítomnost vitamínu C (kyseliny askorbové) jako kofaktoru. Pokud by k hydroxylacím nedošlo, nevytvořila by se trojitá šroubovice. Dalším krokem je vazba (glykosylace) glukosových nebo galaktosových monomerů na hydroxylovou skupinu lyzinu. Poté dojde ke stočení tří (hydroxylovaných a glykosylovaných) peptidů do těsně utažené trojšroubovice, která má jak na N-konci, tak na C-konci volné části řetězců, tzv. extendující (extenzní) řetězce (u kolagenu typu I je to na C-konci část o asi o 320 aminokyselinách a na N-konci asi o 180 aminokyselinách, střední, zkroucená část, má 1050 aminokyselin).Tato molekula se nazývá prokolagen. Prokolagen je dopraven do Golgiho aparátu, kde jsou navázány oligosacharidy (rozdíl od monosacharidů v předchozím kroku) a potom je prostřednictvím transportních vesikul takto upravená molekula vylučována z buňky do extracelulárního prostoru, kde úprava molekuly pokračuje. Prokolagenpeptidasami jsou odštěpeny C-koncové a N-koncové části (prokolagen-I-C-terminální propeptid, PICP a prokolagen-I-N-terminální propeptid, PINP) a zůstane střední část, tj. kolagenová molekula, která se také nazývá monomer kolagenu nebo starším názvem též tropokolagen. Na následující straně jsou základní kroky syntézy kolagenu a tvorby kolagenových vláken znázorněny na schématech. Současně je naznačeno i štěpení kolagenu působením kolagenáz při jeho degradaci. Spirálové vlákno kolagenu Klinická biochemie Kapitola 19. Biomarkery Pavel Nezbeda 19-22 Model mikrofibrily tvořené pěti tropokolagenovými molekulami Odštěpené části obsahují cystin, který se např. v kolagenu I vůbec nevyskytuje (obsahují ho ale např. kolagen III z velkých cév, kůže a kloubní tekutiny a kolagen IV z bazální membrány). Závěrečným krokem je tvorba kolagenového vlákna (kolagenové fibrily): lyzyloxidáza působí na lyzylové a hydroxylyzylové zbytky za tvorby aldehydických skupin, které v konečné fázi reagují za tvorby kovalentních vazeb mezi kolagenovými vlákny. Primární sekvence aminokyselin v -řetězci kolagenu je ...- Gly – X – Y - Gly – X – Y - Gly – X – Y - ... , tzn., že každá třetí aminokyselina je glycin, na pozici X je nejčastější aminokyselinou prolin (17%) a na pozici Y je to hydroxyprolin, který, jak již bylo uvedeno, vzniká enzymaticky z prolinu již v peptidovém řetězci (i ještě rostoucím) nebo hydroxylyzin, který se tvoří obdobně z lyzinu. Podle typu kolagenu je glykozylován různý počet hydroxylyzinových zbytků, většinou disacharidy. O NH2NH OHO NH2 O N OH O N OH O NH2 O N OH glycin prolin hydroxylyzin glycin prolin hydroxyprolin Ilustrativní znázornění možné kombinace: Gly – X – Y = Gly – Pro – Hyl Ilustrativní znázornění možné kombinace: Gly – X – Y = Gly – Pro – Hyp Prokolagen - monomer s extendujícími řetězci na N- a C-konci a místa odštěpení terminálních propeptidů (čárkovaně). Červeně jsou označena místa štěpení při degradaci kolagenu kolagenázami a vznik terminálních telopeptidů (viz dále v textu). -peptidy prokolagen tropokolagen vlákno C-terminální propeptid PINP N-terminální telopeptid INTP Uložení tropokolagenu ve vláknu Znázornění (vysvětlení mechanismu vzniku) tmavých a světlých pruhů N-terminální propeptid NICP C-terminální telopeptid ICTP NH2 COOH Klinická biochemie Kapitola 19. Biomarkery Pavel Nezbeda 19-23 Syntéza kolagenu I, který se nachází v kostech (v kostech se nenachází žádná jiná forma kolagenu) má některé typické rysy. Např. se tvoří dva typy alfa řetězců, alfa-1 a alfa-2 řetězce. Nazývají se také preprokolageny. Obsahují signální peptid a na každé straně řetězce ještě registrační peptid. Signální peptid je odstraněn v hrubém endoplazmatickém retikulu a řetězce se nyní nazývají pro-alfa řetězce. Za přispění kyseliny askorbové dochází k hydroxylaci popsané výše a vytvoří se šroubovicová struktura (stále v endoplazmatickém retikulu) ze dvou řetězců alfa-1 a jednoho řetězce alfa-2. Takto vytvořený prokolagen je transportován do Golgiho aparátu, „nabalíčkován“ a vyloučen exocytózou z osteoblastu. Vně buňky jsou prokolagenpeptidázou odstraněny registrační peptidy a vytvoří se tak tropokolagen. Tropokolagenové molekuly pak formují kolagenová vlákénka (fibrils), kde lysyloxidáza postupně vytváří příčné spojky mezi hydroxylyzinovými a lyzinovými zbytky (aldolovou reakcí). Příčnými spojkami mezi kolagenovými molekulami jsou u kolagenu typu I (a typu II) pyridinolin a deoxypyriridinolin (viz dále v textu). Kolagenová vlákenka se poté formují do kolagenových vláken (fibers). Kolagen se může navázat na buněčnou membránu pomocí různých typů