Imunizace, nádorová imunologie, transplantace, reprodukční imunologie Marcela Vlková Záměrné a cílené ovlivnění imunity •IMUNIZACE aktivní (vakcinace) • pasivní („hyperimunní“ antiséra) • •IMUNOSUBSTITUCE • „normální“ gamaglobulin • •IMUNOMODULACE • imunosuprese • imunostimulace • plasmaferéza a imunoadsorpce • • IMUNIZACE AKTIVNÍ A PASIVNÍ Imunizace •Aktivní •Pasivní Pasivní imunizace •Principem je dodání specifických protilátek chránících proti rozvoji onemocnění nebo léčících onemocnění. •Je používána zejména u infekčních chorob nebo onemocnění způsobených toxiny. •Účinek je „okamžitý“ ale krátkodobý. •Nedochází ke vzniku specifické imunitní paměti. Pasivní imunizace přirozená •Přenos protilátek IgG placentou •Přenos sekrečních protilátek třídy sIgA v kolostru a zralém mateřském mléce kojenci Pasivní imunizace umělá •Aplikace zvířecích nebo lidských protilátek různého stupně purifikace •Použití: imunomodulace – protekce u pacientů s probíhající virovou bakteriální infekcí •Virová agens: CMV, virus hepatitidy A, B, virus vztekliny, varicella, vakcinia – zdroj protilátek – člověk •Bakteriální agens: C.botulinium, C. diphteriae – zdroj protilátek kůň, C. tetani – lidské protilátky •Respirační syncitiální virus RSV – monoklonální protilátky – palivizumab (nedonošenci •Protilátky proti Rh (D) – zdroj protilátek – člověk •Podání: intramuskulárně, intravenózně, subkutánně •Převládá imunomodulační účinek na přímou ochranou • Nespecifické imunoglobulinové preparáty •Podávají se u imunosuprimovaných jedinců •Extrakcí etanolem je možno ze séra získat imunoglobulinou frakci – 16% roztok je používán jako „normální imunoglobulin“. Obsahuje zejména IgG, stopy dalších tříd jsou terapeuticky zanedbatelné. •Další manipulací (odstranění polymerů IgG, které by se vázaly na Fc receptory a aktivovaly komplement) je možno získat deriváty k intravenóznímu podání •Nově jsou používány i imunoglobuliny pro subkutánní léčbu. Nespecifické imunoglobulinové deriváty (příprava z plasmy 15 000-60 000 zdravých dárců krve) •Intravenózní - 5%: –7S - intaktní molekula IgG –5S - molekula IgG rozštěpena v pantové oblasti na fragmenty Fab2 a Fc (Gama-Venin) –IgM, obohacené preparáty (Pentaglobin) • •Intramuskulární 16% roztok převážně IgG • •Subkutánní - jedná se v podstatě o intravenózní deriváty zahuštěné na 16%. Příprava imunoglobulinových preparátů •Polyklonální „antiséra“ (hyperimunní séra) xenogenní (imunizace zvířat – králík, koza, prase, kůň…) • alogenní (lidská od přirozeně i záměrně imunizovaných dobrovolníků) • •Monoklonální protilátky • myší • modifikované (chimerické, humanizované, lidské) • Využití imunoglobulinových preparátů •Identifikace a kvantifikace antigenů (mikrobiologie, hematologie, transplantologie, klinická imunologie) • •Imunoterapie a imunoprofylaxe • (klasická pasivní imunizace, terapie nádorů, imunomodulace, především imunosuprese) • •Izolace a purifikace antigenních preparátů Indikační skupiny imunoglobulinové léčby •Substituce tvorby protilátek –Primární imunodeficience –Sekundární imunodeficience •Imunoregulace –Autoimunitní choroby –Vaskulitidy –Alergická onemocnění •Léčba infekčních chorob - substituce i imunoregulace • Aktivní imunizace •Vakcinace je hodnocena z medicínského i ekonomického •pohledu jako jeden z nejefektivnějších způsobů prevence •vzniku a šíření infekčních chorob. • •Na individuální úrovni chrání jedince před onemocněním. • •Na populační úrovni (kolektivní imunita daná vysokou •proočkovaností populace) brání šíření infekčních agens a •ochrání i neočkované osoby. • • • Aktivní imunizace •Použití Ag k vyvolání imunitní reakce, která později chrání před patogenem nesoucí tento nebo podobný antigen •Zakladatel E. Jenner –– jako první v roce 1796 naočkoval virus kravských neštovic, 1798 - publikace •Vyvolání je mírného onemocnění a především ochrana před pravými neštovicemi Edward Jenner Discovery of small pox vaccine In 1798, Jenner introduced 1^st vaccination (vacca: cow) following his experimentation with isolates of cow pox virus from ‘Blossom’. Vliv očkování na výskyt infekčních onemocnění v USA Černý kašel Zarděnky Obrna Záškrt Spalničky Příušnice Neštovice „Klasické“ vakcíny •Atenuované mikroby: spalničky, zarděnky, příušnice, rotaviry, varicella, BCG (proti TBC), poliomyelitis (Sabinova), cholera, žlutá zimnice •Živí původci s omezenými faktory patogenity a virulence •Vytváří kompletní T a B-lymfocytární protektivní odpověď, dlouhodobou paměť, absence adjuvans •Riziková pro imunodeficience, možnost reverze do virulentní formy, citlivá na teplo • • „Klasické“ vakcíny •Inaktivované mikroorganismy: poliomyelitis (Salkova), vzteklina, hepatitis A, klíšťová encefalitida, cholera,mor, dříve pertusse •Původci usmrceni chemicky nebo teplotou •Nemožnost reverze do virulentního typu – lze užít u imunodeficiencí •Vytváří převážně humorální odpověď •Nevýhody – nutnost přeočkování, zvýšené riziko lokálních reakcí, omezená stimulace T-buněčné odpovědi „Klasické“ vakcíny •Toxoidy (chemicky modifikované, inaktivované): tetanus, záškrt •Purifikované exotoxiny inaktivované chemicky nebo teplotou •Stabilní, bezpečné, vyvolávají humorální i T-buněčnou odpověď •Slabě imunogenní, nutnost adjuvans, nutnost přeočkování, lokální reakce • • Klasické vakcíny •Podjednotkové, polysacharidové: virus hepatitidy B, influenza, N. meningitis, S. pneumonia, H. influezae •Antigenní součásti původců: purifikované nebo rekombinantní •Jsou to molekulárně definované Ag •Vyvolávají humorální odpověď •Musí se vázat na nosičové proteiny (polysacharidy na tetanový toxoid), nutnost adjuvans, lokální reakce „Klasické“ vakcíny •Podjednotkové (izolované složky mikroorganismů): chřipková, pertusse •Polysacharidové (polysacharidová pouzdra): Heamophilus influenzae B (konjugovaná), Meningococcus (skupina A a C, konjugované i nekonjugované ), Pneumococcus (konjugovaná i nekonjugovaná) •Rekombinantní: konkrétní gen z viru, baktérie či parazita, který je kóduje vznik specifického antigenu. Tento gen se inkorporuje do jiného organismu jež poté produkuje specifický antigen hepatitis B •Virus-like particles (neobsahují DNA): papilomaviry NOVÉ VAKCÍNY •Nanočásticové – virus hepatitidy A, B, C, HPV, Influenza •Liposomy, virus-like particules, virosomy •Biologicky dostupné, internalizace vakcíny, nitrobuněčné zpracování, depozice, řízené uvolňování, adjuvanicita, prezentace, kostimulace, paměť •Imunitní odpověď je humorální i buněčná • NOVÉ VAKCÍNY •Vektorové rekombinantní živé virové nebo bakteriální vektory - virus hepatitidy B, C, M. tuberculosis •Vnesen cílový vakcinační Ag •Vysoká účinnost, komplexní odpověď humorální i buněčná, adjuvancita, biologická dostupnost •Nevýhody: potenciální mutace, odpověď na nosič, limitovaná velikost, výrobní náročnost • •DNA-vakcíny – genetické vektory nesoucí Ag, virus hepatitidy B, C, HPV, Influenza •Výhody – bezpečnost, skladovatelnost, stabilita •Pouze pro proteinové Ag komplexní odpověď humorální i buněčná • • Imunologické adjuvans •anorganické či organické chemické látky, makromolekuly nebo celé buňky některých usmrcených bakterií, které nespecificky zesilují imunitní reakci na podaný antigen •váže antigen, zabraňuje jeho rychlému uvolnění z místa aplikace a jeho degradaci •mohou antigen prezentující buňky antigen lépe fagocytovat. •může aktivovat monocyty a makrofágy, nebo podporovat produkci cytokinů • Adjuvans •Zesiluje a udržuje imunogennost antigenu. •Účinně moduluje imunitní reakci. •Redukuje potřebné množství antigenu i •nutnost opakovaného podání. •Zlepšuje účinnost vakcín u novorozenců, •starých osob i nemocných s podlomenou •imunitou. •Jejich význam je zvlášť důležitý u strukturálně •jednoduchých preparátů. Adjuvans: základní mechanismy účinku • •„Doručení“ antigenu buňkám a orgánům imunitního systému –minerální soli –emulse –liposomy –virosomy, –biodegradovatelné polymerní mikrosféry, – ISCOM (immune stimulating