Vyšetření funkce fagocytů Mgr. Julie Štíchová Výkonné buňky nespecifické imunity Profesionální fagocyty  Neutrofilní granulocyty  Tvoří 50 – 70 % z WBC  Nízká fagocytární kapacita – „mikrofágy“  Krátká životnost  Monocyty  2-12 % z WBC  Z cirkulace přecházejí do tkání kde diferencují v makrofágy  Dlouhá životnost  Vyšší fagocytární kapacita První obranná linie  Poranění tkání  aktivace makrofágů  Produkce prozánětlivých cytokinů a chemokinů  Rozvoj zánětu, lákání neutrofilů do místa infekce Průnik do místa infekce 1. ADHEZE  Endotelie – vlivem prozánětlivých cytokinů exprese adhezivních molekul  Průběh ve 2 fázích:  Fáze 1: E a P selektiny - reverzibilní vazba granulocytů – rolling  Fáze 2: Pokud během rollingu přetrvává zánětlivý signál, následuje ireverzibilní vazba na endoteliální stěnu – LFA na povrchu neutrofilu se váže na endoteliální integriny – VCAM, ICAM Průnik do místa infekce 2. Extravazace, diapedéza  Prostup skrze endotelie  PECAM, JAM, CD99  Paracelulární - hlavní  Transcelulární Průnik do místa infekce 4. Chemotaxe  V místě zánětu tvořeny látky s chemotaktickými účinky  Exogenní – fMLP  Endogenní – C3a, C5a, IL-8, CXCL8, CXCL-7  Vazba na chemokinové receptory neutrofilního granulocytu  Receptory řízený pohyb ve směru koncentračního gradientu  Produkce hydrolytických enzymů  narušení mezibuněčné hmoty  prostup do místa zánětu pomocí reverzibilních interakcí adhezivních molekul Rozpoznání patogenní částice  Pattern recognition receptors (PRR)- rozpoznávají PAMPs (103 struktur)  TLR, NOD-like, NLR, RIG-like receptory  Vazba patogenní částice na receptory zahájí vlastní proces fagocytózy:  Tvorba pseudopodií  Ingesce  fagosom  Digesce -splynutí fagosomu s lysozomy – konečná degradace  Mechanismy zabíjení na kyslíku nezávislé  Mechanismy zabíjení na kyslíku závislé Mechanismy zabíjení na O2 nezávislé  Antimikrobiální peptidy a enzymy  Kathepsiny  Lysozym  Defenziny  Kyselé pH  Proteiny omezující dostupnost stopových prvků a vitaminů  Laktoferin – vyvazuje železo  Vitamin B12 binding protein Mechanismy zabíjení na O2 závislé  Enzymatická tvorba reaktivních kyslíkových mediátorů  Doprovázená výraznou spotřebou kyslíku – oxidační vzplanutí  Ústřední role – NADP oxidáza NADPH oxidáza  Intracelulární lokalizace - membrány  6 podjednotek (2 v membráně fagolysosomů, 4 v cytosolu)  Aktivace – signální kaskáda spuštěná receptory  následuje fosforylace podjednotek  jejich spojením se stává NADPH oxidáza aktivní NADPH oxidáza Myeloperoxidáza  Oxidoreduktáza  Obsahuje hemovou skupinu – nazelenalé zbarvení  Přeměna peroxidu vodíku na kyselinu chlornou, která je až 50 krát účinnější  Kyselina chlorná může být substrátem dalších reakcí, při kterých vzniká hydroxylový radikál a signletový kyslík – lipoperoxidace membrán  smrt fagocytující buňky iNOS inducibilní syntáza oxidu dusnatého  Azurofilní granula neutrofilů, monocytů  Tvorba NO z aminokyseliny argininu – podíl na degradaci patogenů  Regulace – NO (oxid dusnatý) redukuje aktivitu MPO Závěrečná fáze fagocytózy  Vyloučení degradovaných částí patogenů exocytózou  Neutrofily brzy podléhají poškození a umírají  Ve tkáních jsou fagocytovány makrofágy  Nahromadění zbytků mikroorganismů a fagocytů – hnis (nazelenalé zbarvení způsobuje MPO) Fagocytózou to někdy nekončí  Jak se fagocyty podílejí na eliminaci patogenů, které nemohou být díky své velikosti nebo agresivitě zfagocytovány? Pseudomycelia Candida albicans Staphylococcus aureus NETóza NET = neutrophil extracellular trap (neutrofilní extracelulární síť)  Nový typ buněčné smrti  Reaktivní kyslíkové mediátory tvořené NADPH oxidázou jsou druhými posly v signální dráze k započetí NETózy  Dochází k citrulinaci histonů, rozvolnění jaderného chromatinu a jeho vypuzení do extracelulárního prostoru NETóza – 2 typy Nelytická forma NETózy – jádro neutrofilu je z buňky vypuzeno velmi rychle, síť se formuje až v extracelulárním prostředí. Kromě sítě vzniká také fagocytující cytoplast, který i bez jádra přežívá několik hodin a pohlcuje patogeny v blízkém okolí U lytické