proteinů, včetně fibronektinu a integrinu. Degradace kolagenu se zúčastňují  katepsin K (proteáza, nejsilnější savčí kolagenáza), kdy dochází k odštěpení C-koncového telopeptidu, tzv. CTx  matrixové metaloprote(in)ázy (tzv. MMPs), na zinku závislé endopeptidázy. Tyto kolagenázy štěpí kolagen za uvolnění C- a N- koncových telopeptidů ICTP a INTP. Další bílkoviny obsažené v kostech: Osteokalcin Osteokalcin je protein vázající vápník, závislý na vitamínu K, nejhojnější nekolagenní kostní bílkovina. Nazývá se také kostní GLA protein (BGP = Bone GLA Protein). Obsahuje 7-karboxylované zbytky kyseliny glutamové (GLA), odtud název. Karboxylace je katalyzována vitamínem K. Osteokalcin je specificky syntetizován v osteoblastech kosti a dentinu. Syntéza je stimulována kalcitriolem (hormon D, 1,25dihydroxycholekalciferol) a vitamínem K. Zvýšená koncentrace osteokalcinu v séru indikuje zvýšený kostní obrat v době nemoci. Viz dále v textu. Osteonektin Osteonektin, fosfoprotein, který váže jak kolagen, tak kalcium a slouží jako regulátor mineralizace. Nachází se i v krevních destičkách. Osteopontin Osteopontin, kyselý fosfoprotein vázající kalcium s vysokou afinitou k hydroxylapatitu, mající účast v kostní mineralizaci a dystrofické kalcifikaci (usazování vápníku v abnormálních tkáních jako jsou jizvy či aterosklerotické pláty, při normální hladině vápníku v krvi). Přestavba (remodelace) kostí probíhá po celý život Závisí na ní schopnost kosti přizpůsobit se proměnám svého zatížení, zachovává celistvost kosti a spolupodílí se na metabolismu Ca 2+ a fosforečnanů. Vrcholu kostní hmoty dosáhne člověk ve svých 25 létech, poté asi pět let probíhá tzv. vyrovnaná remodelace (tvorba a odbourání kosti jsou v rovnováze) a nakonec dochází k trvalému úbytku kostní hmoty (cca 0,5%/rok), kdy odbourání převyšuje kostní novotvorbu.. Na remodelaci kostí se podílí celá řada vlivů. Jedním z hlavních regulujících mechanismů přestavby kostí je její zatížení (např. obézní lidé trpí méně významným úbytkem kostní hmoty, protože jejich kosti jsou trvale více zatěžovány).Remodelaci kosti ovlivňují hladiny vápníku a fosfátů. Nediferencované buňky kostního povrchu mohou být aktivovány (např. prostřednictvím PTH) na osteoklasty, které způsobují odbourání kostí. Kalcitonin nebo estrogeny mohou aktivitu nediferencovaných buněk potlačit a tak dojde k jejich přeměně na osteoblasty, které podporují výstavbu kostí (u žen po menopauze, kdy je snížena tvorba estrogenů, je úbytek kostní tkáně urychlen, hrozí riziko rozvoje osteoporózy). Osteoblasty obsahují alkalickou fosfatázu (jejíž aktivitu zvyšuje D-hormon), která vytváří vysokou lokální koncentraci fosfátu, což vede (překročením nasycenosti roztoku) k vysrážení Ca 2+ . Osteoklasty jsou stimulovány hormony štítné žlázy (podpora degradace), glukokortikoidy inhibují proteosyntézu v osteoblastech a jejich diferenciaci, tudíž snižují novotvorbu kostí, inzulin zvyšuje syntetickou aktivitu osteoblastů (možné ztráty kostní hmoty při neléčeném diabetu), růstový hormon stimuluje kostní tvorbu prostřednictvím lokálních růstových faktorů (somatomediny IGF-1 a IGF-2; viz též kapitola 17, str. 17-12).) Klinická biochemie Kapitola 19. Biomarkery Pavel Nezbeda 19-24 19.5.2. Kostní choroby Nejdůležitějšími onemocněními kostí jsou osteoporóza, osteomalacie a rachitida. Při osteomalacii a rachitidě je porušena mineralizace základní kostní hmoty, případně základní hmoty růstové chrupavky. Pro zvídavé studenty: Osteopenií se rozumí úbytek kostní masy, její prořídnutí, doslova její chudost [osteon, ř., = kost; penia, ř. = chudost]. Někdy užíváno (nepřesně) místo osteoporóza. Je-li hodnota tzv. T-skóre při denzitometrii v intervalu -1,0 až -2,5 jedná se o osteopenii. Při osteoporóze je hodnota T-skóre <-2,5. Může jít o stav předcházející osteoporóze, její nižší stupeň, ale i o projev stárnutí (viz Velký lékařský slovník on-line). Osteoporóza je postupující (progredující) systémové onemocnění kostí, při kterém dochází k úbytku kostní hmoty a poruchám stavby (mikroarchitektury) kostní tkáně. Příčinami jsou nadměrná sekrece kortikoidů, nedostatek estrogenů (po menopauze), inaktivita (sádrový obvaz, tetraplegie, stav beztíže). Většinou zůstává příčina neznámá (primární osteoporóza). Důsledkem je zvýšená náchylnost kostí ke zlomeninám. Osteoporózou jsou ohroženy zejména ženy po menopauze. Osteoporóza [osteon, ř., = kost; poros, ř., = průchod], prořídnutí kostí, úbytek kostní tkáně, postihující relativně rovnoměrně organickou i minerální kostní strukturu. Základním