Imunoanalýza ELISA Mgr. Julie Štíchová Fakultní nemocnice u Sv. Anny v Brně Ústav klinické imunologie a alergologie Imunoanalytické metody Rozdělení metod dle typu značky: oEIA – značkou je enzym oRIA - radioizotop oLIA - luminofor oFIA - fluorofor Rozdělení metod dle uspořádání: oHomogenní – bez promývání oHeterogenní – s promýváním oKompetitivní oNekompetitivní Vizualizace reakce antigen-protilátka pomocí značky Imunoanalytické metody Heterogenní kompetitivní: oAnalyt ze vzorku + značený analyt od výrobce – soutěž o omezené množství antigenu oMěřený signál je nepřímo úměrný množství analytu Heterogenní nekompetitivní: oDetekční protilátka / antigen v nadbytku –analyt ze vzorku vyvázán oMěřený signál je přímo úměrný množství analytu ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay oHeterogenní imunoanalýza – nutná separace nezreagovaných složek pomocí promývání o Zahrnuje jednotlivé kroky o Vazba antigenu / protilátky na pevnou fázi (stěna destičky) o Na navázaný Ag se váže zkoumaná protilátka z přidaného séra o Na navázaný komplex se váže sekundární protilátka s konjugovaným enzymem o Pro vizualizaci se do reakce přidá substrát pro daný enzym - enzymatická přeměna substrátu na barevný produkt – měření na spektrofotometru o Používané enzymy: o Křenová peroxidáza (tetrametylbenzidin → tetrametylbenzimidin → 450 nm) o Alkalická fosfatáza (p-nitrofenylfosfát → nitrofenol → 405 nm) o Mezi výše uvedenými jednotlivými kroky je vždy tzv. promýváním, při kterém se nadbytek reaktantu odstraní přídavkem pufru do jamky, který je pak také z jamky odstraněn – separace nezreagovaných složek oVysoká citlivost – pg/ml Kautování ELISA desky oImobilizace Ag nebo Ab na plastový povrch desky 1. Povrchová aktivace desky ◦ vazba NH2 nebo COOH skupin – tvorba kovalentních vazeb s protilátkou nebo antigenem ◦ Vhodné pro stanovení malých molekul – např. peptidy 2. Pasivní adsorpce ◦ Hydrofobní interakce mezi nepolárními strukturami proteinu a plastovým povrchem desky ◦ Protein určený k adsorpci je rozpuštěn v alkalickém kautovacím pufru (pH 9,5) – naleptává plastový povrch a usnadňuje adsorpci Ag nebo Ab o Blokování desky o Po navázání Ab/Ag zůstává část plastového povrchu volná. Aby bylo zabráněno nespecifickým vazbám, je nutno tato místa zablokovat inertní bílkovinou BSA – bovinní sérový albumin Vlastní průběh ELISY Za každým krokem následuje tzv. promývací krok, kde se obsah jamky odsaje, do jamky se přidá nejčastěji fosfátový pufr a následně se obsah jamky odsaje. Toto promytí se opakuje zpravidla 3x za sebou, aby byl odstraněn veškerý nezreagovaný materiál. Systém záchytná + detekční Ab oDetekční (sekundární) protilátka proti hledanému Ag je konjugovaná s enzymem, oProč je každá protilátka od jiného živočišného druhu? Záchytná protilátka myší, polyklonální Detekční protilátka humánní, monoklonální Lidská monoklonální protilátka – s vysokou specifitou váže pouze konkrétní antigen Záchytná protilátka – s vysokou senzitivitou váže všechny varianty daného antigenu Tato kombinace významně snižuje riziko zkřížené reaktivity, která by mohla způsobit vznik nespecifických imunokomplexů (zdroj falešné pozitivity)!!! Vyšetřovaný Ag v séru Enzymatická detekce – přidání substrátu Nejčastěji používané enzymy detekčních nebo-li sekundárních protilátek: ◦ Křenová peroxidáza ◦ Alkalická