complexes) – •Imunostimulace aktivace buněk vrozené imunity • ligandy TLR, cytokiny, saponiny, bakteriální exotoxiny • •Budoucnost mají komplexní adjuvantní systémy (integrovaná •adjuvancia); je nutno vzít v úvahu zvláštnosti patogeneze i •rozdílné imunogenní vlastnosti Adjuvans aktivuje dendritické buňky •Aktivace přímá • interakce složek adjuvans charakteru „PAMP“ • s TLR i dalšími PRR • •Aktivace nepřímá • prostřednictvím „DAMP“ uvolňovaných při • poškození tkání mikroby (kyselina močová, • ATP, HMGB-1) • •Význam „fylogeneticky konservovaných“ struktur mikrobů. • Freudovo adjuvans •tvořeno směsí minerálních olejů, vosků a inaktivovaných Mycobacterium tuberculosis •nekompletní adjuvans pak obsahuje pouze olejovou emulzi •používá se ve veterinárním lékařství Adjuvans v humánní medicíně •hydroxid hlinitý §hexavakcína, §samostatné očkování tetanickým toxoidem §fosforečnan hlinitý §očkování proti hepatitídě B •fosforečnan vápenatý –alergenové vakcíny – Adjuvans - Soli hliníku •Aplikace vede k poškození buněk, podkoží a svalů, vyvolání DAMP signálů •Aktivace inflamasomů – tvorba pluripotentních prozánětlivých cytokinů IL-1β a IL-18 •Th2 odpověď spojená s tvorbou protilátek •Absence Th1 cytotoxicity Moderní adjuvans •Emulzní adjuvans – emulze voda v oleji •schváleno pro: – MF59 (uvolnění DAMP (ATP), stimulace makrofágů, dendritických buněk, uvolnění prozánětlivých cytokinů, akumulace buněk) – virus chřipky H1N1 pandemický kmen –AS03( aktivace NF-κB) – virus chřipky – senioři, malárie –vakcína proti rakovině děložního čípku obsahující AS03 (deacylovaný lipopolysacharid adsorbovaný na hydroxidu hlinitém) - indukuje vyšší a delší protilátkovou odpověď, ale také mnohem silnější specifickou imunitní paměť ve srovnání s hodnotami pozorovanými po vakcinaci pouze s aluminiovou solí. • • • Moderní adjuvans - mikropartikule •VLP – virus like particules –Napodobují virové částice –Neinfekční aktivace dendritických buněk –Aktivace CD8+ T-LYMFO –Přímá aktivace B-lymfocytů – pro HBV, HPV, malárie –Virosomy –Virové obalové glykoproteiny obsahující hemaglutinin a neuraminidázu –Interakce s DC a kostimulace DC –Stimulace t-lymfocytů ( CD4 i CD8) –Tvorba IFNγ, TNFα, GM-CSF –Virus chřipky, HBA – – – Moderní adjuvans – agonisté receptorů vrozené imunity •Monofosforyl lipid A –Detoxifikovaný LPS Salmonela minnesota –Agonista TLR4, tvorba IFNγ, IL-12 = Th1 odpověď –HPV, leishmanióza, malárie •Flagelin –Složka bakteriálních bičíků, agonisté TLR-5 – klinické zkoušky viru chřipky •CpG fragmenty – syntetické oligonukleotidy – (18-25 nukleotidů) –Agonisté TLR-9 –Th1 odpověď –Aplikace s vakcinami proti HBV u non-respondentů Autran B., et al.: Science 2004; 305: 205-208 File111 Imunologická paměť a vakcinace •Otevřeným problémem protektivní účinnosti •vakcinace je, zda se paměťové buňky, které •jsou indukovány vakcinací, dokáží aktivovat •a diferencovat do efektorových elementů ještě •před tím, než se patogen začne projevovat. Primární a sekundární imunitní odpověď fig1_18 gsbs.utmb.edu/microbook/ch001c.htm Ostatní biologicky významné součásti vakcín •Antibiotika (kanamycin, neomycin) •Konservační prostředky (thiomersal) •Stabilizátory: struktura a konformační •integrita epitopů je ovlivněna především •teplotou a pH. •Chlorid hořečnatý, humánní albumin, •laktóza, sorbitol, želatina. • •Látky z technologického procesu (např. OVA) • • •Národní •imunizační programy •ČR •Vyhláška č. 537/2006 Sb. •o očkování proti infekčním nemocem • •Novela: Sbírka zákonů č. 299/2010 (zejména BCG) Pravidelné očkování v ČR 2011 (Vyhláška 537/2006, novela 299/2010 Sb.) •povinné plošné očkování proti •záškrtu, tetanu, černému kašli, hemofilové invazivní infekci, •virové hepatitidě B, dětské obrně, spalničkám, zarděnkám, •příušnicím •doporučená očkování •u rizikových dětí proti tbc (BCG) •proti pneumokokovým a meningokokovým (A+C) onemocněním, •klíšťové encefalitidě, virové hepatitidě A, planým neštovicím, •infekci lidskými papilomaviry, chřipce • Povinné očkování - vymahatelnost •Rozhodnutí Ústavního soudu (únor 2011): •V obecné rovině je povinné očkování ospravedl- nitelné nejen ve vztahu k Úmluvě na ochranu lid-ských práv a důstojnosti lidské bytosti v souvislosti s aplikací biologie a medicíny, ale i k dalším základním právům občana podle Ústavy ČR a Listiny základních práv a svobod. Jde o opatření nezbytné pro ochranu veřejné bezpečnosti,zdraví a práv a svobod druhých. Hexavakcína •Záškrt, tetanus, pertuse, virová hepatitida B, dětská obrna, infekce způsobené H. influenzae b. •Ukončení do 18 měsíců věku, přeočkování. • • Spalničky, zarděnky, příušnice •Od 15. měsíce, přeočkování za 6-10 měsíců („vychytávací“, „catch up“ dávka) Očkovací kalendář ČR 2011 •2. měsíc (od 9. týdne) hexavakcína (1. dávka) •3. měsíc hexavakcína (2. dávka) •4. měsíc hexavakcína (3. dávka) • •15. měsíc spalničky, zarděnky, • příušnice (1. dávka) •Do 18 měsíce hexavakcína (4. dávka) •21.-25.měsíc spal.,zard.,příuš. (2. d.) •5.-6. rok záškrt,tetanus,pertuse •10.-11. rok záškrt,tetanus,pertuse • dětská obrna • • Principy správné vakcinace •Individuální přístup k očkovanému. •Dodržování absolutních a relativních kontraindikací. •Dodržování správné očkovací techniky. •Použití vhodné vakcíny podle věku. •Vybrání vhodného místa aplikace. •Desinfekce místa vpichu (alkohol) •Zdravotnický dohled po dobu 30 min. IMUNOLOGIE V ONKOLOGII Udává se, že ročně onemocní rakovinou na světě asi 8 milionů lidí. Úloha imunitního systému u nádorových chorob není zatím zcela jasná. I když se připouští mechanismus „imunologické surveillance“ a nádor představuje pro organismus nebezpečí, imunitní systém nedokáže promptně eliminovat všechny nádory a v některých případech nedochází k obranné imunitní odpovědi, ale k navození tolerance. Způsoby maligní transformace buněk •Maligní zvrat - transformace buněk jako důsledek selhání regulace buněčného dělení a sociálního chování bb. •Mutace v onkogenech nebo anti-onkogenech •Nekontrolované dělení - proliferace, únik z normální tkáňové lokalizace, diseminace do jiných tkání a agresivního růstu v nich ONKOGENY •Akumulace genetických poruch, které aktivují buněčné protookogeny a inaktivují antionkogeny •Protoonkogeny – kódují bílkoviny pro přenos růstových a diferenciačních signálů do nitra buňky •Antionkogeny – kontrola přenosu růstových a diferenciačních signálů do nitra buňky • - inaktivace nebo dysfunkce vede k nekontrolovanému buněčnému dělení • - dochází k úniku těchto buněk z normální tkáňové lokalizace a prostupu do jiných tkání a růstu v nich ( metastáze) Rous sarcoma virus: v-src, c-src (tyrosin kináza) Erb-b: receptor pro epidermální růstový faktor Myc: DNA-binding protein Bcl-2: inhibitor apoptózy Bax: stimulátor apoptózy P-53: nuklární protein tlumící růst nádoru. Protoonkogeny – kontrola růstu a buněčného dělení •Růstové faktory – PDFG, EgF, FgF, Src sarkoma virus •Receptory růstových faktorů- erb-b receptor pro epidermální růstový faktor •Signální transduktory – proteiny signálních kaskád – src, ras, G proteiny • Transkripční faktory – jun, myb, c-myc, fos – aktivovány chromosomálními translokacemi u hematologických malignit •Regulátory buněčné smrtiBcl-2 – inhibitor apoptózy, • Bax – regulátor apoptózy •Geny tlumící nádorový růst - p-53 nukleární protein tlumící růst nádoru Rous sarcoma virus: v-src, c-src (tyrosin kináza) Erb-b: receptor pro epidermální růstový faktor Myc: DNA-binding protein Bcl-2: inhibitor apoptózy Bax: stimulátor apoptózy P-53: nuklární protein tlumící růst nádoru. Antionkogeny •Retinoblastom - delší raménko 13.ch •Protein Rb1 - fosfoprotein o Mr=110kDa –v jádrech všech bb – stupeň fosforylace závisí na fázi buněčného cyklu (začíná G1/S, vrcholí G2/M) –fosforylace inaktivuje – regulace buněčného cyklu •2 formy –dědičná forma heterozygoti – stačí 1 další mutace) (výskyt 1:20 000) – postiženy obě oči, více ložisek –Nedědičná forma – vzácnější vyžaduje 2 mutace (na každém homologním