vyšetřením rizika osteoporózy je měření denzity (hustoty) kostního minerálu. Za osteoporózu se považuje snížení obsahu minerálu ve skeletu o více než 2,5 směrodatné odchylky pod průměr u mladých zdravých žen. I když riziko zlomenin je u osteoporózy 5x vyšší než u zdravého jedince, ve skutečnosti jen asi 3% takto ohrožených lidí utrpí zlomeninu. Nemá tedy smyslu léčit (ekonomicky náročně) zbývajících 97% pacientů potenciálně ohrožených na základě měření denzity kostní hmoty. Riziko zlomenin se proto posuzuje kumulativně z hodnot několika rizikových faktorů, kde svou roli hrají i některá biochemická vyšetření. Úbytek kostního minerálu může být způsoben i jinou chorobou (Pagetova kostní choroba, osteomalacie, primární hyperparatyreóza, mnohočetný myelom) a příčina úbytku kostní hmoty musí být známa. Pagetova choroba (syn. m. Paget, osteitis deformans, osteodystrophia deformans) je kostní onemocnění charakterizované poruchou remodelace kosti, při které dochází k nadměrné kostní resorpci následované kompenzatorně zvýšenou novotvorbou strukturálně méněhodnotné kosti. Postihuje buď jednu kost - monostotická forma (15%), anebo kostí více – polyostotická forma, predilekčně axiální skelet: páteř, pánev, femur, sakrum, lebku. ) Predilekční = označení místa, které je nejčastěji určitým chorobným procesem napadáno „choroba má v tomto místě zálibu“. O osteoporóze a markerech kostního metabolismu viz např. adresu: http://www.roche-diagnostics.cz/prolekare/osteoporoza.aspx 19.5.3. Laboratorní vyšetření u nemocných s kostním onemocněním Cíle laboratorních biochemických vyšetření u nemocných s kostním onemocněním  dokumentace celkového stavu pacienta a příspěvek k diferenciální diagnostice  dokumentace homeostázy vápníku a fosforu (případně hořčíku)  dokumentace úrovně kostní remodelace 19.5.3.1. Markery kostního metabolismu Markery kostní remodelace se dělí na  markery kostní novotvorby  markery osteoresorpce. Jsou to - produkty degradace kostní matrix uvolněné při osteoresorpci z organické kostní hmoty (matrix) - sérové nebo močové proteiny a enzymy syntetizované v osteoblastech nebo osteoklastech. Normální kost Kost s osteoporózou Klinická biochemie Kapitola 19. Biomarkery Pavel Nezbeda 19-25 Vyjadřují  stupeň kostní resorpce (osteoresorpce),  stupeň kostní novotvorby a  rovnováhu (spřažení) mezi oběma procesy. Tato rovnováha mezi aktivitou osteoklastů a osteoblastů je v různém stupni porušena - za různých patologických stavů - fyziologicky po menopauze a ve stáří. K diferenciální diagnostice kostních chorob, přispívají i některá biochemická vyšetření. 19.5.3.1.1. Markery kostní novotvorby  Isoenzymy ALP (izoforma 3. izoenzymu, kap. 12, str. 12-19): mají význam při diferenciální diagnostice hyperfosfatázémie, lze prokázat i nádorové ALP. Stanovují se elektroforeticky.  Terminální řetězce prokolagenu typu I (PINP, PICP, extendující řetězce prokolagenu typu I): uplatňují se v diferenciální diagnostice poruch syntézy kolagenu a při monitorování léčby osteoporózy (viz obrázek na str. 19-22). Stanovení PINP se využívá i při diagnostice kostního rozsevu solidních tumorů a mnohočetného myeomu, čili slouží také jako tumorový marker. Test IDS-iSYS intact PINP na stanovení intaktního PINP pro automatické zpracování dodává fa IDS (ImmunoDiagnosticSystems).  Osteokalcin: Osteokalcin se v krvi, kam částečně přechází jako nezměněný (intaktní) i ve formě fragmentů, poměrně rychle rozkládá (proteolytická degradace) a v oběhu ho zůstává nezměněna asi 1/3; ale i tato část se rychle metabolizuje játry a vylučuje ledvinami, což omezuje jeho diagnostickou hodnotu. Stanovení intaktního osteokalcinu vyžaduje odběr do speciálních zkumavek nebo okamžité zmrazení plazmy po odběru na -70 °C. Toto stanovení má především význam u osteoporózy s deficitem pohlavních hormonů. Příklad testu pro automatické zpracování: IDS-iSYS N-MID ® Osteocalcin 19.5.3.1.2. Markery osteoresorpce  Degradační produkty kolagenu typu I o Pyridinolin a deoxypyridinolin v moči (příčné spojky kolagenu typu I a typu II). Vznikají ve zralém kolagenu intermolekulárním propojením tří lysinových nebo hydroxylyzinových zbytků kolagenních fibril. Pyridinolin (PYD) vzniká spojením tří hydroxylyzinových zbytků, deoxypyridinolin (DPD) spojením dvou hydroxylysinových a jednoho lyzinového zbytku postranního řetězce. V oběhu, kam se dostávají po degradaci kolagenu, se vyskytují jako  volné molekuly nebo  asociované/vázané v peptidech, jako tzv. C- a N-koncové pyridolinové telopeptidy (ICTP, INTP). PYD a DPD volný či