MASARYKOVA UNIVERZITA Lékařská fakulta VYŠETŘOVACÍ METODY V IMUNOLOGICKÉ A ALERGOLOGICKÉ LABORATOŘI Marcela Vlková a kol. BRNO 2019 Autoři: Mgr. Marcela Vlková, Ph.D Ústav klinické imunologie a alergologie, Fakultní nemocnice u Sv. Anny v Brně MUDr. Roman Hakl Ústav klinické imunologie a alergologie, Fakultní nemocnice u Sv. Anny v Brně MUDr. Zita Chovancová, Ph.D Ústav klinické imunologie a alergologie, Fakultní nemocnice u Sv. Anny v Brně Mgr. Julie Štíchová Ústav klinické imunologie a alergologie, Fakultní nemocnice u Sv. Anny v Brně Recenze: RNDr. Veronika Kanderová, Ph.D. Klinika dětské hematologie a onkologie 2. LF UK a FN Motol, Praha RNDr. Alexandra Lochmanová, Ph.D. Oddělení imunologie a alergologie, Zdravotní Ústav Ostrava Obsah 1 Separační metody................................................................................................................ 8 1.1 Preanalytická fáze vyšetření buněčné imunity ............................................................ 8 1.2 Základní principy separace buněk ............................................................................... 9 1.3 Pozitivní a negativní selekce ..................................................................................... 11 1.4 Izolace PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells)............................................. 11 1.5 Rozetové separace ..................................................................................................... 12 1.6 Separace pomocí adherence na plastové povrchy ..................................................... 13 1.7 Magnetické selekce.................................................................................................... 13 1.8 Sortování.................................................................................................................... 14 2 Vyšetřovací metody v laboratoři buněčné imunologie ..................................................... 15 2.1 Průtoková cytometrie................................................................................................. 15 2.2 Vyšetření lymfocytárních subpopulací v laboratoři buněčné imunologie................. 20 2.2.1 T-lymfocytární subpopulace .............................................................................. 21 2.2.2 B-lymfocytární subpopulace .............................................................................. 23 2.3 Funkční testy v laboratoři buněčné imunologie ........................................................ 25 2.3.1 Aktivace buněk................................................................................................... 26 2.3.2 Blastická transformace lymfocytů...................................................................... 26 2.3.3 Metody měření aktivace a proliferace lymfocytů .............................................. 27 2.3.4 Sledování funkce přirozených cytotoxických buněk.......................................... 38 2.3.5 Sledování apoptózy či dalších typů buněčné smrti ............................................ 40 2.3.6 Sledování funkčnosti signálních drah ................................................................ 41 2.4 Možnosti vyšetření sekrece humorálních faktorů na buněčné úrovni ....................... 46 2.4.1 ELISPOT............................................................................................................ 46 2.4.2 FLUROSPOT..................................................................................................... 54 3 Využití monoklonálních protilátek k léčebným účelům................................................... 55 4 Diagnostika alergických stavů .......................................................................................... 57 4.1 Alergeny .................................................................................................................... 57 4.2 Zkřížené reakce.......................................................................................................... 59 4.3 Zdroje alergenů pro laboratorní diagnostiku ............................................................. 63 4.3.1 Diagnostické využití alergenových extraktů a rekombinantních alergenů ........ 64 4.4 Alergologické vyšetření............................................................................................. 64 4.4.1 Laboratorní diagnostika...................................................................................... 64 4.4.2 Stanovení počtu eozinofilů................................................................................. 65 4.4.3 Stanovení koncentrace celkových imunoglobulinů ve třídě IgE........................ 65 4.4.4 Stanovení koncentrace specifických IgE protilátek ........................................... 65 4.4.5 Multiplexové metody ......................................................................................... 68 4.4.6 Stanovení ECP.................................................................................................... 69 4.4.7 Stanovení tryptázy.............................................................................................. 70 4.4.8 Test aktivace bazofilů......................................................................................... 70 4.4.9 Test proliferace lymfocytů pro pozdní alergickou reakci na léky...................... 71 SEZNAM ZKRATEK Ab Ag AP APC ATB BFA BrdU CCD CD ConA CSFE CTLA CVID DELFIA EIA ELISA ELISPOT FACS FEIA FITC fMLP FS, FSC GPA HLA HRP IL IM IFN IU/ml LPS protilátka antigen alkalická fosfatáza antigen prezentující buňka antibiotikum brefeldin A bromdeoxyuridin zkříženě reagující uhlovodíkové determinanty (cross-reactive carbohydrate determinants) cluster of differentiation konkanavalin A carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester cytotoxický T-lymfocytární antigen (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein) běžný variabilní imunodeficit (common variable immunodeficiency) dissociation-enhanced lanthanide fluoroimmunoassay enzymatická imunoanalýza enzym-imunoanalýza probíhající na pevné fázi enzymatická buněčná imunoesej fluorescence activated cell sorting fluorescenční enzymatická imunoanalýza fluorescein-isothiokyanát N-Formylmethionyl-leucyl-phenylalanine forward scatter glykoforin A hlavní lidský histokompatibilní systém (human leucocyte antigens) křenová peroxidáza (horseradish peroxidase) interleukin ionomycin interferon mezinárodní jednotka (international unit)/mililitr lipopolysacharid LTP mAb NK PBMC PBS PD-1 PE PHA PI PMA PWM