fosfatáza Pro křenovou peroxidázu jsou používány tyto substráty: • 3, 3´, 5, 5´-tetramethylbenzidin • 2, 2´-azinobis(3-ethylbenzthiazol-6sulfonát) • o-fenylendiamin • o-dianisidin • o-toulidin Pro alkalickou fosfatázu se používá substrát • 4-nitrofenylfosfát Luminscenční Immunoassay • Chemiluminscenční substráty – detekce záblesků luminiscence • SuperSignal • ECL Sendvičová ELISA - uspořádání oDetekce analytů s vysokou Mr (proteiny) oVysoká přesnost http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/support/method/elisa.html oPoužití dvou protilátek specifických na různé epitopy jednoho antigenu. oJedna z protilátek je navázána na povrch jamky destičky a vychytává antigen ze vzorku. oDruhá protilátka značená enzymem slouží k detekci tohoto antigenu. oAntigen je tedy mezi protilátkami jako plátek masa mezi houskami v sendviči. Kompetitivní ELISA - uspořádání oDetekce analytů s malou Mr http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/support/method/elisa.html o Na rozdíl od nekompetitivní ELISY se navíc přidává enzymem značený Ag. o Přidaný enzymem značený antigen kompetuje – soutěží - s hledaným Ag v séru o vazebné místo zkoumaného Ag. o Čím více je zkoumaného Ag v séru, tím méně se naváže enzymem značeného Ag a tím nižší je pak měřená absorbce. Sendvičová ELISA –vyšší senzitivita oSystém biotin – avidin/streptavidin – na jeden imunokomplex se váže více molekul enzymu oPo přídavku substrátu vzniká silnější zbarvení (pro analyty s nízkou koncentrací) Měření výsledků oPřístroj ELISA reader oPrincip – vertikální spektrofotometrie oZdroj světla – Xe výbojka oVýběr vlnové délky – interferenční filtry oOptická dráha – 9 optických vláken (8 měří vzorky, 9. vlákno kontrola intenzity záření) o9 detektorů - fotodiody Výsledky 1. Kvalitativní ◦ Hodnotíme vizuálně přítomnost / nepřítomnost reakce → ano / ne – výsledek je pak pozitivní či negativní, použití cut-off kalibrátoru, hodnoty s absorbancí nad tuto hodnotu jsou hodnoceny jako pozitivní 2. Semi-kvantitativní ◦ IP (index pozitivity) = absorbance vzorku / absorbance cut-off kalibrátoru 3. Kvantitativní ◦ Kalibrační křivka – ředění kalibrátoru o známé koncentraci analytu ◦ Výsledek (absorbance = OD, optická denzita) se odečítá z kalibrační křivky ◦ Přepočet absorbance na koncentraci (Lambert-Beerův zákon) ◦ Výsledek má číselnou hodnotu s udanými jednotkami (např. U/ml, ug/ml) Hodnocení výsledků - kvantitativní Kalibrační řada Blank Negativní kontrola Pozitivní kontrola Vzorky pacientů Využití ELISA v imunologii oV imunologii jsou nejčastěji hledaným antigenem protilátky → deska je pak kautovaná Ag, na který se protilátky váží oAntiinfekční imunita oStanovení protilátek proti některým infekčním agens oAutoimunitní onemocnění oStanovení autoprotilátek ELISA a antiinfekční imunita oProtilátky proti tetanickému toxoidu oProtilátky proti difterickému anatoxinu oProtilátky proti kapsul. antigenu Haemophilus Influenzae oProtilátky proti specifickému pneumokokovému kapsulárnímu polysacharidu (anti-PCP) Sledování odpovědi na vakcinaci, sledování stavu imunitního systému (zájem především o snížené hladiny – imunodeficience) ELISA stanovení autoprotilátek´u autoimunitních onemocnění oCelá škála autoprotilátek (orgánově nespecifické, orgánově specifické) o ANA – proti jaderným antigenům (anti-nuclear antibody; Systémový