celkový se z krve dostávají do moči, kde se stanovují metodami HPLC, ELISA, RIA. Asi 1/5 močového deoxypyridolinu pochází z tkání jiných než je kost, nicméně je tato látka v moči považována za poměrně specifický ukazatel osteoresorpce. Markery kostní novotvorby Markery kostní resorpce Kostní frakce alkalické fosfatázy v séru Hydroxyprolin v moči Osteokalcin (kostní GLA protein) v séru Glykosidy hydroxylysinu v moči C- a N- terminální propeptid prokolagenu typu I (PICP, resp. PINP) v séru Volný a celkový pyridinolin (fPYD, tPYD) Volný a celkový deoxypyridinolin (fDPD, tDPD) Crosslinkové (kroslinkové) telopeptidy kolagenu typu I Cterminální (ICTP uvolněný MMPs) a N-terminální (INTP) C-koncový telopeptid CTx (uvolněný katepsinem K) Tartarát-rezistentní kyselá fosfatáza v plazmě (TRACP5b) Klinická biochemie Kapitola 19. Biomarkery Pavel Nezbeda 19-26 Pyridinolin a deoxypiridinolin mohou také fungovat jako markery kostních metastáz u pacientů s rakovinou prostaty. o C-koncový telopeptid kolagenu typu I, C-Telopeptide Pyridinoline Cross-Links, C-koncový pyridolinový kroslinkový telopeptid kolagenu, C-terminal telopeptide, formálněji carboxy-terminal collagen crosslinks (C-koncové příčné spojky kolagenu; Cterminální kroslinkový telopeptid kolagenu, ICTP, CTX). Vzniká při degradaci kolagenu pomocí matrixových metaloproteáz (viz str.19- 23). Hladina ICTP v séru je úměrná osteoklastické aktivitě v době odběru vzorku. U zdravého člověka by měla značně přesahovat hodnoty 300 ng/l, často se nachází v rozmezí 400 – 440 ng/l. Nižší hladiny svědčí o určitém stupni potlačení kostního obratu, kostní remodelace. o N-koncový telopeptid kolagenu typu I, neboli N-terminal telopeptide,formálněji amino-terminal collagen crosslinks (N-koncové příčné spojky kolagenu, INTP, NTX, NTx). INTP je biomarker rychlosti kostního obratu a měří se v moči nebo v séru. Na rozdíl od ICTP hladiny INTP kolísají ze dne na den, aniž by byl pacient léčen. Hladiny INTP se tedy nedají použít ke zhodnocení efektu léčby. ICTP má využití i jako tumorový marker (osteolytické metastázy). ICTP a INTP se stanovují imunoanalyticky nebo metodami HPLC. o C-terminální lineární telopeptidy (CTx), vznikají účinkem katepsinu K (viz srt. 19-23). Existují tak dvě (odlišná) imunostanovení pro karboxyterminální telopeptidy - ICTP a CTx. Serum CrossLaps ® (CTX-I) je imunochemický test fy IDS (Immuno Diagnostics Systems) pro stanovení CTx, ve formátu ELISA i jako plně automatizovaný test. Je to citlivý a specifický test kostní resorpce. Monoklonální protilátka rozeznává specifickou koncovou sekvenci kolagenu typu I (Glu-Lys-Ala-HisAsp()-Gly-Gly-Arg), kterou během kostní resorpce odštěpují osteoklasty. Podle – čiizomeru kyseliny asparagové –se mění napři stárnutí kosti, nazývá se tato metoda také neboCrossLaps, případně- či -CTX. CTX se uvolňuje do krve během kostní přestavby, zvýšená množství indikují zvýšenou kostní resorpci. Poměr hodnot – avypovídá o rychlosti kostního obratu. Podobné testy mají i jiné firmy. Video s funkcí automatizovaného systému ids.isys je možno shlédnout na adrese: http://www.idsplc.com/en-gb/dvd/ N + NH2 O OH NH2 O OH OH OH NH2 O OH Pyridinolin Trojvazná příčná spojka (Po odstranění OH- skupiny - v kroužku dostaneme deoxypyridinolin) Obrázek je převzat z učebního textu Lenka Fialová, Martin Vejražka, Metabolismu vápníku a fosforu, Praktické cvičení z lékařské biochemie, Všeobecné lékařství, Ústav lékařské biochemie 1. LF UK, 2009/2010 INTP, ICTP, PYD, DPD Klinická biochemie Kapitola 19. Biomarkery Pavel Nezbeda 19-27  Osteoklastická kyselá fosfatáza (tartarát-rezistentní enzym; kostní izoenzym kyselé fosfatázy) se stanovuje fotometricky v plazmě, případně imunoanalyticky v séru. Tento marker vypovídá spíše o množství osteoklastů, nikoli o jejich osteoresorpční aktivitě, přesto ho lze užít jak k hodnocení stupně kostní remodelace, tak k monitorování léčby.  