RAST SCID SFC SS (SSC) TNF TUNEL lipid transfer protein monoklonální protilátka přirozený zabíječ (natural killer) mononukleární buňky periferní krve (peripheral blood mononuclear cells) fosfátový pufr (phosphatebuffered saline) receptor programované buněčné smrti (programed cell death-1) phycoerythrin phytohemaglutinin propidium jodid phorbol myristát acetát pokewed mitogen radio allegro sorbent test těžký kombinovaný imunodeficit buňky tvořící spoty (spot forming cells) side scatter tumor nekrotizující faktor terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling 7 Úvod V současné době prochází buněčné metody v klinické imunologii rychlým vývojem. Je to dáno především rozvojem separačních a detekčních metod, což je doprovázeno neustále se zlepšujícím vybavení výzkumných, ale i klinických laboratoří. Skripta mají za úkol seznámit studenty se základy moderních testů v imunologické buněčné laboratoři, významná část je věnována i novým metodám v alergologické diagnostice. Skripta jsou doplněna i o kapitolu o klinickém využití monoklonálních protilátek; jedná se o velmi moderní směr klinické medicíny, se kterým musí být seznámeni i studenti nelékařských medicínský oborů. Skripta jsou určena zejména pro studenty předmětu Klinická imunologie magisterského oboru Bioanalytik a doplňují skripta Základy vyšetření v klinické imunologii. 8 1 Separační metody Izolace jednoho nebo více buněčných typů z heterogenní populace je nedílnou součástí moderního biologického výzkumu, rutinní klinické diagnostiky i léčby. V nedávné době došlo k rychlému rozvoji separačních metod, které se navzájem liší ve výtěžnosti, čistotě separovaných buněk a jejich životaschopnosti. To se odrazilo nejen ve významném pokroku v různých oblastech diagnostiky, ale také v biologii kmenových buněk, onkologii a regenerační medicíně. 1.1 Preanalytická fáze vyšetření buněčné imunity Vyšetřovaným materiálem pro buněčná imunologická vyšetření je nejčastěji nesrážlivá tzv. plná krev. Správně provedený odběr krve, výběr odběrového média, skladování odebrané krve a její transport do laboratoře jsou faktory, které mohou zásadně ovlivnit výsledky požadovaných vyšetření. Pro cytometrické stanovení zastoupení subopopulací leukocytů a lymfocytů se odebírá krev do EDTA (ethylendiamintetraoctová kyselina), která chelatuje vápník a tím zamezuje aktivaci buněk. V krvi. Tuto krev lze také použít pro separaci buněk, protože při ní je EDTA při zpracování vzorku odstraněna. Provedení mnoha funkčních testů je možné i z plné krve. Zde je výhodné odebrat krev do heparinu, který zabraňuje srážení tím, že aktivuje antitrombim III, který pak inhibuje trombin a faktory vnitřního srážení a tím zabraňuje přeměně fibrinogenu na fibrin. Zkumavka s odebranou krví musí být označena štítkem s jednoznačnou identifikací pacienta a také opatřena průvodkou, která opět obsahuje identifikaci pacienta, kontakt na odesílajícího lékaře či oddělení, požadavky na provedení vyšetření a také dobu odběru. Počty některých leukocytů a funkční vlastnosti jednotlivých buněčných populací v odebrané krvi se mění při jejím skladování. Zejména pro funkční vyšetření monocytů, neutrofilů a také lymfocytů je třeba odebranou krev dopravit do laboratoře co nejdříve po odběru. Nejnáchylnější ke změnám co do funkčnosti i počtu buněk jsou monocyty a neutrofily. Pro funkční testy by měla být krev dopravena do laboratoře do několika hodin, pro stanovení zastoupení lymfocytárních populací do 24 hodin. Přežívání buněk v odběrovém médiu ovlivňuje nejen doba skladování či transportu, ale také teplota. Odebraná krev by neměla být vystavena přímému slunečnému či světelnému záření ani vysokým teplotám. Vzorky krve odebrané do heparinu by měly být skladovány a 9 transportovány do laboratoře při pokojové teplotě, 16-25°C, vzorky krve v EDTA pak za chladu při 4-8°C. Důležitým bodem pro správné provedení funkčních testů je dodržování sterility zpracovaného materiálu a pěstovaných kultur. Tu je potřeba zachovávat po celou dobu zpracování a kultivaci vzorku tak, aby nedošlo k nespecifické aktivaci a znehodnocení celého stanovení např. plísněmi, bakteriemi apod. Další kapitoly obsahují metody, jak separovat různé typy buněk a jakým způsobem provádět některé z funkčních testů. U mnoha separací a následných vyšetření se jedná o poměrně drahé metody a při nedodržení některého z výše uvedených bodů preanalytické fáze může vést ke zkreslení výsledků. Mnoho funkčních testů uvedených v této kapitole lze provést nejen ze separovaných buněk, ale také z plné heparinizované krve – produkce cytokinů, proliferační testy, aktivace NK buněk, fagocytární testy apod. Plné krev lépe odráží stav in-vivo než separované buňky. Při provedení některých testů je však zapotřebí získat větší množství určitého typu buněk pro provedení cíleného vyšetření, tam je možné s výhodou použít separační metody. 1.2 Základní principy separace buněk Při oddělování buněk z heterogenní směsi se s úspěchem využívá jedné nebo více vlastností, které jsou pro daný typ buňky jedinečné. Nejpoužívanější metody separace buněk jsou založeny na základních buněčných vlastnostech, mezi které patří: Povrchový náboj a adheze: schopnost adherence (přilnutí) buněk k plastickým a jiným povrchům polymeru může být použita k oddělení adherentních buněk od suspenzních buněk (například při separaci monocytů). Velikost a hustota: tyto vlastnosti buněk se běžně používají pro izolaci velkého počtu buněk, a to sedimentací, filtrací nebo centrifugací v hustotním gradientu (například při separaci PBMC). Buněčná morfologie a fyziologie: různé typy buněk lze rozlišit podle tvaru, histologického barvení, růstu v selekčních médiích, redoxního potenciálu a podle dalších vizuálních a behaviorálních vlastností, které pak mohou být využity k izolaci těchto buněk. 