ch) - postiženo jen 1 oko 1 nádorem –Vyskytuje se i u nádorů plic,močového měchýře prostaty, prsu Mechanizmy aktivace protoonkogenů •1. Retroviry •2. Mutace •3. Genové amplifikace •4. Chromosomální přestavby –Vede k narušení struktury protoonkogenů nebo ke zvýšení jejich exprese • Antionkogen p53 •– krátké raménko 17. Ch • – fosfoprotein – homotetramery, sekvenčně specifická vazba DNA • – transkripční faktor – brzda vstupu bb do S-fáze • – zástava buněčného cyklu v G1 fázi • – umožňuje přestávku nutnou k opravám DNA •Nefunkčnost – smrt bb nebo genetická nestabilita •Mutace p53 – nejčastější genetická změna v lidských nádorech (50%) •Trojí význam - kontrola BC • - apoptóza • - udržení genetické stability •Aktivita se zvyšuje: • při oxidačním stresu • po UV záření • při zvýšené expresi onkogenů Ras a Myc Nefunkční p53 •1) poškozené mutované bb pokračují v buněčném cyklu •2) umožní poškozeným bb vyhnout se apoptóze •3) vznik genetické instability, umožňující akumulaci mutací Onkoviry - retroviry •Oncovirinae • - lidský lymfotropní virus typu I (HTLV-1) • - T-leukemie (lymfom) dospělých (ATTL), • - doba latence asi 30 let, • - vysoká proliferační aktivita napadených bb- - - větší pravděpodobnost mutací •Lerntivirinae ••Viry HIV-1 a HIV-2 –nádory spojené s jejich infekcí –non-Hodkinův lymfom, –primární mozkový lymfom, –Kaposiho sarkom DNA - onkoviry •DNA nádorové viry (onkodnaviry) – nestejnorodý soubor •Buď proběhne v bb replikace viru, která vede k zániku bb – nevede k transformaci –permisívní bb •Nebo se virus bb přizpůsobí a replikuje se společně s jejím genomem - nepermisívní bb •Cílem viru není bb zahubit, ale řídí svou i její replikaci a v tom může nastat chyba •Extrachromozomální cirkulární DNA - episomy neobsahují lidské onkogeny - kódují proteiny, které interagují s nádorovými supresory (RB, p53, p300/CBP) •Virové onkoproteriny, antigeny T (tumor antigens) jsou nezbytné pro virovou replikaci •Aktivují replikaci blokádou tumor supresorových genů, ovlivnění kontroly BC Nádorová imunologie •Vztah mezi imunitním systémem a nádorem •Role IS v obraně proti nádoru •Zvyšování obranyschopnosti •Imunodiagnostika nádorů •Souvislosti mezi poruchami IS a nádorovými onemocněními • Typy nádorů •Karcinomy – epiteliální buňky •Sarkomy – mezenchym •Lymfomy – solidní nádory lymfytických tkání •Leukémie – nádory lymfocytů a ostatních hemopoetických buněk Relativní výskyt maligních nádorů (Mak a Saunders, 2008) •„Hematopoetické“ (8-10%) • Lymfomy (57%) • Leukemie (29%) • Plazmacytomy (myelomy) (14%) • •Ostatní (90-92%) • Karcinomy • Sarkomy Karcinogenese •Karcinogeny (chemické, radioaktivní, mikrobiální) • Iniciace – vytvoření preneoplastického klonu - • vytvoření a progrese neoplastického klonu – • vytvoření maligního klonu •Další mutace podmiňující schopnost metastazovat •Význam nádorových kmenových buněk • Imunitní reakce na nádorové buňky •Akutní zánět • DAMP nádoru – prozánětlivé cytokiny, ROI, RNI destrukce nádorových buněk, útlum angiogenese a metastatické schopnosti •Buňky NK •Buňky NKT •T-lymfocyty g/d, a/b •Lymfocyty B Stimulace imunitní odpovědi u nádorů vede k •Zničení klonů nádorových buněk •Odstranění nádoru •X •Nádorové buňky vznikají z vlastních buněk •Malá exprese Ag •Slabá imunogennost • •Silná imunitní odpověď vzniká pouze u onkogenních virů Nádorové antigeny •Změněné exprese normálních buněčných proteinů •Exprese se zvyšuje malignancí •Nesprávná exprese normálních genů –Ve špatné tkáni –Ve špatném čase Nádorové antigeny •Produkty mutovaných onkogenů a supresorové geny •Nacházejí se v cytoplazmě nebo na povrchu buněk v komplexech s MHC I.třídy •Po smrti nádorové buňky mohou být fagocytovány APC buňkou, zpracovány a nabízeny pomocí MHC II.třídy Reakce imunitního systému s nádorovými buňkami •Existence nádorově specifických povrchových antigenů – dvě skupiny •Antigeny specifické pro nádory (TSA – Tumor specific antigens •Antigeny asociované s nádory (TAA – Tumor –associated antigens) –produkty mutovaných genů (nové proteiny, cukry..) –idiotypy myelomů a lymfomů •Jsou selektivně exprimovány pouze na nádorových buňkách •Jsou rozpoznávány T- i B-lymfocyty • • NÁDOROVÉ ANTIGENY - TSA –Komplexy MHC s abnormálními fragmenty –a) buněčných proteinů •produkty abnormálního štěpení v normálních proteinů v nádorové buňce •Produkce specifického abnormálního proteinu (nádory a leukémie s chromozomálními aberacemi) –b) fragmenty proteinů onkogenních virů •Polyoma virus, EBV (B-lymfomy, nasofaryngeální karcinom) •HPV (ca čípku) •produkty mutovaných genů (nové proteiny, cukry..) -c) abnormální typy glykoproteinů -d) Idiotypy myelomů a lymfomů – nádory odvozené – od B a T-lymfocytů – vazebná místa jsou unikátní antigenní – struktury • NÁDOROVÉ ANTIGENY typu TAA •Antigeny asociované s nádory •Nejsou výlučně specifické pro nádorové buňky, liší se od normálních buněk kvalitou exprese, nebo v abnormální časové nebo místní expresi •Patří mezi pomocné diagnostické markery •U nádorových buněk se objevují ve vysokých koncentracích • Onkofetální Ag - výskyt v normálních embryonálních buňkách • AFP (alfa-fetoprotein) – fetální sérum, karcinom jater, žaludku, pankreatu • CEA – fetální játra, kolorektální karcinom, ca • žaludku, prsa • •Oba se monitorují při metastázích • NÁDOROVÉ ANTIGENY typu TAA •Změněné glykolipidy a glykoproteinové Ag •Zvýšené množství •Diagnóza, terapeutické cíle •Melanomované Ag •MAGE-3, GAGE-1,2, BAGE – normální testes, melanom •Antigen Her2/neu – receptor růstového faktoru epiteliálních buněk - různé buňky, mamární karcinom •PSA – prostatický sérový antigen, karcinom prostaty •Diferenciační antigeny leukemických buněk – přítomny v různých diferenciačních stádiích (CD10) • • Imunitní systém a maligní nádor •Imunologická úprava nádoru (cancer immunoediting): • •Stadium imunitního dozoru (immunological surveillance) – eliminace maligně transformovaných buněk. • •Vytvoření rovnováhy mezi imunitním systémem a nádorem, selekce rezistentních mutantů – populace nádorových buněk konstantní, pod úrovní klinické detekovatelnosti •Imunitní systém není schopen buňky eliminovat, může trvat až 10 let( melanom, nádor prsu) • •Únik maligních buněk před imunitními reakcemi – klinicky detekovatelné •Klonálně expandující nádorové buňky jsou geneticky značně nestabilní a snadno u nich dochází k chromsomálním aberacím PhD2005-I Cancer immunoedition Dunn GV, Bruce AT, Ikeda H, Old LJ, Schreiber RD: Nature Immunology 2002; 3:991-998 Buněčná imunita proti nádorům •Ag nádorových buněk zachyceny APC •Prezentace Ag na komplexech MHC-II. Třídy •Komplex MHC II.třídy a peptid – rozpoznán CD4+ T-lymfocyty •Aktivované T-lymfocyty – produkce cytokinů, které jsou 2.signálem pro konečnou diferenciaci cytotoxických CD8+ T-lymfocytů Obrana proti nádorům – T-lymfocyty •CD4+ Th-lymfocyty •Sekrece IFN-γ – aktivace makrofágů • TNF-α – po vazbě na buňku způsobují její apoptózu •Zvýšení exprese MHC I.třídy – zvýšení citlivosti k lýze cytotoxickými lymfocyty • •CD8+ Tc-lymfocyty •Rozpoznání a zabití potenciálně maligních buněk exprimujících peptidy: –Z mutovaných buněčných proteinů –Z proteinů onokogenních virů • v komplexu s MHC I.třídy Buněčná imunita proti nádoru •APC + nádorové Ag – aktivace nádorově-specifických CD4+ pomocných T-ly •Jeden typ b. (APC) může senzitizovat T-ly na Ag, které se vyskytují na jiné b. (nádorové) •Vzniklé efektorové cytotoxické T-ly (CTL) rozpoznávají a zabíjejí nádorové b. bez další kostimulace. •Praxe: vakcíny založené na izolaci a produkci dendritických b. jsou prototypem profesionálních APC pacienta. Po inkubaci s nádorovými Ag mohou stimulovat T-b. odpověď. Protilátky •Namířeny proti nádorovým Ag •EBV –indukovaný Lymfom : Ab proti EBV •Aktivace komplementu,ADCC •(Ab-dependent cell cytotoxicity) •X •Schopnost zabíjet nádorové b. prokázána „in vitro“ •Chybí důkazy k průkazu „in vivo“ NK - buňky •NK buňky (natural killers, přirození zabíječi) •In