Krevní buňky a principy jejich
vyšetřování
na hematologických
analyzátorech a mikroskopicky
Bourková L., OKH FN Brno
Příklady webových stránek
• hematologický atlas
– http://www.hematocytologie.eu/
– http://www.hematologyatlas.com/
– http://www.grsmu.by/files/file/university/cafedry/klinicheskaya-immynologiya/files/fiu/atlas.pdf
 http://www.cellavision.com/en/cellavision-cellatlas
• RBC
– https://www.google.cz/search?hl=cs&site=imghp&tbm=isch&source=hp&biw=1280&bih=908
&q=erythroblasts&oq=erythrob&gs_l=img.1.3.0i19l10.6606.9583.0.12410.8.8.0.0.0.0.68.208.
8.8.0....0...1ac.1.64.img..0.8.201.NRIoSeIUgdk
– http://www.sekk.cz/infoservis/2006_Morfologie_erytrocytu.pdf
• WBC
https://www.google.cz/search?hl=cs&site=imghp&tbm=isch&source=hp&biw=1280&bi
h=908&q=leukocytes&oq=leukocy&gs_l=img.1.2.0l3j0i30l7.1937.12377.0.15795.7.6.0
.1.1.0.244.565.5j0j1.6.0....0...1ac.1.64.img..0.7.577.pvdZx9LlCHk
• PLT
https://www.google.cz/search?hl=cs&site=imghp&tbm=isch&source=hp&biw=1280&bi
h=908&q=platelets&oq=platelets&gs_l=img.1.0.0i19l10.1770.5225.0.7869.9.7.0.2.2.0.
207.325.6j0j1.7.0....0...1ac.1.64.img..0.9.349.CiouVP0aXo0
Vyšetřování krevních buněk v periferní krvi
 nesrážlivá periferní krev
 antikoagulační činidlo: K3EDTA, K2EDTA nebo Na2EDTA
 vyšetření:
 hematologické analyzátory
 mikroskop
myeloblast
promyelocyt
neutrofilní
myelocyt
eozinofilní
myelocyt
bazofilní
myelocyt
neutrofilní
metamy
eozinofilní
metamy
bazofilní
metamy
neutrofilní
tyč
eozinofilní
tyč
neutrofilní
segment
bazofilní
segment
proerytroblast
středně zralý erytroblast
(polychromní normoblast)
pozdní erytroblast
(ortochromní/oxyfilní
normoblast)
retikulocyt
erytrocyt
monoblast
promonocyt
monocyt
magakaryoblast
promegakaryocyt
megakaryocyt
trombocyty
lymfoblast
prolymfocyt
lymfocyt
bazofilní
tyčí
eozinofilní
segment
časný erytroblast
(bazofilní normoblast)
PERIFERNÍ KREV
KOSTNÍ DŘEŇ
plazmat. b.makrofág
Leukocyty (WBC - White Blood Cells)
blast promyelocyt myelocyt meatamyelocyt
neutrofilní segment eozinofilní segment bazofilní segment
lymfocyt lymfocyt
monocyt
neutofilní tyč
Erytrocyty (RBC – Red Blood cells)
Trombocyty – (PLT – Platelets)
proerytroblast
bazofilní NRBC
polychromní
NRBC
oxyfilní NRBC
oxyfilní NRBC
megakaryocyt
Hematologické analyzátory
linka
analyzátor
nátěrový automat
digitální morfologie
12
3
Principy měření hematologických analyzátorů
 principy měření buněk:
 impedanční analýza
 optická analýza
– kombinace různých principů analýzy
– hydrodynamická fokusace:
usměrnění buněk proudem izotonické kapaliny
(diluentem) při průchodu měřícím kanálem „po jedné“
 spektrofotometrická analýza hemoglobinu
Principy měření umožňují vyšetření:
 kvantitativní – počet buněk
 kvalitativní – morfologie buněk
 tvar buňky
 tvar a velikost jádra
 obsah cytoplazmy
Impedanční analýza
 ředění buněčné suspenze
 diluent - vodivý
 krevní buňka – nevodivá
 průchod buněk mezi elektrodami (stejnosměrné elektrické pole) → impulz
 prochází vždy jediná buňka
 počet impulzů = počet buněk
 velikost impulzů = velikost buněk
 možné doplnění vysokofrekvenční analýzou
 na buňku superponováno vysokofrekvenční elektrické pole
 analýza vysokofrekvenčního napětí buňky = morfologie buňky
Optická analýza
 ředění buněčné suspenze
 diluent – opticky inaktivní
 krevní buňka – opticky aktivní
 interakce buněk s monochromatickým
laserovým paprskem
 po interakci buňky s paprskem se provádí analýza:
 prošlého světla (0°)
 odraženého světla
 depolarizovaného světla