10 Využitím monoklonálních protilátek ke specifické vazbě na povrchové antigeny buněk: tím může dojít k selektivnímu zachycení buněk požadovaného fenotypu. Označené buňky se následně detekují pomocí měřitelných sond (obvykle fluorochromů nebo magnetických částic, kterými jsou protilátky označeny). Výše uvedené principy mohou být kombinovány, aby se zvýšila specifičnost izolace buněk. V prvním kroku se většinou využívá separačních metod bez značení monoklonálními protilátkami (např. izolace PBMC pomocí hustotního gradientu). Následuje povrchové značení buněk pomocí monoklonálních protilátek označených fluorescenčním konjugátem a rozdělení buněk pomocí sortování průtokovou cytometrií nebo magnetickou selekcí při použití monoklonálních protilátek konjugovaných s magnetickými částicemi. Separace buněk je nutná pro některá imunologická vyšetření, jako je vyšetření fenotypu lymfocytů, proliferační aktivity lymfocytů nebo cytotoxické aktivity NK buněk. Separace buněk se také využívá v mnoha výzkumných metodách. Nejčastěji používaným materiálem je periferní krev nebo kostní dřeň, nicméně buňky mohou být separovány také z tkání. Často je také zapotřebí odstranění erytrocytů (zejména pro cytometrické stanovení). Zde si pomáháme hypotonickou lýzou, která je založena na větší citlivosti erytrocytů k hypotonickému šoku ve srovnání s leukocyty. Jako lyzační roztok se používá 0,84% roztok chloridu amonného, kyselina mravenčí nebo jsou k dispozici různé protokoly s použitím destilované vody. Lýza erytrocytů může být provedena před značením plné krve monoklonálními protilátkami nebo až po použití monoklonálních protilátek a používá se pro testy kvantifikace lymfocytárních subpopulací, případně dalších leukocytů, a to jak pro určení jejich relativních, tak absolutních počtů. Výběr metody izolace buněk pro experiment závisí na následujících kritériích: 1. Kolik stresu (mechanického, chemického nebo fyziologického) separovaná buňka vydrží a při tom zůstane životaschopná. 2. Potřebná úroveň čistoty a výtěžnosti buněk spolu s přijatelným rizikem kontaminace, (nulová kontaminace je nutná v případě, že jsou buňky potřebné pro následnou sterilní kultivaci). 3. Jaké jsou přijatelné náklady na přístroje, činidla, práci a podobně. 4. Jakékoliv specifické požadavky následných aplikací (například kultivace buněk, extrakce nukleových kyselin nebo proteinů a podobně). 11 S výše uvedenými kritérii také souvisí typ metody izolace pomocí monoklonálních protilátek, která může být založena na negativní nebo pozitivní selekci. 1.3 Pozitivní a negativní selekce Pozitivní selekce je zaměřena na separaci konkrétního buněčného typu, zatímco negativní selekce zahrnuje odstranění všech ostatních buněčných typů z celé populace buněk, což v konečném důsledku vede k získání populace buněk cílových. Oba typy izolačních metod mají své výhody i nevýhody. Pozitivní selekce umožňuje lépe získat čistě vyseparovanou buněčnou populaci, protože k vybrání cílových buněk využívá specifických protilátek zaměřených na konkrétní buněčný typ. Pozitivní separací získané cílové buňky jsou však označeny protilátkami a rovněž ovlivněny dalšími činidly, což může mít vliv na funkční vlastnosti buněk (např. pěstování v kultuře). Při negativní selekci se využívá směsi monoklonálních protilátek namířených proti všem nepotřebným buněčným subpopulacím ve vzorku tak, aby nebyla označena právě pouze cílová populace buněk. To však může být velmi složité a v důsledku toho se po negativní selekci běžně setkáváme s horší čistotou získaného vzorku, kde je cílová populace stále doprovázena malou či větší příměsí nepotřebných buněk. 1.4 Izolace PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells) Separace buněk je založena na rozdílných fyzikálních vlastnostech sledovaných buněk, jako je jejich velikost a hustota. Separace může probíhat na spojitém nebo nespojitém hustotním gradientu. Zatímco spojitý gradient se používá spíše pro separaci proteinů, nespojitý gradient se využívá zejména pro separaci tzv. mononukleárních buněk periferní krve (lymfocyty a monocyty neboli PBMC; z anglického peripheral blood mononuclear cells). Při této separaci je nesrážlivá krev nanesena na separační médium o hustotě 1,077 g/ml, což je syntetický vysokomolekulární polymer disacharidu sukrózy a epichlorohydrinu (komerční názvy Ficoll 400, Ficoll-Paque PLUS, či LymphoprepTM ). Na Ficoll se navrství vzorek periferní krve a nechá se centrifugovat při nižších otáčkách s nulovou brzdící rychlostí. Buňky sedimentují určitou rychlostí podle své velikosti, hustoty a tvaru až do chvíle, kdy je dosažena rovnováha mezi hustotou roztoku a buňkami. Hustota erytrocytů je 1,1 g/l, trombocytů 1,05 g/l, lymfocytů 1,06 g/l, monocytů 1,07 g/l a granulocytů 1,08 g/l. Po centrifugaci jsou buňky rozděleny v separačním médiu a zahuštěny do zón. Nejnižší hustotu má plazma, proto tvoří nejvyšší vrstvu 12 obsahu zkumavky, pod ní se nachází prstenec mononukleárních buněk (tedy monocytů a lymfocytů), dále vrstva separačního média a na dně zkumavky jsou granulocyty a erytrocyty. Lymfocytární prstenec je pak přemístěn do čisté zkumavky. Následuje promytí buněk ve fosfátovém pufru PBS (phosphate-buffered saline). Jedná se o izotonický roztok, který má stejnou osmolaritu jako přirozené prostředí buněk (krev). Udržuje přirozené pH v rozmezí 7,2– 7,4 a obvykle neobsahuje vápenaté a hořečnaté ionty. 1.5 Rozetové separace Rozetové separace vycházejí z přítomnosti specifických receptorů T- a B-lymfocytů. T-lymfocyty vystavují na svém povrchu receptor CD2, na který se vážou beraní erytrocyty svým LFA-3 (lymphocyte function-associated antigen 3) a tvoří tzv. E-rozety. B-lymfocyty vážou myší erytrocyty a vznikají tzv. M-rozety. Lymfocyty s navázanými erytrocyty lze separovat pomocí gradientové centrifugace a erytrocyty pak odstranit hypotonickou lýzou. V současné době se spíše používá jiný typ rozetové separace, který využívá speciálně připravené monoklonální protilátky spojené do tetramerů či také tzv. tetramerních komplexů. Ty jsou tvořeny čtyřmi protilátkami spojenými do jedné molekuly, viz obrázek č.1. V reakci se používají dva typy tetramerních komplexů současně. První komplex má vazebná místa, kterými se váže na glykoforin A (GPA) na povrchu erytrocytů a další vazebná místa, kterými reaguje s vybranými receptory buněk, které je nutné při izolaci odstranit. Druhý typ tetramerních komplexů má vazebná místa pouze pro GPA na povrchu erytrocytů. K plné krvi odebrané do nesrážlivého činidla se přidá výše uvedená směs dvou tetramerních komplexů a takto připravená krev se inkubuje 20 minut při pokojové teplotě. V době inkubace se buňky, vůči jejichž receptorům byly přidány monoklonální protilátky v tetrameru s GPA, pomocí těchto tetramerů navážou na erytrocyty a erytrocyty s navázanými buňkami se působením tetramerů proti GPA provážou mezi sebou. Takto upravená krev je navrstvena na hustotní médium, následuje hustotní gradientová centrifugace. Po ní v prstenci mezi plazmou a separačním médiem zůstanou pouze ty buňky, vůči jejichž povrchovým znakům nebyly přidány monoklonální protilátky. Ostatní buňky během separace klesnou spolu s erytrocyty na dno zkumavky (viz obrázek č. 1). 