vitro : lýza buněk napadených viry i nádorových b. •Cíl: –Buňky, které neexprimují MHC I.třídy –buňky, které jsou obaleny IgG protilátkami •Aktivitu NK buněk zvyšují IL-2 a IL-12 • Makrofágy •Lýza nádorových buněk •Produkce TNF –Přímé působení – vazbou na receptory způsobují apoptózu –Nepřímé působení – trombóza v cévním zásobení Nejdůležitější obranné mechanismy nádorů proti útoku imunitního systému •Antigenní variabilita (ztráta nebo alterace TSA a TAA) •Zvýšená exprese neklasických MHC I (blok NK- buněk) •Nízká exprese HLA-I antigenů (blokáda CTL) •Exprese FasL - indukce apoptózy Tc buněk •Inhibice funkce dendritických buněk •T-reg inhibice protinádorové reakce T-lymfocytů •Produkce imunosupresivních cytokinů (TGF-b, IL-10) •“Enhancement” efekt protinádorových protilátek JAK NÁDORY UNIKAJÍ PŘED IMUNITNÍ REAKCÍ HOSTITELE •Aktivně potlačují expresi MHC I.třídy – unikají pozornosti spec.cytotoxických T ly •Zbavují se Ag, které by mohly vyvolat imunitní odezvu (rychle rostoucí nádory) •Neexprimují kostimulátory nebo MHC II.třídy (nenavodí stimulaci cytotoxických T ly) •Nádorové Ag mohou navodit specifickou imunologickou toleranci- obal z glykokalixových molekul (mukopolysacharidy), obal z fibrinu • • Monoklonální gamapatie •Důsledek neregulované proliferace jednoho •klonu plasmatických buněk tvořících •homogenní imunoglobulinové molekuly – •„paraprotein“. • „Benigní“: MGUS • Maligní: myelom (plasmacytom) • (tvoří asi 14% všech hematopoetických malignit) Definice monoklonální gamapatie •Biochemická definice: přítomnost monoklonálního imunoglobulinu v séru a v moči (M-Ig) •Klinická definice: Onemocnění či stav patofyziologicky související s klonální proliferací lymfoidní řady B diferencujících se v plazmocyty projevující se přítomností monoklonálního Ig v séru a patologickými lezemi především ve skeletu Diagnóza monoklonálních gamapatií se stanovuje na základní splnění přijatých kritérií •Jak velký je relativní počet plazmocytů v kostní dřeni? (myelogram v.s. histologie kostní dřeně) Jsou klonální? • •Je osteolýza skeletu či jiný typ poškození skeletu? (rtg, MR, PET, hyperkalcemie) • •Je přítomen monoklonální imunoglobulin? (imunofixace a denzitometrie M-Ig) a jaká je hladina polyklonálních imunoglobulinů • •Je přítomen amyloid typu AL? (histologie) Waldenströmova makroglobulinemie •Morfologie – dle WHO klasifikace lymfoplazmocytoidní •lymfom •Přítomnost monoklonálního imunoglobulinu třídy Ig-M •Klinické projevy nemoci: • anémie • důsledky hyperviskozity – epistaxe, retinopatie, únavnost, neurologické příznaky, cefalea, závratě, nystagmus, ataxie, kvalitativní až kvantitativní porucha vědomí, srdeční selhávání Lymfomy (tvoří asi 57% všech hematopetických malignit) • Solidní nádory vycházející z maligní transformace jednoho lymfocytu. Lokalizovány většinou v lym-fatických uzlinách, též ve slezině nebo thymu. Mohou být i v difusních lymfatických tkáních, např. v GALT, pak se nazývají extranodální. • • Hodgkinský lymfom (HL, cca 12,5%) • Non- Hodgkinský lymfom (NHL, cca 44,5%) • Hodgkinský lymfom • V lymfatické uzlině je několik velkých mnoho- jaderných buněk (buňky Reed-Sternbergovy), které jsou maligně transformované lymfocyty B, zbytek tumorové masy je tvořen tzv. reaktivním infiltrátem z netransformovaných lymfocytů, fibroblastů a jiných buněčných elementů. • • Postihuje především mladé pacienty (15-35 let), zvl. mužského pohlaví Nehodgkinské lymfomy •Skupina heterogenních nádorů (subtypy z B- i T-buněk). •Nádorová masa je tvořena prakticky výhradně maligními lymfoidními buňkami. •Vyskytuje se především u starších osob (65 let) ale významný počet je i u osob mezi 30-40 lety). •Burkittův lymfom je vázán na EBV, je u dětí. Leukemie (tvoří asi 29% všech hematopoetických malignit) •„Tekuté nádory“ krve, pocházejí z maligně transformovaných prekursorů hematopoetických prekursorů v kostní dřeni nebo zralých hemato-poetických buněk v krvi. Mohou být lymfoidní, myeloidní, akutní, chronické. •V dětském věku je nejčastější akutní lymfoblastická (75%) a myeloidní (20%) leukemie. •U dospělých se nejčastěji vyskytuje chronická lymfatická leukemie (35%). Imunologická léčba maligního bujení •Imunomodulační cytokiny (IFN-a, IL-2) •Indukce zánětu se stimulací Th1 buněk - BCG vakcína •Léčba monoklonálními protilátkami (anti-CD20, anti-HER2 ….) •GVLR po alogenní transplantaci kostní dřeně •LAK a TIL buňky •Imunizace nádorovým antigenem v dendritických buňkách, imunizace proti onkogenním virům • • • Imunoterapie nádorů •Specifická léčba – cytostatika zabíjejí (poškozují) všechny dělící se b., především b. imunitního systému •Stimulace aktivní imunitní protinádorové reakce •a) vakcinace nádorovými b. nebo Ag – podávání vlastních APC (dendritické b.) po jejich inkubaci s nádorovými Ag „in vitro“ •b) stimulace hostitelské imunitní reakce cytokiny a kostimulátory : systémové podání cytokinů (Il 2) stimuluje proliferaci a aktivitu NKb. a cytotoxických T ly (toxické projevy-horečka,plicní edem), IFN alfa (současně s chemoterapií) • •c) nespecifická stimulace imunitního systému(lokální podávání látek,které stimulují zánět) Imunoterapie nádorů •Pasivní imunoterapie Tb. A protilátkami. •a) adaptivní buněčná terapie – pacientovi podávány kultivované imunitní b. s protinádorovou aktivitou •b) podání protilátek s protinádorovou aktivitou •MP eliminují nádorové b. opsonizací, fagocytozou a aktivací komplementu •MP anti Her-2/Neu- namířeny proti produktu onkogenu, Herceptin-nádor prsu. TRANSPLANTAČNÍ IMUNOLOGIE Transplantace •Přenosy tkání nebo orgánů •Cíl: náhrada nefunkční tkáně nebo orgánu příjemce zdravým ekvivalentem (štěp) od dárce •Štěpy: •Syngenní – dárce geneticky identický s příjemcem (identická dvojčata) •Alogenní – geneticky odlišní dárci stejného živočišného druhu •Xenogenní – dárce z jiného živočišného druhu (prase) –Nedostatek vhodných dárců - značné množství přirozených protilátek → hyperakutní odhojování → vývoj transgenních prasat – bb by nesly méně antigenů rozeznávaných lidskými přirozenými protilátkami • •Autologní transplantace – přenos tkání jedince na jiné místo jeho organismu •Implantace – umělé (syntetické) náhrady tkání Transplantace neboli přenosy tkání nebo orgánů představují terapeutické zákroky, které mají za cíl nahradit nefunkční tkáň nebo orgán příjemce zdravým ekvivalentem. Nejčastějším druhem transplantace v klinické praxi jsou krevní transfuze Orgánové transplantace – ledviny, srdce, játra, rohovka Transplantace kostní dřeně Nedostatek vhodných dárců → xenogenní orgány – prase Značné množství přirozených protilátek → hyperakutní odhojování → vývoj transgenních prasat – bb by nesly méně antigenů rozeznávaných lidskými přirozenými protilátkami Transplantace orgánů, tkání, buněk •Dárce a příjemce: •Autologní transplantace (autograft) •Syngenní transplantace (isograft) •Alogenní transplantace (allograft) •Xenogenní transplantace (xenograft) • •Důsledky histoinkompatibility: •Rejekce (odvržení, odhojení) štěpu •Reakce štěpu proti hostiteli (graft versus host reaction –GvHR) • • Hlavní histokompatibilitní komplex •Jedná se o genetický systém, který je primárně zodpovědný za rozeznávání vlastního od cizorodého (Major Histocompatibility Complex). U člověka je hlavním histokompatibilním systémem komplex HLA (Human Leucocyte Antigen) – rozsáhlý komplex genů, které determinují povrchové molekuly (Ag) umístěné v plazmatické membráně buněk. HLA •Antigeny se chovají jako transplantační, tzn. že jsou příčinou odhojení tkáně při inkompatibilních transplantacích •HLA systém je homologický s lokusem H-2 u myši (systém, na kterém byl poprvé objeven princip histokompatibility) a je lokalizovaný v určitém úseku krátkého raménka chromosomu 6 •Obsahuje geny pro histokompatibilní antigeny, složky komplementu a pravděpodobně i Ir-geny (immune response genes, geny zodpovědné za intenzitu imunitní odpovědi) • Funkce HLA-systému •Hlavní fyziologickou funkcí molekul