Izolácie buniek a funkčné testy lymfocytov Peter Slanina (peter.slanina@fnusa.cz) Ústav klinické imunologie a alergologie FN u sv. Anny a Lékařská fakulta MU Rozdelenie imunologických laboratórnych metód serologické (humorálne)- detekcia antigénov a protilátok, Metódy preukázanie tvorby protilátok proti infekčnému agens bunečné- počty a funkcie jednotlivých typov leukocytov Izolácia PBMC PBMC = Peripheral Blood Mononuclear Cells = lymfocyty+monocyty • Izolácia PBMC pomocou gradientovej centrifugácie Krv sa navrství na separačné médium Pri centrifugácii sa oddelia jednotlivé vrstvy na základe odlišnej vznášivej hustoty – hore je plazma, medzi plazmou a médiom je vrstva PBMC, na dno klesnú erytrocyty a granulocyty Izolácia PBMC • Odoberie sa plazma • Naberie sa vrstva PBMC pozorovateľná ako biely prstenec na rozhraní plazmy a média • PBMC sa premyje v PBS (opakované stočenie, odliatie supernatantu, rozsuspendovanie peletu v PBS) • Získavame koncentrovanú suspenziu mononukleárov Ďalšie typy izolácií buniek • IMUNOMAGNETICKÁ SELEKCIA • Využíva magnetické guličky s naviazanou monoklonálnou protilátkou proti určitému CD znaku hľadaného typu buniek • Bunky sa naviažu na tieto guličky a sú silným magnetom prichytené k stene skúmavky, ostatné bunky sa odmyjú (pozitívna selekcia) • Postup je možné využiť aj obrátene – zbaviť sa určitého typu buniek a získať všetky ostatné (negatívna selekcia) • FACS CELL SORTER- modifikácie prietokového cytometra Funkčné testy lymfocytov • test PROLIFERÁCIE lymfocytov (test blastickej transformácie) – sleduje sa schopnosť delenia lymfocytov po stimulácii Definícia: nárast počtu buniek ako výsledok bunečného rastu a bunečného delenia • bujnenie, novo-tvorenie, rast • lat. prolifero prinášať potomstvo: proles deti; fero niesť • dve významné úlohy (role) • embryonálny vývoj • dospelé telo (napr. krvotvorba, obnova tkanív) • typy: symetricky, asymetricky, diferenciačné delenie Video: proliferácia BHK Kedy indikovať test proliferácie??? • podozrenie na SCID • vývoj ochorenia – zástava proliferácie? • odpoveď na liečbu (farmaceutika) SCID Severe Combined Imunodeficiency • skupina ochorení, ktoré vykazujú poruchu vo vývoji lymfoidnej rady – niekedy iba porucha vývoja T-lymf., niekedy kombinácia s B-lymf. a s NK bunkami (záleží na genetickej poruche) • klinické prejavy - thymus se nevyvíja normálne (úplne/redukcia), veľmi nízke počty cirkulujúcich lymfocytov (lymfopénia) a T-lymfocytov • lymfocyty nereagujú na stimuláciu mitogénmi – tzn. nemôžu proliferovať v odpovedi na antigény (myeloidná a erytroidná rada je v počtoch a funkcii neovplyvnená) SCID • existuje asi 7 variant, ktoré sú AR, jedna X viazaná • väčšinou ide o defekt v gama reťazci IL-2R (X-viazaná forma), tento reťazec je aj súčasťou receptorov IL-4, -7, -9, 15 Syndrom T-bb B-bb NK-bb Dědičnost Retikulární dysgeneze - - - AR ADA deficit - - - AR RAG 1,2 deficit - - + AR CgC deficit - + - XL JAK3 deficit - + - AR IL-7Ra deficit - + + AR Omennův syndrom + - + AR ZAP-70 deficit CD4+ + + AR SCID • Predĺženie života vyhnutím sa kontaktu s potenciálne nebezpečnými patogénmi – musia žiť v sterilním prostředí!!! • Musia sa vyhýbať kontaktu s ľuďmi a nefiltrovaným vzduchom, všetkým s čím prídu tieto deti do styku – vrátane jedla! Metódy • Detekcia novo syntetizovanej DNA pomocou thymidínu značeného radioaktívne (tríciom)- meranie na beta-counteru (scintilačný