Hydroxyprolin v moči. Při degradaci kolagenu se hydroxyprolin uvolňuje do krevního oběhu a vylučuje se močí, zbývající část je metabolizována játry. Při zvýšené kostní resorpci, např. u osteoporózy, se hladina hydroxyprolinu v moči zvyšuje. Protože se může uvolňovat i jiným způsobem (odbourávání propeptidů kolagenu, ze složek komplementu) nepatří mezi specifické markery osteoresorpce. Navíc je jeho hladina ovlivněna dietou (maso, masové vývary, želatina), proto je nutné dodržovat pokyny pro prepreanalytickou fázi, tj. pacient musí dodržet alespoň jeden den před vyšetřením dietu s vyloučením potravin, které by mohly hladinu hydroxyprolinu ovlivnit Hodnoty těchto markerů v séru nebo v moči mohou být ovlivněny  stupněm kostní remodelace  tvorbou a uvolňováním obdobných markerů z tkání jiných než kost  metabolickou clearancí (v játrech, ledvinách, vychytávání markeru v jiných tkáních)  preanalytickými vlivy (doba odběru materiálu, způsob oddělení séra či plazmy, antikoagulancia, hemolýza, uchovávání vzorku, zmražení)  analytickými faktory (typ antigenu a použité protilátky, specifita testu, tj. vliv interferujících látek apod.) Markery kostního metabolismu doplňují denzitometrii (měření denzity = hustoty kostní hmoty) a rentgenografii a podle výsledků lze posuzovat dynamiku onemocnění, účinnost terapie a prevence, a to v kratších intervalech než pomocí měření minerální hustoty kosti. Kostní markery pomáhají také identifikovat 10-20% žen, které ztrácejí kostní hmotu rychleji než ostatní. O klinickém významu vyšetření markerů kostního metabolismu, jejichž nabídka na trhu rychle roste, se v odborných kruzích stále diskutuje. Analytická a interindividuální variabilita výsledků je často příliš vysoká a interpretace vyžaduje značnou zkušenost a orientaci v laboratorní medicíně. Není snad ani nutno dodávat, že stanovení kostních markerů je záležitostí laboratoře s vazbou na specializovanou ambulanci, tudíž, nepatří tato vyšetření mezi běžná, ve smyslu rutinní, vyšetření v rámci běžných oddělení klinické biochemie. Molekulární zdroje markerů kolagenové degradace Asp-Glu-Hyl-Ser-Thr-Gly-Gly I Gln-Tyr-Asp()-Gly-Hyl-Gly-Val-Gly I Hyl(Lys) 1(I)  2(I) Glu-Lys-Ala-His-Asp()-Gly-Gly-Arg Pyridiniové příčné spojky Pyridinimum crosslinks (PYD, DPD) Hydroxypyridiniové příčné spojky (crosslinks: PYD, DPD; metody: HPLC, EIA) Příčně spojené telopeptidy (crosslinked telopeptides):  ICTP (CTX-MMP, C-koncový příčně spojený [kroslinkový] telopeptid kolagenu typu I, uvolněný matrixovými prote(in)ázami; metoda: imunochemie)  CTx (lineární oktapeptid z odvozený z C-koncového telopeptidu kolagenu typ I, uvolněný katepsinem K); metoda: ELISA, HPLC  NTX (N-koncový příčně spojený telopeptid kolagenu typu I, INCP; metoda: ELISA, HPLC) CTX-MMP CTx NTX Klinická biochemie Kapitola 19. Biomarkery Pavel Nezbeda 19-28 Doporučená laboratorní vyšetření při diferenciální diagnostice osteoporózy Podle: Prof. MUDr. Jan Štěpán, DrSc., Univerzita Karlova, 1.LF, III. IK, Praha, Osteoporóza, riziko zlomenin a biochemické markery kostní remodelace, Labor Actuell 2044, (Roche,)str. 4-11 19.6. Stručné shrnutí kapitoly  Markery jsou látky, z jejichž přítomnosti v tělních tekutinách můžeme usuzovat na patologické procesy v organismu  Kapitola se zaměřila zejména na markery maligních procesů, postižení myokardu, patologie kostního metabolismu, akutního ledvinového selhání, zánětu a sepse. 19.6.1. Tumorové markery  Nádorové (tumorové) markery jsou substance nacházející se v nádoru, nebo jsou nádorem produkované, nebo jsou produkované jako odpověď hostitele na přítomnost nádoru.  Nádorové markery lze využít k odlišení nádoru od normální tkáně, nebo k úvaze o přítomnosti nádoru v organismu. Hlavní využití nádorových markerů je při sledování léčby.  Nádorové markery jsou antigeny, hormony, receptory hormonů, enzymy, různé jiné bílkoviny, mutace v DNA, proteinové produkty onkogenů aj.  Zvýšené hladiny tumorových markerů se mohou vyskytovat i u nemaligních onemocnění, naopak, u tumorů se někdy vyskytnout nemusí. Žádný tumorový marker nemá 100% ani specIfitu, ani senzitivitu.  Metody stanovení tumorových markerů jsou různorodé, používají se metody chemické i imunochemické, i metody molekulární biologie. Mnoho tumorových markerů lze stanovit imunochemickými ligandovými technikami. Moderní přístroje využívají čipové technologie. 19.6.2. Markery postižení myokardu  Markery akutního koronárního syndromu a infarktu myokardu jsou kardiální troponiny (cTnI, cTnT), bílkoviny podílející se na svalovém stahu.  Zvýšená hodnota cTn znamená poškození myokardu, i když ne vždy musí jít o ischemii. Znamená to, že na zvýšení hladiny cTn se podílí nejen nekróza kardiocytů, ale i další jevy. Na to je nutno pamatovat při interpretaci výsledků  Troponiny se stanovují imunochemicky pomocí specifické protilátky.  Za cut off u dané metody stanovení cTn je brána hodnota koncentrace příslušného troponinu odpovídající 99. percentilu hodnota zdravé populace, změřená s precizností VK ≤ 10%.  Tento požadavek splňují tzv. vysoce senzitivní (high sensitive) diagnostické soupravy.  