13 1.6 Separace pomocí adherence na plastové povrchy Je jednou z nejlevnějších variant separací, kterou je možno využít pro získání monocytů. Tyto buňky mají přirozenou schopnost adherovat k povrchu kultivačního plastiku. PBMC izolované z periferní krve se nechají inkubovat několik hodin v plastikové misce (např. plastová Petriho miska), přičemž monocyty během inkubace postupně adherují k plastovému povrchu, zatímco lymfocyty zůstávají v médiu. Nevýhodou této metody je, že nezískáme čistou populaci monocytů (v získané buněčné směsi je pouze 70–80 % monocytů), navíc se touto metodou vyseparuje většinou méně než 50 % všech přítomných monocytů ve zpracovávaném vzorku. K tomu hraje důležitou roli také variabilita jak v čistotě, tak účinnosti separace mezi jednotlivými dárci. 1.7 Magnetické selekce Pomocí těchto metod lze získat specifickou vybranou populaci buněk. Magnetická selekce je založena na označení buněk v suspenzi monoklonální protilátkami, které jsou konjugovány s magnetickými částicemi. Zkumavka s takto označenými buňkami je pak Obrázek č. 1: Rozetové separace. Izolační koktejl protilátek obsahuje tetramery proti receptorům buněk spolu s anti-GPA, které provážou nechtěnou buňku s erytrocyty a dále tetramery tvořené pouze anti-GPA, které provazují erytrocyty navzájem. 14 vložena do magnetu, přičemž magnetické částice se spolu s cílovými buňkami zachytí na stěnách zkumavky, zatímco ostatní buňky v supernatantu jsou odstraněny. Reakce může probíhat buď ve zkumavkách, nebo tzv. kolonách. I zde jsou v prvním kroku označeny buňky protilátkami s navázanými magnetickými partikulemi. Po ukončení inkubace buňky procházejí kolonou umístěnou v silném magnetickém poli. Magneticky označené buňky jsou zadrženy v koloně a odděleny od neznačených buněk. Po vyjmutí kolony z magnetického pole jsou vymyty zadržené buňky. Obě populace buněk (značené i neznačené) jsou následně použitelné k dalším experimentům. 1.8 Sortování Další metodou k získání určité buněčné populace je sortování (nebo též sortrování). Tato metoda se provádí na přístrojích, které se dříve označovaly názvem FACS (z anglického „fluorescence-activated cell sorting“). Přístroje využívají principu průtokové cytometrie. Pro toto stanovení jsou buňky v roztoku označeny monoklonální protilátkou s navázaným fluorochromem. Po inkubaci a promytí vzorku následuje vlastní separace. Vzorek je nasáván pod tlakem do tenké kapiláry, kde se buňky řadí jedna za druhou. Následuje detekce založená na stejném principu, jako u klasického průtokového cytometru. Vzorky vstupují do měřící komůrky (tzv. průtokové cely), kde jsou ozářeny paprskem laseru. Přítomné fluorochromy na protilátkách, které jsou navázány na specifických receptorech buňky, začnou po ozáření paprskem laseru emitovat světlo příslušné vlnové délky, které je snímáno pomocí detektorů. Sorty pracují na základě dvou principů, podle kterých je můžeme rozdělit na fluidní sortery a kapénkové sortery. U fluidního sorteru prochází proud nosné kapaliny se vzorkem průtokovou celou a při identifikaci částice splňující požadovaná kritéria je sepnut piezoelektrický ventil a proud s částicí vybočí mimo hlavní proud, a tam je posléze zachycen do sběrných zkumavek. U kapénkového sorteru je proud buněk roztříštěn na jednotlivé kapičky ideálně tak, aby jedna kapička obsahovala právě jedinou buňku. Jakmile je detekována buňka, která splňuje požadovaná kritéria (obsahuje sledovaný fluorescenční znak), je celé kapičce pomocí elektrického výboje udělen buď pozitivní nebo negativní náboj. Nabité kapičky jsou vychýleny z proudu pomocí elektromagnetů a zachyceny do sběrných zkumavek. Obě metody se vyznačují vysokou čistotou separace, ale jsou finančně náročné, a to nejen z hlediska přístrojového vybavení, ale i samotné separace. V současné době existují i další typy sorterů, které třídí buňky na odlišných fyzikálních principech (např. akustické sortery a další). 15 2 Vyšetřovací metody v laboratoři buněčné imunologie 2.1 Průtoková cytometrie Průtoková cytometrie je metoda určená k měření buněk nebo částic v roztoku. Průtokový cytometr se skládá ze tří systémů: fluidního, optického a elektronického. Fluidním systémem jsou buňky určené k analýze ve vzorkovém pufru unášeny proudem nosné kapaliny do měřící komůrky (tzv. průtoková cela) tak, aby komůrkou procházely jedna buňka za druhou (princip hydrodynamické fokusace). V průtokové cele dopadá na buňky paprsek jednoho či postupně více laserů v závislosti na konfiguraci daného cytometru, čímž se do měření zapojuje optický systém. Optický systém je tvořen jedním nebo více lasery v závislosti na konfiguraci cytometru, dále soustavou čoček a hranolů, které upravují laserový paprsek do požadovaného tvaru a dále optickými zrcadly a filtry, jež zajišťují vlastní měření jednotlivých optických parametrů. Při průchodu buňky laserovým paprskem dochází k rozptylu světla laserového paprsku. Rozptyl světla v kolmém směru na dopad paprsku laseru je závislý na morfologických vlastnostech buňky (povrchové struktuře membrán, přítomných granulích a celkové hustotě buňky). Měří se detektorem nazývaným Side Scatter (SSC nebo SS). Rozptyl světla v rovnoběžném směru je závislý na velikosti buňky a měří se detektorem s názvem Forward Scatter (FSC nebo FS). Pokud jsou buňky označeny monoklonálními protilátkami, které jsou konjugovány s fluorochromy, dochází při ozáření laserovým světlem k excitaci elektronů v atomech tohoto fluorochromu. Při návratu elektronů do základního stavu je přebytečná energie vyzářena ve formě elektromagnetického záření s delší vlnovou délkou, než byla vlnová délka dopadajícího laserového paprsku. Emise fotonů je závislá na vstupní energii a na tzv. Stokesově posunu (rozdíl mezi vlnovou délkou excitačního a emitovaného záření). Konkrétní vlnová délka takto vzniklého emitovaného fluorescenčního záření je tedy závislá na vlnové délce použitého laserového světla a na konkrétním fluorochromu. Fluorescenční záření procházejícího vzorku je postupně systémem dichroických zrcadel a soustavy filtrů, propouštějících specifické rozmezí vlnových délek (long pass, short pass a band pass filtry), rozděleno mezi jednotlivé detektory, které snímají vždy jen určitou část spektra v určitém rozsahu vlnových délek, (tedy zaznamenávají intenzitu záření typickou pro určité skupiny fluorochromů). Např. první detektor snímá záření v rozsahu vlnových délek 500–545 nm, které jsou typické pro fluorochromy FITC (Fluorescein isothiokyanát) nebo Alexa Fluor 488 a ruhý detektor snímá záření v rozsahu vlnových délek 560–590 nm, které jsou charakteristické pro fluorochromy PE (Phycoerythrin), 16 Alexa Fluor 