MHC je předkládat antigeny nebo jejich fragmenty buňkám imunitního systému, především T-lymfocytům •Prezentace antigenu je prvním předpokladem pro rozvoj imunitní reakce a tím obrany proti napadení mikroorganismy Prezentace HLA Ag dárcem a příjemcem Druhy transplantace •Nejčastějším druhem transplantace v klinické praxi jsou krevní transfuze •Orgánové transplantace – ledviny, srdce, játra, rohovka •Transplantace kostní dřeně • Orgánové transplantace •Ortotopická transplantace – na stejné místo •Ektopická transplantace – na jiné místo organismu •Transplantované orgány –Ledviny –Srdce –Plíce –Játra –Pankreat –Velké klouby –Kůže • • • • Cross-match – sérum příjemce se smíchá s lymfocyty dárce v přítomnosti komplementu… Pokud jsou v séru přítomné cytotoxické protilátky - aloantigeny, dojde k lýze dárcových leukocytů → kontraindikace transplantace → hyperakutní rejekce Transplantace – vyšetření příjemce štěpu •Určení krevní skupiny AB0 (transplantace orgánů) •Typizace HLA I (A, B, C) •Typizace HLA II (DR,DQ) •Přítomnost autoprotilátek •Preformované aloprotilátky (panel reactive antibody) •„Crossmatching“ – přítomnost preformovaných protilátek specifických pro potenciálního donora •Kultivace směsi lymfocytů (mixed lymphocyte culture assay) – shoda v oblasti D. • • Kritéria výběru pro transplantace •Genetický rozdíl (MHC) •Druhy tkáně – závisí na obsahu buněk, které mají schopnost prezentovat Ag (např. kůže) •Aktivita imunitního systému příjemce – úprava imunosupresí •Stav transplantovaného orgánu Cross-match •Sérum příjemce se smíchá s lymfocyty dárce v přítomnosti komplementu… •Pokud jsou v séru přítomné cytotoxické protilátky - aloantigeny, dojde k lýze dárcových leukocytů za účasti komplementového systému • Rejekce • nepřijetí tkáně nebo transplantovaného orgánu •Podílejí se na ní: – aloreaktivní T-lymfocyty, kterým jsou prezentovány antigenní peptidy pocházející z hlavních nebo vedlejších histokompatibilitních Ag štěpu nebo transplantátu –protilátky proti HLA antigenům dárce –Na úroveň poškození transplantovaného orgánu reaguje nespecifická imunita prostřednictvím DAMP signálů Rejekce Transplantační – aloimunitní reakce •Genetický polymorfismus → Imunokompetentní buňky jednoho jedince reagují s antigeny tkání jiného jedince •vznikají na základě: alorektivity … •Aloreaktivita T-lymfocytů: - přímé rozpoznání antigenů •T-lymfocyty příjemce jsou schopny rozeznávat jako cizorodé: •odlišné alelické formy MHC gp – vážou různé peptidové fragmenty normálních buněčných proteinů •T-lymfocyty příjemce náhodně váží na tyto mnohočetné struktury MHC s peptidy, se kterými se nemohly setkat během vývoje a není vůči nim ustanovena tolerance •Alogenní buňky dárce se imunitnímu systému příjemce jeví jako např. napadané virem • Přímá a nepřímá cesta rozpoznávání Dárce Dárce Příjemce Příjemce Příjemce Aloimunitní reakce •Aloreaktivita T-lymfocytů: nepřímé rozpoznání Ag •odlišné MHC gp dárce jsou zpracovávány APC příjemce a jejich štěpy jsou předkládány T-lymfocytům jako cizorodé Ag •Průkaz aloreaktivity T-lymfocytů: směsná lymfocytární reakce (MLR) –V kultuře smícháme lymfocyty s příměsí monocytů dvou geneticky odlišných jedinců –T lymfocyty reagují na alogenní komplexy MHC – nastává aktivace a buněčná proliferace –Reagují buňky příjemce na buňky dárce – jednosměrná MLR reakce – buňky dárce se ozáří nebo se vystaví cytostatikům – mitomycinu C – nemůžou se dělit. Další aktivace a proliferace buněk je pak dána reakcí příjemce Aloimunitní reakce •vznikají na základě: alorektivity … •odlišné alelické formy vedlejších histokompatibilních antigenů (MHC dárce a příjemce geneticky shodné) – méně intenzivní aloreaktivita •Aloantigeny mohou v příjemci transplantátu vyvolávat tvorbu protilátek •Tvorba protilátek proti aloantigenům – mohou vznikat stejně jako při aktivaci T-lymfocytů •Nebo mohou být přítomné již před transplantací (krevní transfuze, opakované těhotenství) •Nebezpečné protilátky proti štěpu jsou takové, které aktivují komplement •Přítomnost těchto protilátek = kontraindikace transplantace → hyperakutní rejekce Ovlivnění transplantátu přirozenou reaktivitou •Stav transplantovaného orgánu závisí • na okolnostech smrti dárce, které může předcházet cytokinová bouře •Manipulaci s transplantovanou tkání, zajištění perfuze, chirurgické a tkáňové procedury •Uvolnění DAMP signálů: –Alarminy: HMGB-1 (1hydroxy-2methyl-but-2-enyl 4-pyrofosfát), IL-33, IL-1α –Mediátory uvolněné z cytoplazmy poškozených buněk: DNA, RNA, Hsp proteiny, ATP… •Vazba na PRR – TLR, C-lektinové receptory… •Výsledkem je aktivace buněk přirozené imunity spojená s produkcí prozánětlivých cytokinů: IL-1β, IL-6, IL-18, TNF-α, produkce chemokinů a exprese kostimulačních molekul Ovlivnění transplantátu přirozenou reaktivitou •Podpora exprese adhezních molekul na stěnách endotelu, zvyšování prostupnosti pro zejména dendritické buňky migrující z transplantované tkáně do lymfatických uzlin příjemce a naopak podpora průniku efektorových buněk do transplantované tkáně •Podpora rozvoje zánětu především na endotelové výstelce cév transplantovaných orgánů •Jedná se o nespecifickou odpověď na předoperační a perioperační poškození transplantovaného orgánu a není závislá na HLA dárce a příjemce •Sama o sobě není schopna vyvolat rejekci • Rejekce transplantátu •Ovlivňující faktory: •Genetický rozdíl dárce a příjemce v genech kódujících MHC •Druh tkáně- nejsilnější reakce vznikají proti vaskularizovaným tkáním obsahujícím hodně bb prezentujících antigen •Aktivita imunitního systému příjemce- imunodeficientní příjemci vyvíjí menší odhojovací reakci, imunosuprese •Stav transplantovaného orgánu- délka ischemie, způsob uchování, traumatizace orgánu při odběru a samotné transplantaci → vaskulární (popř. chronická) rejekce •Farmakologická imunosuprese – imunosupresivní léčba – celkový útlum imunitních reakcí • Druhy rejekce •Imunitní reakce protilátkového typu: •způsobená protilátkami buď přirozenými nebo vytvořenými v důsledku předchozích imunizací •Hyperakutní (min. – hod.) •Akcelerovaná (3 – 5 dnů po transplantaci) •(xenotransplantace, transfuze krve neshodné v ABO systému) • •Imunitní reakce proti štěpu: •Akutní odhojování (dny – týdny) – primární imunitní reakce proti štěpu – důsledek útoku Th1 a Tc buněk •Chronická (2 měsíce po transplantaci)- – ischemie tkání, poškození cév – transplantační vaskulární skleróza – nahrazování funkční tkáně vazivem, poškození endotelu a vaskularizace s následnou obliterací cév → poruchy prokrvení štěpu a postupná ztráta funkce •Způsobená protilátkami ( nejčastější ) nebo T-lymfocyty (Reakce pozdní přecitlivělosti – vznik Th2 a Th3 – vznik aloprotilátek a fibrogenních faktorů) • • Imunitní reakce protilátkového typu – způsobená protilátkami buď přirozenými nebo vytvořenými v důsledku předchozích imunizací Akutní – jedná se o primární imunitní reakci proti štěpu, přerušení imunosuprese Chronická – ischemie tkání, poškození cév – transplantační vaskulární skleróza – nahrazování funkční tkáně vazivem, poškození endotelu a vaskularizace s následnou obliterací cév → poruchy prokrvení štěpu a postupná ztráta funkce Transplantační – aloimunitní reakce —Genetický polymorfismus → Imunokompetentní buňky jednoho jedince reagují s antigeny tkání jiného jedince •→ Odhojení – rejekce transplantátu —Transplantát vnímán imunitním systémem příjemce jako cizorodý —Orgánové transplantace •→ Reakce štěpu proti hostiteli (GvH) —Imunokompetentní buňky ve štěpu reagují s tkáněmi příjemce —Imunodeficientní pacienti —Transplantace hematopoetických kmenových buněk •Aloantigeny: —MHC glykoproteiny (HLA antigeny) —Vedlejší histokompatibilitní antigeny (polymorfní tkáňové antigeny) • •→ alorektivita T-lymfocytů • tvorba protilátek proti aloantigenům To je příčinou hlavních problémů transplantací... Což je: Rejekce a reakce proti štěpu Hlavními antigeny zodpovědnými za tuto reaktivitu jsou MHC a vedlejší... MHC