Tyto soupravy navíc umožňují s dostatečnou přesností identifikovat menší poškození myokardu, než tomu bylo dříve, jak u akutních tak u chronických onemocnění myokardu.  Negativním markerem akutního infarktu myokardu je kopeptin, C-terminální část prekursoru vazopresinu. Současný negativní nález troponinu a kopeptinu vylučuje akutní infarkt myokardu.  Za prakticky překonané markery infarktu myokardu se považují CK, CK-MB a LD. Standardně prováděná vyšetření Diferenciální diagnostika Cílená vyšetření fS-Ca, Pi, ALP, GMT, dU-Ca Hyperkalcemický a hypokalcemický syndrom, Pagetova kostní choroba fS-Ca 2+ , iPTH, iso-ALP, 25- hydroxycholekalciferol 2-hodinový test: fU-Ca, Pi, renální tubulární práh pro fosfáty fP-osteokalcin Hyperkortizolismus dU-volný kortizol fS-TSH Hypertyreóza fS-T3,T4 fS-testosteron (muži) Hypogonadismus fS-volný testosteron, LH fS-ELFO bílkovin Mnohočetný myelom diferenciální diagnostika paraproteinémie iPTH = imunoreaktivní parathormon Klinická biochemie Kapitola 19. Biomarkery Pavel Nezbeda 19-29  Na srdeční selhání (a jeho stupeň) lze usuzovat z hodnot natriuretických peptidů, hormonálně aktivních látek, ovlivňujících zejména činnost ledvin (diurézu). Využívají se zejména BNP, NTproBNP a ANP. Stanovují se imunochemicky.  Zkoumají se i další látky, které by mohly být markery srdečního selhání: DC146, galštin-3, proadrenomedulin a ST-2. 19.6.3. Markery zánětu  Markery zánětu jsou zejména proteiny akutní fáze, tj. proteiny syntetizované játry .  Syntézy těchto bílkovin může být při zánětu zvýšena (pozitivní reaktanty akutní fáze) nebo snížena (negativní reaktanty akutní fáze).  Nejvíce rozšířeným stanovením je stanovení C-reaktivního proteinu (CRP). Výrazně se zvyšuje zejména u bakteriálních infekcí, může tak sloužit k odlišení bakteriální a virové infekce.  Prokalcitonin, prekurzor kalcitoninu, ale syntetizovaný v játrech, je citlivým indikátorem bakteriální infekce a těžkých sepsí. Stanovuje se semikvantitativně imunochromatograficky, nebo ligandovou technikou.  Presepsin, subtyp solubilního CD14, se uvádí jako nový marker sepse. Oproti prokalcitoninu není významně přínosnější.  Dalšími markery zánětu jsou sérový amyloid A, výhodný zejména při současném stanovení s CRP, kdy výsledek zcitlivuje, dále IL-6, cytokin, který v kombinaci s CRP nebo se sérovým amyloidem A představuje nejlepší marker novorozenecké sepse a elastáza z granulocytů a neopterin 19.6.4. Markery akutního selhání ledvin  Klasickým markerem činnosti ledvin je hodnota kreatininu, který ale na akutní selhání ledvin (AKI) reaguje poměrně pozdě.  Moderním markerem AKI je neutrofilní lipokalin asociovaný s želatinázou, NGAL. Stanovuje se imunochemicky.  Dalšími markery jsou (snad) albumin a molekula poškození ledvin 1, KIM-1. Poměrně specifickým ukazatelem ischemického poškození ledvin je IL-18. 19.6.5. Markery metabolismu kostí  Markery metabolismu kostí (kostní remodelace) se dělí na markery kostní novotvorby a markery osteoresorpce.  Markery kostní novotvorby jsou kostní frakce sérové alkalické fosfatázy, sérový GLS protein (osteokalcin) a sérové C- a N-terminální propeptidy prokolagenu typu I (PICP, PINP).  Markery kostní resorpce jsou hydroxyprolin v moči, glykosidy hydroxylysinu v moči, volný a celkový pyridinolin (fPYD, tPYD), kroslinkové telopeptidy kolagenu typu I: C-terminální (ICTP), uvolněný na zinku závislou metaloproteázou, N-terminální (INTP), dále C-koncový telopeptid CTx, uvolněný katepsinem K a tartarát rezistentní plazmatická kyselá fosfatáza.  Klinický význam těchto markerů pro diagnostiku a monitoring kostních chorob je předmětem diskuse, interpretace výsledků vyžaduje značnou zkušenost a vlastní provedení i laboratoř s návazností na specializovanou ambulanci. Klinická biochemie Kapitola 19. Biomarkery Pavel Nezbeda 19-30 19.7. Doplňky 19.7.1. Definice infarktu myokardu (pro zvídavé studenty) Kritéria pro akutní infarkt myokardu Pojem akutní infarkt myokardu (AIM) by měl byt užíván tehdy, je-li k dispozici průkaz myokardiálni nekrózy v klinické situaci odpovídající akutní myokardiální ischemii. Za těchto podmínek je ke stanovení diagnózy IM zapotřebí splnit libovolné z následujících kriterií: • Detekce vzestupu a/nebo poklesu hodnot srdečních biomarkerů (nejlépe srdečního troponinu [cTn]), když alespoň jedna hodnota přesahuje 99. percentil pro normální referenční populaci a je přítomen alespoň jeden z následujících: • Symptomy ischemie myokardu. • Nové nebo předpokládané nové významné změny úseku ST – vlny T (ST–T) nebo nově vzniklá blokáda levého Tawarova raménka (BLRT). • Vývoj patologických kmitů Q