 fluorescence
o cytochemické barvení enzymu (peroxidáza) v buňkách, doplňková analýza absorbce
a rozptylu světla dle stupně reakce enzymu v cytoplazmě (u některých typů přístrojů)
 vyšetření:
 kvantitativní a velikost buňky → detekce ve směru (0°)
 kvalitativní/morfologie buňky → detekce odraženého a depolarizovaného
světla, fluorescence, případně kombinace s cytochemickou analýzou
Spektrofotometrická analýza hemoglobinu
 hemolýza všech erytrocytů lyzačním (bezkyanidovým) roztokem
 uvolněný HGB je převeden na chromogenní formu s nejvyšší
hodnotou absorbance při λ = 540 nm
 HGB je převeden na chromogenní formu reagencií (např. imidazolem nebo
sodium lauril sulfátem), která vytváří hemoglobinový komplex
 měření absorbance hemolyzovaného vzorku
a blanku (lyzační roztok)
 z rozdílu absorbancí je vypočítána koncentrace HGB
Mikroskopovací zařízení
Zhotovení nátěru krve
 roztírací sklíčko položit před kapku krve na podložním skle pod
úhlem cca 30 - 40° (nikdy ne do kapky krve); po doteku krve a
roztíracího skla se krev rozlije podél hrany skla; po té rychle
krev rozetřít po podložním skle
 sílu nátěru zvažovat – čím větší úhel, tím silnější nátěr
 úhel se řídí hodnotou HCT: čím ↑HCT, tím ↓úhel; čím ↓HCT, tím ↑úhel
 nátěr musí být: rovnoměrný, přiměřeně tenký, dlouhé okraje
musí být rovné, na konci přechází „do ztracena“
Mikroskopování
 mikroskop
 suchý objektiv: mezi preparátem a objektivem je vzduch (přehledné prohlížení a buněčnost preparátu)
 imerzní objektiv: mezi preparátem a objektivem je imerzní olej (morfologie buněk)
o imerzní olej má podobný index lomu jako sklo – vznikne opticky homogenní prostředí, zvýší se index lomu prostředí
mezi preparátem a objektivem
imerzí může být: voda, parafinový olej, glycerol, cedrový olej, kanadský balzám (voda má vyšší index lomu než vzduch,
ale nižší než imerzní olej)
 zvětšení:
1000x (morfologie buněk)
200x (přehledný náhled na preparát)
 hodnotit nátěr komplexně (WBC, RBC, PLT)
 hodnocení subpopulací WBC a obecně jaderných buněk v periferní krvi i KD v %
 digitální morfologie
nové generace analyzátorů svým softwarovým vybavením digitálně zpracovávají
a vyhodnocují krevní nátěry, hovoří se o virtuální mikroskopii (telehematologie), digitální
analýza vytváří databázi digitálních fotografií krvinek, které lze i exportovat
e-mailem nebo po internetu odborníkům ke konzultaci
Barvení nátěrů periferní krve a aspirátů kostní dřeně
 Panoptická barvící technika:
 fixační roztok May-Grunwald – složení: eozin Y, metylenová modř,
metylalkohol, glycerol
 barvící roztok Giemsa-Romanowsky – složení: metylenová modř, azureozin,
azur II, metylalkohol, glycerol, fosfátový pufr pH 6,8-7,0
 Základní principy barvení:
 Aniontové (kyselé) barvivo eosin Y se váže na kationtové části molekul
proteinů a barví oranžovočerveně hemoglobin a eozinofilní granula
 Kationtové (zásadité) barvivo azur B, se váže na aniontové části molekul a
barví modrošedě zbarvení nukleové kyseliny (DNA nebo RNA),
nukleoproteiny, granula bazofilů a sekundární granula neutrofilů.
Pro správné vyhodnocení preparátů je nutná pravidelná kontrola kvality
panoptického i speciálního cytochemického barvení.
Celkové obarvení nátěru je výsledkem řady různých kombinací těchto
barevných reakcí, které nakonec dávají výsledný vzhled nabarveného
preparátu.
Preparáty lze připravovat manuálně nebo na nátěrových a barvících automatech.
Princip barvení je vždy stejný.
Podpořeno MZ ČR – RVO (FNBr, 65269705)