gp – jejich funkcí je vázat peptidové fragmenty proteinů produkovaných (pohlcených) buňkou a vystavovat je na svém povrchu tak, aby byly rozeznatelné T-lymfocyty. Většina MHC gp se vyznačuje extrémním polymorfismem, což právě způsobuje komplikace při transplantacích. Aloimunitní reakce vznikají na základě: alorektivity … Aloreaktivita T-lymfocytů: T-lymfocyty příjemce jsou schopny rozeznávat jako cizorodé: odlišné alelické formy MHC gp – vážou jiné peptidové fragmenty normálních buněčných proteinů odlišné alelické formy vedlejších histokompatibilních antigenů (MHC dárce a příjemce geneticky shodné) – méně intenzivní aloreaktivita Tvorba protilátek proti aloantigenům: Aloantigeny mohou v příjemci transplantátu vyvolávat tvorbu protilátek Přítomné již před transplantací (krevní transfuze, opakované těhotenství) Kontraindikace transplantace → hyperakutní rejekce Úloha protilátek při transplantaci •Protilátky jsou namířeny proti HLA Ag transplantátu – Donor specific anibodies (DSA) •Klinicky nejvýznamnější jsou ve třídě IgG – namířeny proti HLA I. I II. Třídy a také proti molekulám MICA a MICB (=non HLA- antigeny MHC class I Chain related A, MHC class I Chain related B •Váží se na své Ag cíle na endotelové výstelce transplantátu •Po vazbě aktivují komplement – dochází k rozvoji zánětu, který poškozuje endotelové buňky a aktivaci koagulační kaskády •Protilátky poškozují štěp mechanismem ADCC •Účastní se všech typů rejekce, dominují u hyperakutní rejekci •Přítomnost DSA protilátek u příjemce – nepříznivý faktor ovlivňující prognózu přežití transplantovaného orgánu •Hladina protilátek koreluje s rizikem rejekčních příhod •Nález IgG protilátek proti antigenům HLA- I. třídy – kontraindikace k transplantaci •Nález IgG protilátek proti antigenům HLA- II. třídy – kontraindikace k retransplantaci • Odstranění protilátek - plasmaferézou Protilátková rejekce Program transplantace orgánů •živý dárce versus kadaverózní dárce •Příjemce imunogenetické vyšetření pacienta (čekatele): HLA typizace (A,B,DR – sérologie, nízké rozlišení DNA) Autoprotilátky Pravidelný screening anti-HLA protilátek •Imunogenetické vyšetření kadaverózního dárce - statim HLA typizace (A,B,DR – sérologie, nízké rozlišení DNA) Cross-match (sérum pacienta s lymfocyty dárce) před vlastní transplantací Transplantace hematopoetických kmenových buněk •(= transplantace kostní dřeně) •Cíl: osídlení dřeně příjemce kmenovými buňkami dárce → vznik celé krvetvorby •Kmenové buňky z kostní dřeně, pupečníkové krve, z periferní krve dárce po stimulaci růstovými faktory •Poruchy krvetvorby, imunodeficience, vrozené metabolické vady, leukemie, léčba ozáření, těžce probíhající autoimunitní choroby •Vždy se jedná o rizikovou proceduru zatíženou velkou mírou morbidity a latelity • Morbidita - nemocnost Latelity - úmrtnost Transplantace hemopoetických kmenových buněk •Zdroj: •kostní dřeň (odběr z lopaty kosti kyčelní) •periferní krev (dárce „stimulován“ růstovými faktory k zvýšení tvorby kmenových buněk) •pupečníková krev (zdroj nezralých kmenových buněk omezené imunogennosti) •Typy transplantace: •autologní •alogenní • Průběh transplantace —Myeloablace – zničení vadných kmenových buněk příjemce • je potřeba uvolnit prostor v kostní dřeni, ozářením nebo farmakologicky, od doby myeloablace do doby přihojení nemá pacient prakticky žádné periferní leukocyty, je ohrožen infekcemi, proto je nutné dodržovat sterilní podmínky — —Suspenze směsi dřeňových buněk do periferní žíly- kmenové buňky si najdou cestu do kostní dřeně a usídlí se tam ( předepsaný počet buněk na kg) — —Engraftment – přihojení- ve chvíli, kdy je detekována krvetvorba: erytro → granulo → trombo →lymfocyty — —Odvržení stěpu – rejekce – zástava krvetvorby pocházející od dárce, obnova krvetvorby příjemce —Reakce štepu proti hostiteli Myeloablace – je potřeba uvolnit prostor v kostní dřeni, ozářením nebo farmakologicky, od doby myeloablace do doby přihojení nemá pacient prakticky žádné periferní leukocyty, je ohrožen infekcemi, proto je nutné dodržovat sterilní podmínky Samostatná transplantace kostní dřeně je technicky jednoduchá – suspenze směsi dřeňových buněk do periferní žíly příjemce a kmenové buňky si najdou cestu do kostní dřeně a usídlí se tam erytro → granulo → trombo →lymfo-cyty Přihojení – ve chvíli, kdy je detekována krvetvorba Pluripotentní kmenové buňky •Exprese znaku CD34 a CD45, CD117, CD133 a další •Nízký podíl – méně než 1% •Pro transplantaci bb je nutné získat pro štěp dostatečný počet kmenových buněk •U autologní transplantace, nebývá imunologický problém, ale je problém se získáním vzorku dřeně před započetím nemocí, jinak nutnost zbavit dřeň nádorových buněk Poškození krvetvorby u osob trpících nádorovým onemocněním •Neselekční působení chemoterapie a radiační terapie na buňky kostní dřeně •Nutná podpora krvetvorby •Aplikace rekombinantních růstových faktorů: G-CSF, GM – CSF – řešení neutropenie •Neřeší se trombocytopenie – důsledek: krvácivé projevy •Autologní transplantace bb. kostní dřeně nebo kmenových buněk krvetvorby Transplantace kmenových buněk periferní krve •Alogenní transplantace •Není přítomna úplná deplece buněk kostní dřeně, což snižuje riziko komplikací •Umožňuje vysokodávkovou chemoterapii nádoru, která by bez kmenových buněk nebyla možná •Časté použití při léčbě non-Hodgkinských lymfomů v relapsu, mnohočetného myelomu, akutní myeloblastické leukémie •Někdy se používá i při léčbě solidních nádorů a autoimunitních chorob (RA, SLE, SM) Transplantace kmenových buněk periferní krve •Pacient je uveden do remise běžným terapeutickým postupem •Po dosažení požadované leukopenie v periferní krvi se začnou podávat růstové faktory, nejčastěji G-CSF •Prudká stimulace krvetvorby, pluripotentní kmenové buňky jsou častěji uvolňovány do periferie •Z ní se získávají leukafarézou – oddělení leukocytů a plasmy •Z takto získaných buněk se magneticky separují •Štěp by měl dosahovat 5x10*6 CD34+buněk na kilogram příjemce •Poté následuje léčba vysokodávkovými režimy – vede k útlumu krvetvorby •Poté se podávají kmenové buňky • Transplantace kmenových buněk pupečníkové krve •Vysoký obsah CD34+ - více něž 1%z jaderných elementů •Po porodu zůstává v placentárních cévách až 150ml fetální krve, možno získat 80-100ml • obsah kmenových buněk v této krvi postačuje na úplnou transplantaci u dětí nebo dospělých s nízkou hmotností •Stoupá procento využití v budoucnosti • Složení pupečníkové krve •Vysoký počet leukocytů •Snížen celkový počet T-lymfocytů •T-lymfocyty mají nižší známky aktivace (nižší exprese CD25 a HLA-DR) • Vyšší zastoupení NK buněk •Jiné zastoupení pluripotentních prekurzorových buněk krvetvorby (erytrocyty, monocyty, megakaryocyty •Zastoupení prekurzorových buněk je podobné jako v kostní dřeni T-lymfocyty v pupečníkové krvi •Nejen nižší počet, ale i trvale snížená odpovídavost na alogenní podněty • Navíc nízká produkce IL-12 přítomnými APC •Snížení výskytu reakce štěpu proti hostiteli •Využití při léčbě krevních malignit – akutní myeloblastické leukémie, chronické myeloidní leukémie, ale i neuroblastomu •Dále nenádorová onemocnění např. idipopatická aplastická anémie, srpkovitá anémie, různé typy SCID a další Výhody transplantace pupečníkové krve •Buňky je možné zamrazit na dlouho dobu v tekutém dusíku •Využití v případě onemocnění daného jedince •Použití pro alogenní transplantace •Minimální riziko přenosu infekčních agents, včetně CMV a EBV •Je možné tyto buňky využít pro genové manipulace – např. vnesení intaktních genů pro vyléčení geneticky podmíněných nemocí •Nevýhody: –u relapse maligních onemocnění není reakce štěpu proti hostiteli, ve které by T-lymfocyty dárce napadaly maligně transformované buňky příjemce –Není známo jestli dárce trpí geneticky přenosnou chorobou Obnova imunitního systému po transplantaci kmenových buněk •Postupně dochází k úpravě počtu jednotlivých druhů leukocytů •Obnova funkcí těchto buněk