v EKG záznamu. • Zobrazení nové ztráty viabilního myokardu či nové regionální poruchy hybnosti srdeční stěny. • Identifikace intrakoronárního trombu při angiografii nebo pitvě. • Srdeční smrt se symptomy nasvědčujícími myokardiální ischemii a s předpokládanými novými ischemickými změnami na EKG nebo s novou BLRT, pokud smrt nastala před vyšetřením srdečních biomarkerů nebo dříve, než jejich hodnoty mohly byt zvýšeny. • IM související s perkutánní koronární intervencí je arbitrárně definován elevací hodnot cTn (na > pětinásobek 99. percentilu URL) u pacientů s normálními výchozími hodnotami (≤ 99. percentil URL) či vzestupem hodnot cTn o > 20 %, pokud byly výchozí hodnoty elevovány a jsou stabilní nebo klesají. Navíc je vyžadován alespoň jeden z následujících: 1. symptomy nasvědčující myokardiální ischemii, 2. nové ischemické změny na EKG, 3. angiograficky nález odpovídající komplikaci zákroku nebo 4. zobrazení nové ztráty viabilního myokardu či nové regionální poruchy hybnosti srdeční stěny. • Trombóza stentu spojena s IM detekovaná koronární angiografií nebo při pitvě v podmínkách myokardiální ischemie a se vzestupem nebo poklesem hodnot srdečních biomarkerů, z nichž alespoň jedna je nad 99. percentilem URL. • IM související s provedením aortokoronárního bypassu (CABG) je arbitrárně definován elevací hodnot srdečních biomarkerů (na > desetinásobek 99. percentilu URL) u pacientů s normálními výchozími hodnotami cTn (≤ 99. percentil URL). Navíc je vyžadován alespoň jeden z následujících: 1. nové patologické kmity Q či BLRT, 2. angiograficky doložená nová okluze štěpu nebo nativní koronární tepny nebo 3. zobrazení nové ztráty viabilního myokardu či nové regionální poruchy hybnosti srdeční stěny. Kritéria pro překonaný infarkt myokardu Pro stanovení diagnózy překonaného IM musí byt splněno jedno libovolné z níže uvedených kriterii: • Patologické kmity Q se symptomy či bez nich, a to při vyloučení neischemických změn. • Zobrazení oblasti bez viabilniho myokardu, která je ztenčena a nekontrahuje se, a to při vyloučení neischemických změn. • Patologickoanatomický průkaz překonaného IM Klinická biochemie Kapitola 19. Biomarkery Pavel Nezbeda 19-31 19.7.2. Zkratky použité v textu o tumorových markerech AFP -fetoprotein NSE neuron-specifická enoláza TPS specifický TPA hCG -podjednotka hCG PSA prostata/prostatický specifický antigen TSH thyreotropin 2M -mikroglobulin fPSA volný PSA T3 trijódthyronin CEA karcinoembryonální antigen tPSA celkový PSA fT3 volný trijódthyronin FER ferritin SCCA antigen skvamózních buněk T4 tetrajódthyronin, thyroxin hCG lidský choriogonadotropin SP1 1-specifický glykoprotein fT4 volný tetrajódthyronin MCA antigen mucinózních karcinomů TK thymidinkináza MSA mammární sérový antigen TPA tkáňový polypeptidový antigen Klinická biochemie Kapitola 19. Biomarkery Pavel Nezbeda 19-32 OBSAH: Kapitola 19 Biomarkery................................................................................................................................ 19-1 19.1. Nádorové markery.......................................................................................................................... 19-1 19.1.1. Přehled některých tumorových markerů a jejich klinické využití............................................. 19-4 19.1.2. Charakteristika některých vybraných nádorových markerů.................................................... 19-7 19.1.2.1. CEA (karcinoembryonální antigen).................................................................................. 19-7 19.1.2.2. AFP (alfa1-fetoprotein) ................................................................................................... 19-7 19.1.2.3. PSA, fPSA (prostata specifický antigen) ......................................................................... 19-7 19.1.2.4. hCG (lidský choriogonádotropní hormon - viz kapitola 14., str. 14-35)........................... 19-8 19.1.2.5. CA 15-3............................................................................................................................ 19-9 19.1.2.6. CA 125............................................................................................................................. 19-9 19.1.2.7. CA 19-9............................................................................................................................ 19-9 19.1.2.8. CA 72-4............................................................................................................................ 