lupus erythematodus - SLE) o ENA – proti extrahovatelným nukleárním antigenům (SS-A, SS-B, Jo1 atd. – Sjogrenův sy.) o AMA – proti mitochondriím (primární biliární cirhóza) o ASMA, LKM, LC - autoimunitní hepatitidy o ASMA - proti hladkým svalům (anti – smooth muscle antibodies) o LKM - proti mikrosomům jater a ledvin (LKM – liver kidney microsomes autoantibodies) o LC - proti antigenu jaterního cytosolu typu 1 o ANCA – proti cytoplazmě neutrofilů (vaskulitid a glomerulonefritidy) o Anti-TTG –proti tkáňové transglutamináza (celiakie) o Anti-TG-tyreoglobulin, anti-TPO-tyreoidální peroxidáza (tyreoitidy) o RF – proti Fc molekule IgG (revmatoidní artritida) o EMA –proti endomysiu (celiakie) o ASCA – proti Sacharomyces cerevisiae (Crohnova choroba) Hodnocení výsledků oV klinické laboratoři existuje určitá hierarchie hodnocení výsledků oPodílí se na něm laborant i VŠ oVždy se hodnotí zároveň papírový výsledek s ELISA deskou 1. fáze kontroly – zdravotní laborant o Vizuální kontrola desky –zbarvení o Vizuálně hodnotí, zda se naměřená absorbance (barva jamek) shoduje s výsledky na papíře (pozitivní pacienti – shodují se souřadnice jamek na desce se souřadnicemi v tištěných výsledcích?) ◦ ANO – kontrola pokračuje do další fáze ◦ NE – hledáme příčinu (záměna desky) Hodnocení výsledků - kvantitativní Kalibrační řada Blank Negativní kontrola Pozitivní kontrola Vzorky pacientů Hodnocení výsledků 2. fáze kontroly – VŠ pracovník oVizuální kontrola desky o Není zbarvení celé desky moc tmavé nebo světlé? – uměle zvýšené či snížené naměřené hodnoty vzhledem ke kalibrační křivce o Není v některých jamkách sraženina / nečistota – uměle pozitivní výsledky? oHodnocení s tištěnými výsledky – kontrola kalibrace: o Kontrola průběhu kalibrační křivky o Kontrola jednotlivých bodů – není některý výrazně mimo? o Pozitivní kontrola – leží v rozmezí, které udává výrobce? o Pozitivní vzorek pacienta – souhlasí poloha na desce s papírovým výsledkem? Ideální reálná kalibrační křivka – zploštění u nízkých koncentrací a vysokých koncentrací – koncentrace zkoumaného analytu v séru by měla ležet ve vyznačené přímkovém úseku Hodnocení výsledků oPokud nevyšly kontroly, musí se hledat příčina: o Máme tu správnou desku? Na jakém programu byla změřena? Jaká je šarže kontrol (mohlo nedávno dojít ke změně) oPokud pozitivní kontrola vyšla příliš vysoká/nízká: o Všímáme si rozsahu kalibrace – měla by být co nejširší – od velmi nízkých hodnot absorbance až po vysokou o Zjišťujeme, jak vypadala předchozí měřená kalibrace u minulého zpracování testu o Kontrola pozitivních pacientů se záznamy v LISu (pokud již pacient byl dříve vyšetřen a aktuálně změřený výsledek se shoduje s jeho historií, je pravděpodobně špatně pouze kontrola): o Možná chyba ředění laborantky o Kontrola lahvičky – set, šarže Hodnocení výsledků oVýsledky měření kontrol se dlouhodobě zaznamenávají v čase – interní kontrola kvality o Levey-Jenningsův diagram → Westgardova pravidla o Varovné a regulační meze Stoupající nebo klesající trend může například značit expiraci setu, „zahušťování“ pozitivní kontroly, vadu spektrofotometru…. Hodnocení výsledků oPokud nevyjde kalibrace a kontroly – nutno vyšetření opakovat oPokud je vše v pořádku – VŠ výsledek ELISY podepíše (přebírá za ně odpovědnost) 3. Fáze kontroly o Přepis výsledků ELISA do pracovního