647 aj. Pomocí tohoto systému jsou zaznamenány signály jednotlivých fluorochromů, kterými jsou označeny monoklonální protilátky navázané na buněčných povrchových strukturách. Používanými detektory v cytometrech jsou fotodiody (pouze pro Forward Scatter) a fotonásobiče. Na kladně nabitou desku fotonásobiče (katodu) dopadne foton, který z ní vyrazí dva elektrony a ty se tzv. násobí na sérii dynod. Na konci fotonásobiče je anoda, na které se měří změna napětí, která vzniká ve fotonásobiči po dopadu fotonů. Při ozáření buňky a fluorochromů (přítomných na monoklonálních protilátkách navázaných na buněčných receptorech) paprskem laseru vznikají na jednotlivých detektorech napěťové pulzy. Elektronický systém pak zpracovává zaznamenané napěťové pulsy jako tzv. intenzitu fluorescence. Relativní škála intenzit se zpravidla vynáší na logaritmickou stupnici. Výsledek cytometrického měření se odečítá z grafů, a to buď dvouparametrově pomocí tzv. dot plotů (obrázek č. 2A), nebo z jednoparametrového histogramu (na ose X je zobrazena intenzita fluorescence, na ose Y je počet buněk, obrázek č. 2B). Jednotlivé tečky v dot plotech představují buňky, které jsou definovány intenzitou fluorescence pro každý ze sledovaných fluorescenčních signálů. Od určité intenzity fluorescence je sledovaný fluorescenční signál považován za pozitivní a sledovaný znak je pak označen znaménkem plus (+). Buňky s nižší intenzitou fluorescence sledovaného markeru jsou pak považovány za negativní a jsou označovány znaménkem mínus (-). U fluorochromů je vhodné, aby se jejich absorpční maximum co nejvíce blížilo vlnovým délkám běžně používaných laserů. V cytometrii se nejčastěji používá vzduchem chlazený Obrázek č.2: A) Dot plot - stanovení procentuálního zastoupení pomocných CD3+CD4+ T-lymfocytů a CD3+4- T-lymfocytů. B) Histogram procentuálního zastoupení T-lymfocytů CD3+. 17 argonový laser s vlnovou délkou záření 488 nm (modrá oblast spektra), helium-neonový laser s vlnovou délkou 633 nm (červená oblast spektra), fialový laser s vlnovou délkou 407 nm nebo UV laser s vlnovou délkou 350 nm. V současné době je v průtokové cytometrii běžným standardem využití více-laserového uspořádání. Na buňky v měřící cele dopadají paprsky různých laserů s časovým odstupem a z nich vzniklé signály jsou vyhodnoceny samostatně. Dříve využívaný jedno-laserový cytometr s argonovým laserem byl schopen analyzovat měření pro 5 různých fluorochromů, dnes se v běžné rutinní diagnostice využívají cytometry v rozsahu 8-10 barev. Pro výzkumné účely jsou dnes využívány mnoho-laserové cytometry, které jsou schopny hodnotit 18–20 barev, nebo tzv. spektrální cytometry, které jsou schopny shromažďovat úplné spektrální informace na úrovni jedné buňky. Konfigurace používaných detektorů spektrálního cytometru zabírá celé fluorescenční spektrum a není explicitně vyladěna na konkrétní barvící panel. Tímto způsobem lze detekovat i fluorochromy, které mají své podobné emisní spektrum a při měření na běžném průtokovém cytometru by od sebe nebyly rozeznatelné (obrázek č. 3). Obrázek č. 3: Schéma konvenčního a spektrálního cytometru Modifikováno dle: Nolan JP, Condello D. Spectral flow cytometry. Curr Protoc Cytom. 2013;Chapter 1:Unit1.27. doi:10.1002/0471142956.cy0127s63 Při běžném cytometrickém měření se často stává, že průtokovou celou procházejí dvě buňky najednou. Tato naměřená data musí být softwarově z celkového souboru všech dat 18 odstraněna. Tento problém řeší novější typ cytometru (tzv. akustický cytometr). Tento přístroj pracuje s technologií akustického zaostřování vzorku, při které se generuje ultrazvukový tlak (při frekvenci > 2 MHz), kterým se přenáší částice do středu proudu vzorku. V kombinaci s hydrodynamickým tlakem vzniká centralizovaný úzký proud částic, který je vstřikován do středové osy kapiláry, kde dochází k rovnoměrnému laserovému ozáření bez ohledu na vstupní rychlost vzorku. Omezením průtokové cytometrie je relativně málo typů antigenů, které jsme schopni detekovat na jedné buňce. Například při stanovení efektorových pomocných T-lymfocytů potřebujeme znak CD45 (což je znak typický pro leukocyty), dále znaky CD3 (všechny T-lymfocyty) a CD4 (pomocné T-lymfocyty), znaky CD45RA a CCR7 (definují vývojová stádia T-lymfocytů), a znaky CD69, CD25, CD38 a další, které vypovídají o aktivaci buňky. Dále potřebujeme stanovit intracelulární produkci cytokinů (IFN-γ, TNF-α, IL-4), přítomnost kostimulačních molekul CD40 ligand nebo CTLA-4 a přidat značení oddělující živé a mrtvé buňky. Pro jednotlivá vývojová či aktivační stádia lymfocytů jsou dnes známy charakteristické markery. Protože zpravidla pracujeme s buněčnou suspenzí, ve které jsou efektorové Tlymfocyty stimulované periferní krve v různém stádiu vývoje, nebudeme schopni při omezeném počtu detektorů tyto buňky zcela přesně charakterizovat. Při měření na například deseti-barevném cytometru nemáme k dispozici dostatek kanálů, které by byly schopny snímat více než 10 různých fluorescenčních záření a tím pádem nemůžeme detekovat více než 10 znaků na jedné buňce. Navíc používané fluorochromy vždy emitují záření v určitém relativně širokém pásmu spektra a tyto pásy se mohou v závislosti na použitých fluorochromech částečně překrývat. To vede k falešnému zvýšení signálu a tím i k falešně vyšší intenzitě fluorescence. Takto naměřená data proto musí být tzv. kompenzována. Část signálu, ve které dochází k překryvu, je softwarově odečtena od skutečně naměřené intenzity fluorescence. Tento problém řeší atomová hmotnostní cytometrie pomocí přístroje CyTOF (obrázek č. 4), kdy se místo fluorescenčních značek na monoklonálních protilátkách používají izotopy lanthanoidů. Buňku lze takto teoreticky označit až 100 různými monoklonálními protilátkami. Při vlastním měření je každá buňka suspenze rozprášena neboli nebulizována do jedné kapky. Tato kapka je pak vnesena do argonového plamene, který má teplotu vyšší než 5000 °C. Následně dojde k odpaření všech organických součástí. Buňka je tímto procesem atomizována, z přítomných lanthanoidů jsou vyraženy elektrony, čímž se z nich stanou ionty. Tyto ionty jsou urychleny v elektrostatickém poli a při svém letu k detektoru jsou odděleny pomocí deflektorů 19 na jednotlivé paprsky v závislosti na jejich hmotnosti. Hmotnostní spektrometr je odliší od ostatních izotopů na základě rozdílných atomových hmotností jednotlivých prvků. Detektory pak sčítají přicházející ionty a kvantifikují množství každého kovu, které je závislé na množství navázaných protilátek pro každou buňku. Výsledkem jsou čárová