19-9 19.1.2.9. SCCA (antigen skvamózních buněk; SCC antigen) ..................................................... 19-10 19.1.2.10. NSE (neurospecifická enoláza) ................................................................................... 19-10 19.1.2.11. TK (thymidinkináza)..................................................................................................... 19-10 19.1.2.12. TPA, TPS (tkáňový polypeptidický a tkáňový polypeptidický specifický antigen) ....... 19-10 19.1.2.13. CYFRA 21-1 ................................................................................................................ 19-11 19.1.2.14. HE4.............................................................................................................................. 19-11 19.2. Markery postižení myokardu ........................................................................................................ 19-12 19.2.1. Troponiny .............................................................................................................................. 19-12 19.2.2. Kopeptin................................................................................................................................ 19-13 19.2.3. Natriuretické peptidy ............................................................................................................. 19-14 19.2.4. BNP a NT-proBNP ................................................................................................................ 19-15 19.3. Markery zánětu............................................................................................................................. 19-16 19.3.1. Proteiny akutní fáze ............................................................................................................. 19-17 19.3.1.1. Pozitivní reaktanty akutní fáze....................................................................................... 19-18 19.3.1.2. Negativní reaktanty akutní fáze..................................................................................... 19-18 19.4. Markery akutního selhání ledvin................................................................................................... 19-20 19.4.1. Kritéria pro hodnocení poškození funkce ledvin ................................................................... 19-20 19.5. Markery metabolismu kostí .......................................................................................................... 19-21 19.5.1. Kolagen a další bílkoviny obsažené v kostech ..................................................................... 19-21 19.5.2. Kostní choroby ...................................................................................................................... 19-24 19.5.3. Laboratorní vyšetření u nemocných s kostním onemocněním ............................................ 19-24 19.5.3.1. Markery kostního metabolismu...................................................................................... 19-24 19.5.3.1.1. Markery kostní novotvorby ..................................................................................... 19-25 19.5.3.1.2. Markery osteoresorpce........................................................................................... 19-25 19.6. Stručné shrnutí kapitoly............................................................................................................... 19-28 19.6.1. Tumorové markery................................................................................................................ 19-28 19.6.2. Markery postižení myokardu................................................................................................. 19-28 19.6.3. Markery zánětu ..................................................................................................................... 19-29 19.6.4. Markery akutního selhání ledvin ........................................................................................... 19-29 19.6.5. Markery metabolismu kostí................................................................................................... 19-29 19.7. Doplňky......................................................................................................................................... 19-30 19.7.1. Definice infarktu myokardu (pro zvídavé studenty)............................................................... 19-30 19.7.2. Zkratky použité v textu o tumorových markerech ................................................................. 19-31