listu o Přepisování výsledků z pracovního listu do systému (POZOR na překlepy) 4. Fáze kontroly - VŠ o Ve chvíli, kdy má pacient všechna požadovaná vyšetření hotová, provádí se validace výsledků o VŠ v počítači kontroluje, zda výsledky dávají logický smysl o Seznam výsledků, které je nutno okamžitě hlásit lékaři abnomální hodnoty– VŠ mu vysvětluje, co to znamená – možnost ovlivnění léčby pacienta o Uvolnění výsledků – tzn. propuštění výsledků počítačovým systémem pro tisk Hodnocení výsledků 5. Fáze kontroly – VŠ oZvalidované a uvolněné výsledky pacienta se tisknou v papírové podobě oExpedice výsledků – VŠ, který výsledky uvolnil opět kontroluje tyto výsledky pacienta v papírové podobě → o Není ve výsledcích něco podezřelého? o Nezapomnělo se na žádné vyšetření? oPo expedici výsledků do nich může přes počítačový systém nahlédnou ošetřující lékař dané nemocnice - před tímto krokem mohou výsledky“ vidět pouze pracovníci laboratoře oTištěné výsledky opouštějí pracoviště a putují k ošetřujícímu lékaři Hodnocení výsledků oVŠ svým podpisem odpovídá za výsledky! oO každé fázi zpracování vzorků a kontrol musí existovat záznam – kdo, kdy oRazítka, podpisy oV PC – laboratorní pracovník zapisuje pod svým jménem oVŠ také ovlivňuje laboratorní pracovníky – měl by si všímat nálady na pracovišti, motivovat lidi, aby se nebáli přiznat chybu oJde o zdraví lidí, zatajování chyb nepřichází v úvahu Příklad ELISA ACLA - kvantitativně ◦ Výsledky ELISY z readru ◦ Metoda ACLA - protilátky proti kardiolipidům při vyšetření antifosolipidového syndromu ◦ Výtisk obsahuje: ◦ hodnoty absorbance ◦ musí být uvedeno datum provedení testu ◦ musí být uvedeno, kdo test hodnotil – jméno VŠ ◦ musí být uveden název testu ◦ musí být uvedeno, kdo daný test zpracovával = jméno laborantky ◦ Kalibrační křivka Kalibrace Pozitivní k. Negativní k. Výsledky pacientských vzorků Příklad ELISA ACLA – kvantitativně, pokračování Výsledek z readeru dále obsahuje: •Naměřené hodnoty absorbancí jednotlivých vzorků, kalibrací a kontrol •Přiřazené hodnoty koncentrací •Označení jednotlivých jamek •Záznam mezí koncentrací ve kterých by se měla pohybovat pozitivní kontrola Sloupec 1 Hodnoty absorbance Sloupec 2 Hodnoty koncentrací Výsledky kontrol Hodnoty kalibrace Označení jednotlivých jamek Příklad ELISAACLA – kvantitativně, pokračování Na záznam z ELISA readeru navazuje výsledková listina, kde musí být uvedeno: Název testu Datum provedení Kdo zpracoval – jméno laborantky Souřadnice kalibrátorů, kontrol a vzorků pacientů Např. Sérum pacienta č.9 bylo v jamce A9 a zjištění koncentrace ACLA protilátek byla 6 APL/ml Příklad ELISAACLA– kvantitativně, pokračování Na záznam z ELISA readeru navazuje výsledková listina, kde musí být uvedeno: Kde byl výsledek zpracován Kdo hodnotil Údaje o použité ELISA kitu Vyhodnocení koncentrací pro jednotlivé pacienty Příklad č. 2 LKM autoprotilátky proti mikrozomům jater a ledvin Semikvantitativní hodnocení – index pozitivity Výsledky ELISY z readeru ◦ Metoda LKM - autoprotilátky proti mikrozomům jater a ledvin při vyšetření autoimunitních hepatitid ◦ Výtisk obsahuje: ◦ Název metody ◦ Jméno laborantky, která metodu zpracovala ◦ Jméno VŠ pracovníka, který hodnotil výsledky ◦ Naměřená surová data (absorbance) kontrol, kalibrátorů a vzorků pacientů ◦ Vypočtené indexy pozitivity na základě