spektra, ve kterých nedochází k překryvu, jako je tomu v případě běžných fluorochromů (obrázek č. 4). Navíc lze takto stanovit relativně velký počet buněčných znaků (v současnosti se používá 30–40 monoklonálních protilátek současně), ale analýza takového měření zatím převyšuje běžný diagnostický rámec. S tím souvisí také to, že zatím není rutinně k dispozici nabídka lanthanoidy značených monoklonálních protilátek, pořizovací cena přístroje je vysoká a provedení vyšetření je drahé. Průtoková cytometrie se v imunologické vyšetření nejčastěji používá ke stanovení procentuálního zastoupení jednotlivých lymfocytárních populací, ale je možné její využití také ke stanovení kvantimetrické. Jedná se o stanovení založeném na měření meanu intenzity fluorescence, který představuje střední hodnotu intenzity fluorescence, kterou pro daný fluorochrom konjugovaný s protilátkou hodnotíme u sledované populace buněk. Tato hodnota je přímo úměrná navázanému množství protilátek, což můžeme využit pro zjištění množství exprimovaného receptoru, například se při sepsích zvyšuje exprese CD64 na neutrofilech, u monocytů se na jejich povrchu snižuje exprese HLA-DR, při monitorování exprese CD274 při sledování účinnosti léčby pomocí monoklonální protilátky anti-PD-L1 ( CD274) a podobně. Průtoková cytometrie se využívá nejen k imunologickému a hematologickému vyšetření lidí, ale má také široké využití ve veterinární medicíně, v biologii, mikrobiologii apod. Obrázek č. 4: Atomová hmotnostní cytometrie CyTOF 20 2.2 Vyšetření lymfocytárních subpopulací v laboratoři buněčné imunologie Hodnocení lymfocytárních populací je nezbytné pro diagnostiku maligních onemocnění, vrozených primárních imunodeficiencí či získaných sekundárních imunodeficiencí, které se mohou rozvinout v důsledku infekcí, autoimunitních onemocnění, traumat, nádorů, malnutrice, nebo terapie primárního onemocnění (ozařování, chemoterapie, antibiotická léčba, kortikoidy, a podobně). Diagnostické laboratorní postupy jsou navrhovány na základě podrobného klinického vyšetření a měly by být hodnoceny v kontextu s klinickým stavem pacienta. Základním buněčným vyšetřením v imunologické laboratoři je sledování změn v zastoupení a funkci jednotlivých populací lymfocytů. Ty se významně podílejí na funkci imunitního systému, například efektorové pomocné CD4+ T-lymfocyty ovlivňují aktivaci makrofágů, pomáhají při aktivaci CD8+ T-lymfocytů a B-lymfocytů. Efektorové cytotoxické CD8+ T-lymfocyty a NK buňky (natural killer cells, přirození zabíječi) zabíjejí především infikované nebo nádorově změněné buňky. B-lymfocyty po své aktivaci a diferenciaci na plasmablasty a plazmatické buňky jsou odpovědné za produkci protilátek. V periferní krvi zdravého člověka se vyskytují různé buněčné populace, mezi kterými se nacházejí buňky účastnící se primárně imunitních reakcí. Mezi ně patří T-lymfocyty (pomocné Th, cytotoxické Tc a regulační Treg T-lymfocyty), B-lymfocyty a NK buňky. Každá z těchto buněk nese na svém povrchu některé jedinečné znaky, podle kterých je možné danou populaci buněk identifikovat. T-lymfocyty charakterizuje povrchový znak CD3, Th-lymfocyty CD3 a CD4, Tc-lymfocyty CD3 a CD8, Treg lymfocyty CD3, CD4, CD25 a CD127, B-lymfocyty CD19 nebo CD20, NK buňky CD16 a CD56. Zkrácený zápis definované populace se provádí pomocí CD znaku a znaménka plus (+; sledovaný znak u buněk přítomen je) či mínus (-; sledovaný znak přítomen není). Existují ještě další formy zápisu, kdy je definována síla exprese daného znaku, např. „high“ nebo znakem „++“, což okazuje na vysokou expresi daného znaku na povrch buňky. Nízká exprese je označena jako „low“ nebo také „+/-“. Regulační T-lymfocyty jsou pak označeny jako CD3+ CD4+ CD25+ CD127low . Pomocí fluorochromem konjugovaných monoklonálních protilátek, které jsou namířeny proti sledovaným znakům, je možné tyto buněčné populace od sebe odlišit metodou průtokové cytometrie. Kromě základních lymfocytárních populací můžeme stanovit i další, tzv. efektorové fáze vývoje T a B-lymfocytů (pomocí znaků, které se na těchto lymfocytech vyskytují při jejich aktivaci) nebo pomocí selektinových či chemokinových receptorů (umožňují vstup lymfocytů do uzlin). 21 Výsledkem základního imunologického vyšetření je procentuální zastoupení lymfocytárních populací ve vyšetřovaném vzorku. Součtem procentuálního zastoupení hlavních lymfocytárních populací v periferní krvi (T-lymfocytů, B-lymfocytů a NK-buněk) získáváme hodnotu, která se blíží 100%. Kromě procentuálního zastoupení lymfocytárních populací (tzv. relativní počet lymfocytů), je neméně důležitou hodnotou také tzv. absolutní počet lymfocytů, který nám udává reálný počet buněk dané populace v litru krve. Změny absolutního počtu lymfocytů jsou závislé na celkovém počtu lymfocytů a celkovém počtu leukocytů v daném vyšetřovaném vzorku. Pokles počtu leukocytů a lymfocytů může vést ke snížení absolutního počtu lymfocytů, ačkoli relativní počty zůstávají v normálních hodnotách. Tyto hodnoty jsou důležité zejména u sledování počtu pomocných CD4+ T-lymfocytů u pacientů s HIV infekcí, kde snižující se počet těchto buněk v krvi odráží tíži klinického stavu pacienta. 2.2.1 T-lymfocytární subpopulace T-lymfocyty jsou tvořeny populacemi pomocných a cytotoxických T-lymfocytů. Obě tyto populace můžeme dále rozdělit na naivní (dosud se s antigenem nesetkaly), paměťové (vznikají po setkání se s antigenem), efektorové nebo efektorové paměťové T-lymfocyty (obrázek č. 5A). Obě efektorové subpopulace jsou v krvi běžného člověka zastoupeny ve velmi malém množství, neboť se vyskytují jen v místě probíhající infekce či zánětu a v krvi je tedy můžeme zachytit jen při jejich putování do cílového orgánu. Tento poměr se však může měnit u imunodeficitních stavů, těžce probíhajících infekcí či autoimunit. Jednotlivé subpopulace pomocných (CD3+ CD4+ ) nebo cytotoxických (CD3+ CD8+ ) T-lymfocytů můžeme stanovit pomocí protilátek proti CCR7 a CD45RA nebo CD45RO (obrázek č. 5). CCR7 je chemokinový receptor vyskytující se na naivních nebo paměťových T-lymfocytech, s jehož pomocí se lymfocyty dostávají do uzlin či sekundárních lymfatických orgánů. T-lymfocyty při své aktivaci tento receptor ztrácejí, což jim umožňuje vycestovat z uzlin a putovat do místa zánětu. Ztráta receptoru CCR7 tedy definuje tzv. efektorový stav T-lymfocytů. Efektorové T-lymfocyty jsou plně diferencované T-lymfocyty ve stádiích Th1, Th2, Th17 případně dalších forem Th-lymfocytů, které pošly celou aktivací T-lymfocytů prostřednictvím antigenu prezentovaného na APC. 22 Obrázek č. 5: T-lymfocytární subpopulace A) Dotplot subpopulací CD4+ T-lymfocytů. B) Histogram CD45RA+ T-lymfocytů. CD45RA je znak, který se vyskytuje na naivních T-lymfocytech, a CD45RO se vyskytuje na paměťových T-lymfocytech. Jedná se o produkt jednoho genu, který se v závislosti na vývojovém stádiu lymfocytu přepisuje v rozdílných formách. Při aktivaci T-lymfocytu se zkracuje délka proteinového řetězce tohoto antigenu, přičemž forma RA označuje nejdelší formu a RO výrazně kratší formu proteinového řetězce. Tento receptor je enzym tyrosin fosfatáza, která se podílí na přenosu intracelulárního signálu při aktivaci lymfocytu. Kombinací znaků CCR7 a CD45RA, nebo CCR7 a CD45RO můžeme definovat jednotlivé subpopulace pomocných i cytotoxických T-lymfocytů. Dalším důležitým znakem, označujícím T-lymfocyty odcházející z thymu, je znak CD31. S jeho pomocí můžeme definovat tzv. „recent thymic emigrants“ neboli CD31+ T-lymfocyty. Jejich nepřítomnost je důležitým pomocným markerem při diagnostice pacientů s těžkým kombinovaným imunodeficitem (SCID). Zastoupení zejména naivních a paměťových T-lymfocytů se mění v závislosti na věku pacienta. U novorozenců, kojenců a dětí převažují naivní T-lymfocyty, v seniorském věku pak paměťové T-lymfocyty. V rámci efektorových populací dále můžeme stanovit aktivované T-lymfocyty pomocí znaku HLA-DR, znak CD57 nalezneme na tzv. vyčerpaných (exhausted) T-lymfocytech. S chronickou aktivací se rovněž zvyšuje exprese PD-1 na těchto buňkách. PD-1 receptor (Programmed cell Death-1) po vazbě na PD-1 ligand (PD-L1) aktivuje apoptózu u lymfocytů. Jedná se o regulaci počtu, případně nadměrné funkce efektorových T-lymfocytů. PD-L1 může být po aktivaci exprimován na buňkách endotelu, makrofázích, monocytech, neutrofilech či 23 dalších buňkách. Zvýšené počty CD57+ a PD-1+ T-lymfocytů nacházíme u pacientů s chronickými záněty. 2.2.2 B-lymfocytární subpopulace Rovněž u B-lymfocytů můžeme v periferní krvi identifikovat některá z jejich vývojových stádií. Definujeme je pomocí monoklonálních protilátek proti znaku CD27, membránovému IgD nebo IgM, CD38 a CD21. Vývojově nejmladší B-lymfocyty jsou nazývány transientní B-lymfocyty s fenotypem CD19+IgMhighCD27-CD38high. Pokud mají tyto buňky navíc nízkou expresi CD21 a IgD, jedná se o nejmladší formu transientních B-lymfocytů (tzv. T1 B-lymfocyty). Při dalším dozrávání začínají transientní B-lymfocyty exprimovat IgD a CD21 a stávají se z nich T2 B-lymfocyty. Obě formy transientních B-lymfocytů dozrávají ve slezině nebo v sekundárních lymfatických orgánech v naivní B-lymfocyty (IgM+IgD+CD27-). Naivní B-lymfocyty putují krevním řečištěm do uzlin či sekundárních lymfatických orgánů a hledají svůj specifický antigen. Po setkání se „svým“ antigenem se z nich stávají IgM paměťové B-lymfocyty (IgM+CD27+). Při další aktivaci B-lymfocytů za pomoci CD4+ folikulárních pomocných TFH-lymfocytů a folikulárních dendritických buněk v germinálním centru se ze sekundárních lymfatických orgánů dostávají do krve izotypově přepnuté paměťové B-lymfocyty (IgM-CD27+) a plasmablasty (CD19lowIgM-CD27highCD38high). Plasmablasty putují do kostní dřeně, kde se usazují jako plazmatické buňky (CD19-IgM-CD38highCD138high). V této chvíli také ztrácejí typické znaky pro B-lymfocyty (CD19 a CD20). Znak CD21 (jedná o receptor pro C3d, také označovaný jako CR2; tento receptor také využívá virus Epsteina-Barrové) je normálně přítomen na všech vývojových stádiích B-lymfocytů kromě T1 B-lymfocytů a plasmablastů či plazmatických buněk. Ve zvýšené míře je exprimován na B-lymfocytech marginální zóny, které mají podobně jako IgM paměťové B-lymfocyty fenotyp IgM+CD27+. V krvi pacientů s autoimunitními chorobami, s CVID či hepatitidami někdy nacházíme subpopulaci CD21lowCD38low B-lymfocytů. Jejich vyšší procento můžeme nalézt také u starších osob. Jedná se zřejmě o B-lymfocyty, které při svém vývoji do paměťových forem unikly apoptóze při selekcích v germinálních centrech. U osob s autoimunitními onemocněními jsou částečně odpovědné za produkci autoprotilátek. Zastoupení subpopulací B-lymfocytů se podobně jako u T-lymfocytů liší v závislosti na věku pacienta. V pupečníkové krvi, u novorozenců a kojenců nacházíme převahu 24 transientních B-lymfocytů. K jejich dozrávání dochází postupně s věkem a to do naivních B-lymfocytů a dalších paměťových B-lymfocytárních subpopulací. U kojenců a batolat také můžeme pozorovat zvýšenou tvorbu plasmablastů, která je dána reakcí imunitního systému na styk s běžnými patogeny, proti kterým si děti vytvářejí protilátky, které jsou už u dospělých běžně přítomny. Chybění zejména paměťových forem B-lymfocytů a plasmablastů u dospělých osob může být známkou imunodeficitu. Přítomnost zejména paměťových forem B-lymfocytů podává informaci o funkčnosti pomocných CD4+ T-lymfocytů, které pomáhají B-lymfocytům při vyzrávání izotypově přepnutých paměťových forem do stádia plasmablastů a plazmatických buněk. Při významném úbytku CD4+ T-lymfocytů nebo při jejich nefunkčnosti (u pacientů s imunodeficity), dochází k přerušení vývoje izotypově přepnutých paměťových B-lymfocytů a v krvi pacientů nacházíme jen naivní formy či IgM paměťové B-lymfocyty, přičemž plasmablasty mohou chybět úplně. Obrázek č. 6: B-lymfocytární subpopulace A) Dot plot vyobrazující B-lymfocyty naivní (IgM+CD27-), IgM paměťové (IgM+CD27+) a izotypově přepnuté paměťové (IgM-CD27+). B) Dot plot vyobrazující B-lymfocyty transientní (CD24+CD38+) a plasmablasty (CD24-CD38++). 25 Jak už bylo dříve uvedeno, průtoková cytometrie se v imunologické vyšetření nejčastěji používá ke stanovení procentuálního zastoupení jednotlivých lymfocytárních populací, ale je možné ji využit také ke kvantimetrickému stanovení. Jedná se o stanovení založeném na měření meanu intenzity fluorescence (MFI) pro daný fluorochrom konjugovaný s protilátkou. MFI představuje střední hodnotu intenzity fluorescence, která je přímo úměrná navázanému množství protilátek na sledovaný receptor. Měření MFI můžeme využit pro sledování míry exprese receptoru, například se při sepsích zvyšuje exprese CD64 na neutrofilech, u monocytů se na jejich povrchu snižuje exprese HLA-DR, při monitorování exprese CD274 při sledování účinnosti léčby pomocí monoklonální protilátky anti-PD-L1 (CD274) na nádorových buňkách a podobně. Průtoková cytometrie se využívá nejen k imunologickému a hematologickému vyšetření lidí, ale má také široké využití ve veterinární medicíně, v biologii, mikrobiologii apod. 2.3 Funkční testy v laboratoři buněčné imunologie V rámci sledování parametrů buněčné imunity nás kromě počtu jednotlivých buněčných subpopulací zajímá také jejich funkčnost. Specifické funkční testy často vyžadují izolaci některé z lymfocytárních subpopulací. Například sledování proliferace T-lymfocytů vyžaduje izolaci PBMC nebo přímo T-lymfocytů, produkce protilátek izolaci PBMC nebo přímo Obrázek č. 7: B-lymfocytární subpopulace A) Dot plot znázorňující transientní B-lymfocyty T1 a T2. B) Subpopulace CD21low B-lymfocytů. 