formy NETózy (která trvá cca 4 hodiny) se síť tvoří pomalým procesem uvnitř buňky. Membrána neutrofilu je při uvolňování sítě kompletně narušena a buňka uvolněním sítí do okolí umírá NETóza  Vzniká síť tvořená jaderným materiálem, obsahující MPO a některé další antibakteriální peptidy z granulí neutrofilů  Do procesu NETózy vstupuje pouze malá část aktivovaných neutrofilů  Účel –většinou boj s velkými patogeny, které nemohou být zfagocytovány  MPO, cadheliciny, defenziny – mikrobicidie  Síť – omezení šíření patogenů v prostoru  NETóza může mít i nežádoucí důsledky  Uvolnění intracelulárních komponent – možná tvorba autoprotilátek proti intracelulárním strukturám neutrofilů (protilátky proti MPO?)  Podezření z účasti na imunitně podmíněné trombóze (tvorba sítí v krevním řečišti) Vyšetření fagocytózy  Vyšetření adheze  Cytometrická detekce adhezivních molekul CD11b/CD18 na povrchu fagocytů defekt adheze (↓ CD11b/CD18)  LAD syndrom  Vyšetření chemotaxe  Boydenova komůrka  migrace fagocytů v nádobce skrze membránu s velmi malými pózy ve směru chemotaktického gradientu  Počítání buněk, které pronikly na druhou stranu membrány  Migrace pod agarózou  Do agarózového gelu se vyříznou jamky – do jedné se pipetuje suspenze vyšetřovaných buněk, do druhé chemoatraktant  Buňky migrují směrem k jamce s chemoatraktantem  Po inkubaci 4 h se gel usuší a obarví  Odečítá se vzdálenost, kterou buňky urazily od středu jamky Vyšetření fagocytózy  Test ingesce  Testuje se schopnost buněk pohltit mikrosferické hydrofilní partikule (MSHP)  Krev se inkubuje s MSHP částicemi  Poté se zhotoví nátěr krve a obarví se  Počítá se 100 buněk, pozitivní jsou ty, co obsahují v cytoplazmě 3 a více MSHP částic  Význam má snížení – sepse, nádory, nezralé formy granulocytů Vyšetření oxidačního vzplanutí  INT/NBT test  Inkubace krve s bezbarvým nitroblue tetrazolium chloridem (NBT) nebo jod nitroblue tetrazolium chloridem (INT) a látkou stimulující oxidační vzplanutí (PMA)  Při oxidačním vzplanutí dojde k redukci NBT nebo INT na nerozpustný barevný formazan  Hodnocení počtu pozitivních buněk (obsahují barevná granula v cytoplazmě)  Chemiluminiscence  Stimulace buněk (PMA, fMLP, bakterie, zymosan)  Přídavek chemiluminiscenční látky – vlivem oxidačního vzplanutí dochází k oxidaci chemiluminiscenční sondy*  emise fotonů  přístroj luminometr  zaznamená se počet záblesků  *Luminol, isoluminol Burst test (BTT)  Detekce oxidačního vzplanutí v granulocytech a monocytech pomocí průtokové cytometrie  Princip – Produkty oxidačního vzplanutí oxidují fluorescenční barvivo  Funkční test  Odběr krve do heparinu  Nejsou stanoveny konkrétní referenční meze  Nutno se vzorkem pacienta vždy zpracovat i vzorek zdravé kontroly!  Hodnocení – porovnání pacienta s kontrolní osobou – hodnotíme % pozitivních granulocytů a monocytů Burst test (BTT) provedení testu  Krok 1: Stimulace fagocytů (1 pacient = 4 zkumavky)  Zkumavka 1: PBS (fosfátový pufr) – negativní kontrola  Zkumavka 2: E. Coli – vazba na PRR receptory – aktivace fosfatidylinositol 3-kinázy (PI3K)  Zkumavka 3: fMLP – chemoakraktant - vazba na formyl peptidový receptor spřažený s malými G proteiny – aktivace fosfolipázy A2 (PLA2)  Zkumavka 4: PMA – malá molekula – rychlý průnik skrze membránu do cytoplazmy – přímá vazba na proteinkinázu C (PKC) – rychlá a masivní aktivace, která po krátké době může vést i ke smrti buňky  Proč 3 stimulancia?  široké spektrum patogenů, existuje několik drah aktivace oxidačního vzplanutí  Snaha postihnout více signálních drah, které vedou k fosforylaci NADPH oxidázy Burst test (BTT)  Krok 2: Zviditelnění produkce ROS pro průtokový cytometr  Fluorescenční barvivo Dihydrorhodamin 123 (DRH 123)  vlivem ROS dochází k oxidaci na Rhodamin 123  Fluorescence při 536 nm (zelená)  Světelná emise zaznamenána detektory cytometru  Intenzita fluorescence úměrná aktivitě oxidačního vzplanutí Burst test (BTT) – hodnocení Na základě negativní kontroly je nastavena hranice pozitivity (úpatí negativního píku) Po stimulaci PMA výrazně narostla fluorescence (posun píku doprava) 96,7% neutrofilů je pozitivní Vrozená porucha oxidačního vzplanutí Chronická granulomatózní choroba (GCD)  Defekt NADPH oxidázy – porucha tvorby ROS  Dědičnost X- vázaná (závažnější) nebo autosomálně recesivní (mírnější)  1:250 000  Náchylnost k infekcím kataláza pozitivními patogeny a mikromycetami (plísně)  Neschopnost fagocytů degradovat patogenní materiál  Tvorba hlubokých abscesů (mohou působit útlak okolních tkání)  Časný nástup choroby GCD De-novo mutace (autosomálně recesivní) Matka i otec mají neporušenou schopnost oxidačního vzplanutí fagocytů, zatímco jejich dítě (pacientka) po PMA vypadá shodně s negativní kontrolou GCD X-vázaná Pacient po stimulaci PMA nereaguje (shodný obraz jako u negativní kontroly) Otec má oxidační vzplanutí po stimulaci PMA v normě (1 pík vpravo) Ale matka má dvojí populaci neutrofilů – jedna populace (pík vpravo) reaguje na stimulaci v normě, druhá populace (pík vlevo) nereaguje  matka je přenašečkou mutace Myeloperoxidáza (MPO, MXX)  Oxidoreduktáza  Obsažena v granulích neutrofilů a monocytů  Přeměňuje peroxid vodíku na kyselinu chlornou (až 50 krát toxičtější)  NETóza - MPO obsažena v síti tvořené jaderným materiálem  MPO je negativně regulována pomocí syntézy NO – inaktivace  tvorba nitrosylových komplexů Deficience myeloperoxidázy  Deficience vrozená: 1. částečná - výskyt cca 1:2000 2. úplná - výskyt cca 1:4000  Dědičnost - autosomálně recesivní  Až 50% pacientů klinicky asymptomatických  Závažný průběh nemoci – pouze 5-10% postižených (časté infekce, zejména plísně)  Deficience získaná:  diabetes mellitus, těžké infekce, nedostatek železa, intoxikace olovem, diseminované tumory, některé leukemie MPO – příprava vzorku  1 pacient = 2 zkumavky  Značení leukocytů v obou zkumavkách pomocí anti-CD14 (odlišení monocytů od granulocytů)  30 min inkubace s protilátkou ve tmě, poté následuje promytí  Další krok - zcela nezbytná je fixace a permeabilizace membrán (MPO je intracelulární marker, zatímco protilátky jsou velké molekuly, které přes neporušenou membránu přirozeně projít nemohou)  Permeabilizace – vytvoření pórů do buněčné membrány (umožní průnik anti-MPO do cytoplazmy a granulí, kde se MPO přirozeně nachází)  Fixace – stabilizace membrán, brání rozpadu permeabilizovaných buněk  Jedna zkumavka -značení protilátkou anti-MPO  Druhá zkumavka se neznačí anti-MPO – slouží jako izotypová kontrola  Hodnocení - % MPO pozitivních granulocytů a monocytů  Norma 75 -100% Deficit MPO Exprese MPO - monocyty ZDRAVÁ KONTROLA PACIENTKA SROVNÁNÍ pacientka zdravá kontrola Izotypová kontrola MPO pozitivní monocyty U pacientky jsou monocyty MPO negativní – pík se překrývá s izotopovou kontrolou ZDRAVÁ KONTROLA PACIENTKA SROVNÁNÍ Deficit MPO Exprese MPO - granulocyty pacientka zdravá kontrola89% Izotypová kontrola MPO pozitivní granulocyty U pacientky jsou granulocyty MPO negativní – pík se překrývá s izotopovou kontrolou ZDRAVÁ KONTROLA PACIENTKA SROVNÁNÍ Deficit MPO lze poznat i na Burst Testu! Burst Test - stimulace E. coli Počet aktivovaných buněk: 95% Stimulační index: 163 Počet aktivovaných buněk: 89% Stimulační index: 22 pacientka zdravá kontrola Fagocyty mají u pacientky nižší pozitivitu meanu intenzity fluoprescence ( posun píku doleva) na oxidační vzplanutí po stimulaci E. coli ve srovnání se zdravou kontrolou. ZDRAVÁ KONTROLA PACIENTKA SROVNÁNÍ Deficit MPO lze poznat i na Burst Testu! Burst test - stimulace PMA Počet aktivovaných buněk: 97% Stimulační index: 281 Počet aktivovaných buněk: 92% a 6% Stimulační index: 23 a 201 pacientka zdravá kontrola Fagocyty mají u pacientky nižší pozitivitu na oxidační vzplanutí po stimulaci PMA ve srovnání se zdravou kontrolou  doordinoval se test MPO kde se ukázalo, že pacientka je MPO deficitní Co je stimulační index (SI)?  Medián intenzity fluorescence daného píku (MFI) = poloha středu píku na ose x  Stimulační index = MFI stimulovaných buněk MFI nestimulovaných buněk  Stimulační index=130/0,463 = 281 ZDRAVÁ KONTROLA Stimulační index: 281 MFI B=130 MFI nestim buněk=0,463