poměru absorbací vzorků a kalibrátoru Cut-off kalibrátory Pozitivní k. Negativní k. Výsledky pacientských vzorků Příklad č. 2 LKM autoprotilátky proti mikrozomům jater a ledvin Semikvantitativní hodnocení – index pozitivity Na záznam z ELISA readeru navazuje výsledková listina, kde musí být uvedeno: oKde byl výsledek zpracován oKdo hodnotil oÚdaje o použité ELISA kitu oSouřadnice kontrol a kalibrátorů oVyhodnocení koncentrací pro jednotlivé pacienty Systém vyšetření autoprotilátek oELISA kity velice drahé – cca 10 tisíc oNapř. stanovení ENA – obsáhlá skupina autoprotilátek proti extrahovatelným nukleárním antigenům oVyšetření probíhá ve dvou fázích: 1. ELISA screening ENA: je pacient pozitivní na ENA? → ANO / NE 2. Pokud ANO – teprve se nasazuje na ELISU, která určí podtyp ENA (SS-A, SS-B, Jo1, Scl- 70, SM, …) Imunoblot oSlouží k diagnostice autoprotilátek oPříprava blotů (výrobce): o Proteiny elektroforeticky rozděleny v gelu – přenos (otisk) na nitrocelulózovou membránu (bloting) o Membrána je rozstříhána na jednotlivé diagnostické proužky o každý protein má na proužku definovanou poloh o Při vazbě konkrétní autoprotilátky ze séra se vytvoří band, který má charakteristickou polohu o Odečítá se podle přiložené šablony Imunoblot oPrincip stanovení: o Pokud je autoprotilátka proti určitému proteinu přítomna v séru, naváže se na tento protein imobilizovaný na stripu, dochází k imunoprecipitaci o Detekce vazby autoprotilátky pomocí detekčních protilátek značených enzymem o Po přídavku substrátu jej enzym přemění na barevný produkt – podobné s ELSOU o Výsledkem je vznik barevného proužku na stripu Imunoblot oJednotlivé barevné proužky se porovnávají s kontrolní šablonou oOdečet vizuálně nebo denzitometricky (% pozitivity) oImunoblotem se vyšetřují pacienti, u kterých nebyly detekovány imunofluorescenčně či ELISOU autoprotilátky při přetrvávajících klinických příznacích o Poznámka: Ag jsou poutány na desku – při ELISA a při blotech, či na tkáni – při imunofluorscenčním stanovení jinými metodami, možnost konformačních změn proteinů – znemožnění vazby x umožnění vazby některých typů protilátek oDiagnostika – například roztroušená skleróza imunoglobuliny - lze zachytit pouze hrubé změny: hypergamaglobulinémii, hypogamaglobulinemii či monoklonální gamapatie Elektroforéza sérové proteiny mohou být elektroforeticky separovány Elektroforetické frakce obsahují tyto plazmatické proteiny Elektroforetické frakce obsahují tyto plazmatické proteiny Použití elektroforézy v klinické praxi – čtení elektroforetogramů Normální sérum Hypogamaglobulinemie Hypergamaglobulinemie Albumin α-globuliny β-globuliny γ-globuliny Obrázek převzat z http://www.sebia-usa.com/products/reagents.html Elektroforéza Příklady elektroforetického rozdělení řady pacientských sér Ohraničený band v γ- či αglobulinové oblasti = pacienti k dovyšetření imunofixací Imunofixace oDiagnostika monoklonálních gamapatií (stanovení paraproteinu v séru a moči) o Podezření na monoklonální gamapatie – zvýšená celková bílkovina > 90 g/l) o Monoklonální gamapatie neznámého významu - MGUS (monitoring – řada pacientů po čase přechází do mnohočetného myelomu, makroglobulinémie či primární amyloidózu) o Maligní monoklonální gamapatie – mnohočetný myelom, plazmocytom o Maligní lymfoproliferativní onemocnění o Waldenstromova