může trvat měsíce až roky •V podstatě nikdy úplně nedojde k úplné restauraci všech složek imunity do optimálních fyziologických hodnot •Nejrychleji se obnovují NK-buňky – po pěti měsících je dosaženo normálních hodnot i funkčnost Obnova T-lymfocytů po transplantaci kmenových buněk •T-lymfocyty normálně dozrávají v thymu – ve věku nad 40let je to ale nefunkční tkáň •Extrathymová diferenciace – zpravidla v gastrointestinálním traktu a v játrech •Rychleji se zvyšuje počet CD8+ T-lymfocytů a to až nad fyziologickou mez, podíl CD4+ T-lymfo je dlouhodobě snížen ( CD8+ T-lymfocyty mají i větší radiorezistenci) •Obnova funkcí u CD8+ T-lymfocytů – zhruba po třech měsících u CD4+ T-lymfo to trvá déle •Mají sníženou proliferační aktivitu, tvoří méně IL-2 •Zdrojem T-lymfocytů mohou být také prekurzory T-lymfocytů příjemce, které přežily přípravný režim •Prekurzory T-lymfocytů dárce v transplantovaném štěpu •Byl zaznamenán přenos imunity vůči konkrétnímu virovému agnes z dárce • • Obnova B-lymfocytů po transplantaci kmenových buněk •Podíl B-lymfocytů je výrazně snížen po dobu prvních 9-ti měsíců pro transplanatci •Po tuto dobu nesou B-lymfocyty znaky nevyzrálých buněk např. CD10, tzv. transientní B lymfocyty •Zdrojem B-lymfocytů – kmenové buňky ve štěpu nebo rezidující kmenové buňky v příjemci, dále B-lymfocyty v kostní dřeni, lymfatických uzlinách a ve slezině •Jsou přítomny i ve štěpu •Byl prokázán i přenos specifické humorální imunity z dárce na příjemce •Dynamika tvorby Ig je podobná jako u dětí Reakce štěpu proti hostiteli •Akutní GvHD (I.-IV. stupeň závažnosti) postihuje- kůže, střevo, játra Fáze 1: „Priming” (příprava) imunitní odpovědi Fáze 2: Aktivace T-lymfocytů, kostimulace Fáze 3: Proliferace a diferenciace aloreaktivních T-lymfocytů Fáze 4: Migrace aktivovaných T-lymfocytů do cílových orgánů Fáze 5: Poškození cílových tkání efektorovými T-lymfocyty •Chronická GvHD (limitovaná/extenzivní) podobnost s chronickým autoimunitním postižením Reakce štěpu proti hostiteli •Začíná už před vlastní transplantací – ozáření, cytostatika – rozsáhlé poškození buněk příjemce ( játra a slizniční imunitní systém) •Uvolnění značného množství prozánětlivých cytokinů a chemoků (IL-1β, TNF-α, GM-CSF, IFN-γ) •Dlouhodobý důsledek zvýšená exprese HLA I. a II. třídy na buňkách příjemce •Po infuzi štěpu jsou jako první napadány endotelové buňky cévního řečiště •T-lymfocyty ve štěpu rozeznávají tkáňové antigeny příjemce jako cizorodé (aloreaktivita) a reagují proti nim • • • Reakce štěpu proti hostiteli •T-lymfocyty ve štěpu rozeznávají tkáňové antigeny příjemce jako cizorodé (aloreaktivita) a reagují proti nim —Akutní GvH – dochází k poškození jater, kůže a střevní sliznice - co nejbližší gen. příbuzný dárce, odstranění T-lymfocytů a imunosuprese —Chronická GvH – tvorba Th2, aloprotilátek, produkce cytokinů – vede k fibrotizaci tkání • • Reakce štěpu proti leukemickým buňkám (GvL) •Garft – versus - leukemia —T-lymfocyty ve štěpu reagují vůči zbytkovým leukemickým buňkám příjemce —Schodný s akutní GvH • —GvH – nežádoucí reakce —GvL – žádoucí reakce —Řešení - T-lymfocytů ze štěpu + imunosuprese → omezení rizika GvH reakce X riziko návratu onemocnění! → po přihojení kostní dřeně aplikovat malé dávky periferních T-lymfocytů dárce – navození specifické tolerance — • — — T-lymfocyty ve štěpu přenesené společně s kmenovými buňkami rozeznávají tkáňové antigeny příjemce jako cizorodé (aloreaktivita) a reagují proti nim T-lymfocyty ve štěpu přenesené společně s kmenovými buňkami reagují vůči zbytkovým leukemickým buňkám příjemce Specifická tolerance → aplikace kmenových buněk bez T-lymfocytů, a až po přihojení kostní dřeně aplikovat intravenózně malé dávky periferních T-lymfocytů dárce Reakce štěpu proti hostiteli (graft versus host reaction, GvHR) •Makulopapulární exantém • generalizovaná erytrodermie • puchýře, deskvamace • •Zvýšení koncentrace bilirubinu v séru • •Průjem, velké bolesti břicha, ileus Možnosti potlačení transplantačních rejekcí a reakce proti štěpu hostiteli •Výběr dárců geneticky blízkých příjemců •Použití imunosupresivních léků •Procedury odstraňující T-lymfocyty dárce ze štěpu •Purifikace kmenových buněk z periferní krve Už toho mám hodně, stačí!!!! Imunosupresivní léčba •Indikována především u autoimunitních chorob, vaskulitid, a u pacientů po transplantacích. •Vyjimečně používána u těžkých alergických chorob nebo u onemocnění způsobených nadměrnou aktivací T-lymfocytů (psoriáza). •Léčba vždy vede k sekundární imunodeficienci - náchylnosti k infekcím, častější výskyt malignit, zejména lymfatického systému. •Ke snížení výskytu vedlejších reakcí se obvykle používá kombinovaná léčba. Imunusupresiva zasahující do metabolismu IL-2 •Kalcineurinové inhibitory: Blokují funkci Ca 2+-dependentního kalcineurinu, tím blokují aktivaci NFAT. Nedojde k derepresi genu pro IL-2. –Cyklosporin A- vazba na cyklofilin –Tacrolimus (FK 506) vazba na FKBP •Sirolimus (Rapamycin) - blokuje přenos signálu z IL-2, též se váže na FKBP. •NFAT: Nuclear Factor of Activated T cells FKBT: FK- Binding Protein Glukokortikoidy jako imunosupresiva •Imunosupresivně působí především dávky 0,5-1 mg Prednisonu/kg/den, udržovací dávka bývá u dospělých 5-10 mg Prednisonu/den. •Mechanismy účinky: –Snížená produkce cytokinů (IL-1, TNF-a, IL-2) –Snížení exprese adhezivních molekul –Inhibice exprese HLA-II –Inhibice fosfolipázy A2 v granulocytech - blok tvorby metabolitů kyseliny arachidonové. •Vedlejší činky: redistribuce tuku, vznik vředové choroby, steroidní diabetes, hypertenze, poruchy růstu dětí, hypokalémie, osteoporóza, katarakta, psychózy.... REPRODUKČNÍ IMUNOLOGIE REPRODUKČNÍ IMUNOLOGIE se zabývá studiem funkce imunitní soustavy v reprodukčních orgánech. Imunologie / imunopatologie: - mužského (uro)genitálního traktu - ženského genitálního traktu - fertilizace - nidace - těhotenství Imunitní soustava dozrává perinatálně, tehdy je také uzavírána "inventura" vlastních antigenů ALE !! zralé gamety, jejich přídatné tkáně a endokrinně aktivní buňky se objevují až v období puberty jejich orgánově specifické antigenní znaky jsou proto vnímány jako cizí Podmínkou přežití gamet je dobře fungující soubor pasivních a aktivních ochranných mechanismů, specifických pro orgány rozplozovací soustavy (např. hematotestikulární "bariéra"). Speciální ochranu vyžaduje také semialogenní plod, rostoucí v děloze matky. Imunitní soustava v rozplozovacích orgánech má tudíž dvě protichůdné povinnosti: - chránit vnitřní stálost - umožnit existenci "cizorodých" gamet a semialogenního plodu -specializovaná buněčná bariéra mezi krví a vyvíjejícími se spermiogenními buňkami v semenotvorných kanálcích varlat -tvořena pevnými spojeními v oblasti baze Sertoliho buněk. -chrání zárodečné buňky před toxickými látkami obsaženými v krvi a zároveň vytváří imunologickou bariéru - diferenciace spermatogonií začíná až v období puberty - organismus vytvořeny imunokompetentní buňky, které by mohly nově vzniklé spermie identifikovat jako "cizí„ - brání kontaktu imunitního systému s diferencujícími se spermiemi a zabraňuje tak autoimunitní odpovědi Hematotestikulární bariera Imunita v reprodukčním traktu muže Co a jak musí vyřešit: a) ochránit před infekcí, vadnými buňkami atd. Obranné mechanismy slizniční imunity, t.j. makrofágy / fagocyty, NK a LAK (lymfokiny aktivované NK buňky), specifické mechanismy humorální a buněčné imunity. b) umožnit dozrání relativně „cizorodých“ spermií, aniž by byly napadeny vlastní imunitní reakcí. Mechanismy zabezpečující imunologickou toleranci k spermiím: pasivní ochrana – nízká antigenicita spermií a jejich prekurzorů převaha tlumivých buněk (Th2) Patologická imunitní reakce proti mužským gonádám •získané poruch imunity v urogenitálním traktu, typicky záněty, poruchy prokrvení, ale i punkce a biopsie varlat, anální sex u bisexuálů, ale někdy ji vyvolá i vrozená porucha imunity •Způsobuje –poškození spermií