detektor) Metódy • Cytometrická detekcia pomocou fluorescenčného farbiva CFSE (karboxyfluoresceinsukcinimidylester), ktoré sa viaže nešpecificky na rôzne štruktúry v bunkách, sleduje sa nárast fluorescencie po delení buniek Metódy • Proliferačný set DELFIA (BrDU) • Detekcia proteínu Ki-67 Príprava vzorky • cca 2,5 hod • cca 72 hod Stimulancia • Rastlinné lektíny - PHA (phytohaemagglutinin) ConA (Concanavalin A) • monoklonálne protilátky proti receptorom a koreceptorom (anti-CD3,+ anti-CD28) • bakteriálne antigény – tetanický toxoid, tuberkulin Kultivácia lymfocytov in vitro • Pestovanie prebieha v definovanom bazálnom médiu – obsahuje cukry, AMK, vitamíny, stopové prvky atd. (+ ATB – penicilín, streptomycín) pri 37°C, 5% CO2, 95% vlhkosť • Normálne bunky majú obmedzenú dĺžku života- obmedzený počet delení • Pomocou karcinogénnych látok alebo vírov (SV40, EBV) môžeme dosiahnuť transformáciu buniek na nesmrteľné a vytvoriť tzv. bunkové línie Jurkat- ľudské leukemické bunky produkúce IL-2 HL-60- ľudské bunky odvodené od myeloidných leukemických buniek • Cesta, ktorou bolo objavených mnoho funkcií cytokínov a rast.faktorov DELFIA (PerkinElmer) • BrDU- BromoDeoxyUridin • analóg Tymidínu • Eu- Európium • Detekcia novo syntetizovanej DNA pomocou BrDU, začlení sa do novo vznikajúcej DNA, BrdU je potom detekované pomocou protilátky anti-BrdU značenej Eu • jednotlivé stimulancia v tripletoch TRF- Time resolved fluorescence Výsledok DELFIA Cytometrické stanovenie • Ki-67 - jadrový proteín • asociovaný (možno nevyhnutný) s bunečnou proliferáciou a s transkripciou rRNA • interfáza- bunečné jadro • mitóza- povrch chromozómov • prítomnosť G1, S, G2, mitóza • absencia G0 HeLa cells Ki-67 proteín (červená) tubulín (zelená) DNA (modrá) Spracovanie • značenie L/D- 30 min • extracelulárne značenie (CD25 PerCP Cy5.5, CD8 APC A750)- 30 min • CD25- súčasť receptoru pre IL-2 (α reťazec) • fixácia (paraformaldehyd)- 60 min • permeabilizácia (metanol?) + intracelulárne značenie (CD3 APC, Ki-67 PE)- 30 min Gatovacia stratégia Gatovacia stratégia Pacient 1: ↓ expresia Ki-67 Pacient 2: ↑ apoptóza buniek •nestimulované •stimuláciaaCD3 Pacient 2: ↑ apoptóza buniek Pacient 3: silnejšia stimulácia→ zvýšená úmrtnosť bb EXBIO Ki-67 KIT • Stimulancia lyofilizované v skúmavkách • Krv odobraná do heparínu • Všetky potrebné reagencie prítomné v sete • Detekcia: CD3 + Ki67 • Štandardizovaný a testovaný postup Gatovacia stratégia Porovnanie metód Test Čas Cena Výhoda Nevýhoda nasadenia spracovania merania DELFIA 2,5 hod 2,5 hod 15 min 1500 Kč cena náročnosť Ki-67 2,5 hod 3 hod 1 hod 2500 Kč informácie cena EXBIO 15 min 1,5 hod 1 hod 1450 Kč cena a čas ? Proliferačné vyšetrenie • Výsledok: porovnanie kontrola vs. pacient - počet zábleskov (DELFIA) - % Ki67+ buniek (cyt. stanovenie) • Kontrola prevedenia: odber?, viabilita buniek po izolácii PBMC?, spotrebované médium?, • Cytometer: dostatok buniek na analýzu, veľkosť FSC vs. SSC, L/D, % Ki67+ CD3+ buniek • Neg. výsledok = overenie a následné monitorovanie stavu (častejšie kontroly) ELISPOT • patrí medzi funkčné testy lymfocytov • slúži k sledovaniu produkcie špecifických protilátok Blymfocytmi alebo produkcie cytokínov T- a B-lymfocytmi ELISPOT 5 x 105 2,5 x 105 1,25 x 105 0,63 x 105 7 dní po očkovaní TNFR2B cells TNFR2+ B cells Produkcia IL10 B lymfocytmi FluoroSpot – B- lymfocyty Cy3 – IL10FITC – IgG Cy5 – IgM Po stimulácii CpG ODN