makroglobulinemie o Maligní lymfomy o Chronická lymfatická leukemie o Nemoc těžkých řetězců o Primární AL amyloidóza Imunofixace Princip: oProteiny (sérum pacienta) rozdělné alkalickou elektroforézou jsou inkubovány se specifickými antiséry (anti IgG, IgA, IgM, řetězce kappa a lambda): oV případě pozitivní reakce vzniká precipitát, který zůstává v gelu imobilizován oOstatní proteiny jsou vymyty oPrecipitáty jsou obarveny kyselou violetí nebo amidočerní oHodnocení – vizuální Imunofixace Referenční stopa – veškeré proteiny fixovány fixačním roztokem Zbývajících 5 drah – na každou naneseno jiné specifické antisérum Imunofixační proužky jsou porovnávány s odpovídajícími frakcemi referenčního vzorku – proužek by měl mít stejnou migrační pozici Imunofixace - zpracování Na agarózový gel se na pozici start nanesou pomocí šablony séra pacientů Šablona = umělohmotný proužek s vyřezanými tvory který se přiloží na vyznačené místo na gelu pro start Start – místo přiložení šablony Agarózový gel před elektroforetickým rozdělením Agarózový gel po elektroforetickém rozdělení Na agarózový gel se po elektroforetickém rozdělení vzorků séra se přiloží maska - umělohmotná fólie s vyřezanými otvory tak, aby se na jednotlivé linie dalo aplikovat příslušné antisérum Vyřezaný otvor Maska Při inkubaci s monospecifickými antiséry dochází k jejich vazbě na příslušné molekuly imunoglobulinů a dochází k precipitaci Po uplynutí inkubační doby se celý gel zahřeje na 60°C, čímž dojde k denaturaci vzniklých precipitátů a jejich přilnutí k podkladové membráně gelu. Pokud vyšetřované sérum nebo moč pacienta obsahují zmnožený jeden klon imunoglobulinů nebo jen jejich část – κ nebo λ řetězce - vytvoří se ohraničený proužek tzv. band (paraprotein) Pro vyhodnocení se provádí barvení imunofixovaných vzorků a poté jejich vyhodnocení. Při vyhodnocování platí pravidlo, že band –paraprotein- v původním elektroforetickém rozdělení musí mít ve všech pruzích stejnou polohu ve vzdálenosti od startu. Stejná poloha paraprotienu vzhledem ke startu Imunofixace - určování typu paraproteinu (monoklonálního Ig) Pozn. 75 – 80% nemocných mnohočetným myelomem má v moči přítomny monoklonální lehké řetězce (Bence-Jonesova bílkovina/paraprotein). BJB poškozuje buňky proximálních tubulů ledvin. MGUS monoklonální gamapatie nejasného původu Imunoelektroforéza oKombinace elektroforézy s imunodifuzí: oKrok 1: elektroforetické rozdělení séra oKrok 2: Podél migrační dráhy se vyřízne žlábek – aplikace polyvalentního antiséra o Antisérum difunduje do gelu – v zóně ekvivalence s antigenem (protein séra) vytvoří obloukovitou precipitační linii o Při použití polyspecifického antiséra – až 35 precipitačních obloučků – mají charakteristický tvar a polohu (1 oblouček = 1 protein) Imunoelektroforéza Imunoelektroforéza oDiagnostika monoklonálních gamapatií oHodnocení je kvalitativní oDnes spíše zastaralá metoda – nahrazena imunofixací Raketová imunoelektroforéza oUmožňuje kvantitativní stanovení proteinů (od 0,1 mg/l) oGel obsahuje monospecifické antisérum oProteiny séra elektroforeticky děleny (alkalické pH – anodická pohyblivost) oPři průchodu gelem vytváří cílový protein s monospecifickým antisérem precipitát v zóně ekvivalence →má tvar raketky oS1-S4 – standardy o různé koncentraci oV – vzorek pacienta oKvantitativní odečet z kalibrační křivky