během jejich vývoje, zejména kvůli buňkami zprostředkované imunitě, dále například blokádu spermií protilátkami Imunologie reprodukce – negativní mechanismy - muži •Přítomnost protilátek proti spermiím •Důvody vzniku – narušená hematotestikulární bariera z důvodů poranění, po vasektomii, chronické infekce urogenitálního traktu, častější u homosexuálních mužů •V ejakulátu se pak nacházejí Ig třídy IgG a IgA •Ve spermatu infertilních mužů často zvýšený počet leukocytů - vznik reaktivních kyslíkových radikálů – perforace cytoplazmatické membrány spermií – zabránění fúze s plazmatickou membránou vajíčka Imunita v reprodukčním traktu zdravé ženy Co a jak musí vyřešit: a) ochránit před infekcí, vadnými buňkami atd. Obranné mechanismy slizniční imunity, t.j. fagocyty, NK a LAK buňky, specifické mechanismy humorální a buněčné imunity. b) umožnit dozrání relativně „cizorodých“ vajíček a přídavných tkání pasivní ochrana – nízká antigenicita povrchu zona pelucida a buněk cumulus oophorus převaha tlumivých buněk (Th2) ve stromatu ovaria, folikulární tekutině a tubách Imunita v reprodukčním traktu zdravé ženy Co a jak musí vyřešit: a) ochránit před infekcí, vadnými buňkami atd. Obranné mechanismy slizniční imunity, t.j. fagocyty, NK a LAK buňky, specifické mechanismy humorální a buněčné imunity. b) umožnit dozrání relativně „cizorodých“ vajíček a přídavných tkání pasivní ochrana – nízká antigenicita povrchu zona pelucida a buněk cumulus oophorus převaha tlumivých buněk (Th2) ve stromatu ovaria, folikulární tekutině a tubách Zona pelucida •glykoproetinový obal vajíčka savců – produkován samotným vajíčkem v průběhu oogeneze •Funkce: –selekce spermií ( nepoškozené spermie) –Zabránění polyspermie – vajíčko je oplozeno více než jednou spermií Cumulus Oophorus •Obal z folikulárních buněk vaječníkového folikulu v závěrečném stádiu před ovulací •Koordinuje dozrávání vajíčka, zvyšuje fertilizaci • Imunologické bariéry reprodukčních orgánů ženy •Nejsilnější ochrana v děložním krčku •Zde působí makrofágy – možnost ovlivnění spermií •Imunita v urogenitálním traktu je tlumena cytokiny - TGF –β •Imunita je ovlivněna mikroflórou, věkem údobím menstruačního cyklu, těhotenstvím a přítomností infekce Imunologické bariéry reprodukčních orgánů ženy •Přirozenou složkou mikroflóry – Gram-pozitivní tyčky z rodu Lactobacillus – k osídelní dochází v pubertě (108 organismů/gram vaginální tekutiny) •Nízké pH •Tvorba peroxidu vodíku- laktobacily c) ochránit spermie v době ovulace před napadením imunitním systémem ženy pasivní ochrana – potlačení imunogenních HLA znaků na povrchu spermií aktivní mechanismy – zejm. změny v imunologických vlastnostech cervikálního hlenu v době ovulace ze strany muže – přítomnost imunosupresivních faktorů v seminální plazmě d) tolerovat „semialogenní“ plod imunologie nidace a těhotenství Imunologie reprodukce – negativní mechanismy - ženy •zvýšená přítomnost protilátek proti spermiím u chronických infekcí •Pohyb spermií je ovlivněn navázáním protilátek – navázání IgG nebo IgA na bičík neovlivňuje schopnost pronikat hlenem děložního hrdla •navázáním protilátek zejména třídy IgA nebo kombinace IgGa IgA na hlavičku spermie – výrazně omezuje pohyb •IgG možnost aktivace komplementu x spermie mají na svém povrchu CD46 – brání aktivaci komplementového systému Reprodukční soubor laboratorních vyšetření •1. protilátky proti fosfolipidům •2. protilátky proti spermiím •3. protilátky proti zona pellucida •4. protilátky proti ovariím •5. protilátky proti annexinu V •6. protilátky proti tkáňové transglutamináze •7. antinukleární protilátky •8. [protilátky proti thyreoperoxidáze] •9. počet cirkulujících NK (natural killers) buněk •10.intracelulární produkce cytokinů Protilátky proti spermiím – cílové antigeny •protilátky proti spermiím – cílové antigeny •specifické proteiny spermií • • heat shock proteiny (HSP70, HSP70-2) • • disulfid izomeráza (ER60), kaspáza 3 • • podjednotky proteasomu - komponenta C2 a zeta-řetězec •• metoda stanovení – ELISA • v séru, v seminální plazmě, v ovulačním hlenu, v peritoneální a folikulární tekutině Protilátky proti ovariím •• vyskytují se až u 2/3 žen s diagnózou predčasného ovariálního selhání •• cílové antigeny: specifické ovariální proteiny derivované z ooplasmy oocytu, buněk theca granulosa a corpus luteum •• metody stanovení: nepřímá imunofluorescence (řezy opičích ovarií), •ELISA (aktinin-4, heat shock 70 protein 5, cytoplazmatický aktin) Protilátky proti zona pellucida •cílový antigen: proteiny extracelulární matrix oocytu, které mají významnou úlohu pri folikulogenezi a fertilizaci •• nemožnost průniku spermie do oocytu jak pri pokusech o fyziologickou koncepci, tak i při technikách IVF •• Metody stanovení: nepřímá imunofluorescence, ELISA Protilátky proti zona pellucida https://pryorwild.files.wordpress.com/2010/01/01132010pzpantibodies.jpg https://pryorwild.files.wordpress.com/2010/01/01132010antibodiesonegg.jpg?w=470&h=354 Protilátky proti annexinu V •ANNEXIN V - placentární antikoagulační faktor vysoká exprese na buňkách tvořící se placenty •Význam: interference s implantací embrya - • ovlivnění placentace v průběhu invaze • trofoblastu •Indikace: spontánní potraty zejm. v 1. trimestru •Metody stanovení: ELISA • Protilátky proti tkáňové transglutamináze •Celiakie – gluten-senzitivní enteropatie •• „silent“ forma bez GI příznaků •• jediná a účinná terapie – bezlepková dieta •• porucha plodnosti při celiakii – malabsorpce? • jiné mechanizmy? • NK buňky (natural killers, přirození zabíječi) •NK buňky jsou významně zastoupeny v děložní • sliznici, kde v průběhu implantace embrya plní řadu fyziologických funkcí. •• U žen s primární idiopatickou sterilitou a u • habituálního potrácení bylo zjištěno zvýšené • zastoupení NK buněk v periferní krvi •Dysregulace NK aktivity s patologickým vlivem NK • cytotoxicity na spermie a/nebo buňky trofoblastu Imunologie těhotenství Oplozené vejce, pak embryo a další přídatné tkáně představují pro matku cizorodý, "semialogenní" štěp. Imunologie těhotenství Oplozené vejce, pak embryo a další přídatné tkáně představují pro matku cizorodý, "semialogenní" štěp. Imunitní buňky v urogenitálním traktu ženy •Slizniční výstelka dělohy – přeměna v deciduální tkáň – vstup a vývoj lymfocytů – 70% je tvořeno populací CD56+NK buněk, malá frakce T-lymfocytů – typu Th2 •Převaha Nk buněk v první polovině těhotenství • Embryonální ochranné mechanismy • •pasivní: velmi nízká exprese klasických HLA znaků A,B,C na buňkách cytotrofoblastu • (chybějí antigeny HLA-DR a DQ, které jsou nutné pro aktivaci imunitní odpovědi) • •aktivní: produkce nespecifických tlumivých působků (alfa-fetoprotein, hCG) a indukce Th2 buněk v mateřské deciduální tkáni • •Klíčovou funkci má produkt embryonálního HLA-G genu – HLA-G je ligandem pro inhibiční receptory NK buněk • Mateřské ochranné mechanismy •jsou spouštěny embryonálními faktory (produkty HLA-G, hCG, AFP) • snížení koncentrace "toxických" Tc lymfocytů v periimplantační zóně i v oběhu • převaha Th 2 nad Th1, CD8 nad CD4 • •deciduální makrofágy a monocyty mají sníženou fagocytární schopnost, navíc produkují embryoprotektivní faktory •snižuje se produkce IL-2 i exprese rIL-2 na lymfocytech v periimplantační zóně i v oběhu • Transplacentární přenos faktorů imunity • •v 3. trimestru se dostává z plodu do mateřského oběhu cca • 200 000 buněk denně - zejména buňky trofoblastu • • do oběhu plodu pronikají transplacentárně • •mateřské lymfocyty („mikrochimerismus“) • • imunoglobuliny (IgG) (úloha FcRn) • Význam kojení •Hlavním imunoglobulinem v mateřském mléku je sekreční IgA: neutralizuje viry, je baktericidní, agreguje antigeny, brání adherenci bakterií na povrch epitelových buněk •buňky v mateřském mléku : • fagocyty, především makrofágy • lymfocyty, především CD4 •Hlavním zdrojem je kolostrum • hladiny_imunoglobulinu_novorozence Hladiny imunoglobulinů v séru před a po narození