26 B-lymfocytů, produkce cytokinů izolaci T-lymfocytů a stanovení cytotoxicity izolaci cytotoxických CD8+ T-lymfocytů nebo NK buněk. Po izolaci buněk následuje in vitro kultivace v různých typech kultivačních desek v závislosti na počtu buněk, době kultivace a spotřebě kultivačního média. Kultivace zpravidla probíhá v kultivačních médiích, která mohou obsahovat různé látky (růstové faktory, cytokiny a podobně), a to za vhodných podmínek (při teplotě 37 °C v atmosféře CO2). 2.3.1 Aktivace buněk V závislosti na konkrétním funkčním testu jsou používána různá stimulancia. Pro vyšetření aktivace a proliferace T-lymfocytů nespecifickým mitogenem se často používají tzv. polyklonální mitogeny, které se vážou na specifické membránové sacharidy a aktivují buňky bez závislosti na jejich antigenní specificitě. Příkladem takovýchto mitogenů působících na T-lymfocyty jsou phytohemagglutinin (PHA) a concanavalin (ConA). B-lymfocyty i T-lymfocyty aktivuje pokeweed mitogen (PWM). Lipopolysacharid (LPS, endotoxin) aktivuje především B-lymfocyty, ale při delším působení se aktivují prostřednictvím B-lymfocytů i T-lymfocyty. Dalším možným způsobem stimulace T-lymfocytů je využití monoklonálních protilátek anti-CD3 společně s anti-CD28. Všechny lymfocyty je možné aktivovat také pomocí phorbol myristát acetátu (PMA) a ionomycinu (IM), kdy obě tyto složky působí jako nízkomolekulární aktivátory signálních drah. PMA a ionomycin pronikají přes buněčnou membránu do nitra buňky. PMA je přímý stimulátor proteinkinázy C a ionomycin působí na vápníkovou pumpu. PMA a IM působí jako velice silné aktivátory buněk a zejména při aktivaci ionomycinem často dochází k jejich předčasnému usmrcení. K aktivaci lymfocytů je možno také použít specifické antigeny (například tetanus, virus varicely, pneumokoky, kandidy a podobně). Stanovení odpovědi na specifické antigeny může sloužit ke sledování odpovědi pacienta na očkování daným antigenem. Nevýhodou této specifické stimulace je aktivace a proliferace jen malého množství lymfocytů. 2.3.2 Blastická transformace lymfocytů Termín blastická transformace vznikl na základě sledování morfologických změn lymfocytů při proliferaci. Při přeměně klidových lymfocytů na proliferující lymfocyty dochází k výraznému zvětšení buněk včetně podílu cytoplazmy uvnitř buněk. Buněčný cyklus zahrnuje následující fáze: G0, G1, S, G2 a M fázi. G0 fáze je klidovou fází buněčného cyklu. Při aktivaci 27 buňky přecházejí do fáze G1. Při ní se přepisují geny a syntetizují se enzymy a nukleotidy potřebné pro replikaci DNA. G1 fáze zaujímá 30–40 % délky buněčného cyklu. Jakmile jsou připraveny potřebné enzymy a nukleotidy, přechází buňka do S fáze, při které probíhá syntéza DNA. Tato fáze zaujímá 30–50 % délky buněčného cyklu. Po dokončení syntézy DNA vstupuje buňka do G2 fáze. V této fázi probíhá syntéza a aktivace proteinů zodpovědných za kondenzaci chromozomů, tvorbu mitotického aparátu a destrukci jaderného obalu. G2 fáze představuje 10– 20 % délky buněčného cyklu. Poslední fází buněčného cyklu je M-fáze, neboli mitóza. Při ní dochází k rozdělení jádra a jadérka (karyogenezi) a poté k rozdělení cytoplazmy (cytokinezi). Při karyogenezi jsou chromozomy vzniklé v S fázi ohraničeny, přičemž každý duplikovaný (zdvojený) chromosom má dvě sesterské chromatidy, které obsahují identické kopie DNA. Sesterské chromatidy jsou spojeny po celé délce, později jsou poutány pouze v oblasti centromery. V průběhu mitózy se sesterské chromatidy od sebe oddělí a putují k opačnému konci buňky. Na konci mitózy dochází u lymfocytů k zaškrcení buňky od okrajů do středu a vzniku dvou dceřiných buněk, z nichž každá má své vlastní jádro. Pokud buňka obdrží signál k opakování buněčného cyklu, opět vstoupí do G1 fáze. Pokud mitogenní signál již přítomen není, buňka dále neproliferuje a vstupuje do klidové fáze G0. 2.3.3 Metody měření aktivace a proliferace lymfocytů K měření aktivace a proliferace lymfocytů se často používají cytometrické metody. Výhodou těchto metod je možnost měření více znaků zároveň, například stupeň aktivace jednotlivých T-lymfocytárních buněčných populací pomocí znaků CD69, CD71, CD25 a HLA-DR. Znak CD69 je nejčasnějším markerem aktivace. Při stimulaci pomocí PMA a IM dosahuje 80% exprese už po 4 hodinách aktivace. CD69 je selektinový receptor, který se podílí na udržení aktivovaného lymfocytu v lymfatické uzlině. Později se na povrchu T-lymfocytu objevuje receptor pro transferin (CD71) a následně také CD25 (řetězec receptoru pro IL-2) a HLA-DR. Proliferační test patří mezi funkční vyšetření T a B-lymfocytů. Kromě výzkumného využití jsou rutinně využívány zejména jako diagnostický test u pacientů s podezřením na těžký variabilní imunodeficit (SCID), u deficitu CD4+ T-lymfocytů nebo k monitorování imunosupresivní účinků onkologické léčby. Proliferační testy lze provádět různými způsoby. Mezi nejcitlivější metody řadíme inkorporaci triciem (3 H) značeného thymidinu a metodu DELFIA. V současné době se s výhodou využívá metody průtokové cytometrie, přičemž 28 stanovit proliferační aktivitu je možné několika způsoby. Je možné využít inkorporaci značených pyrimidinových bazí do DNA proliferujících lymfocytů. V těchto testech se používají syntetické analogy thymidinu: bromdeoxyuridin (BrdU) či 5-ethynyl-2´-deoxyuridin (EdU). Dále je možné proliferační aktivitu buněk sledovat pomocí kvantifikace blastů v procesu proliferace, kvantifikace celkové DNA pomocí interkalace (vmezeření se mezi jednotlivé báze DNA) speciálních barviv do DNA dělících se buněk. Další možnost představuje měření intracelulárních aktivačních markerů (Ki-67) či obarvení cytoplazmy nebo membrány buněk pomocí barev Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), PKH-26, CellVue Claret a dalších. Spolu se stimulovanými buňkami je třeba také sledovat nestimulované buňky, výsledky vznikají právě srovnáním obou typů buněk v závislosti na sledovaném markeru proliferace. Test proliferace pro jednoho pacienta probíhá nejméně ve dvou zkumavkách nebo jamkách. Pokud jsou použity izolované buňky nebo předem určený objem plné krve odebrané do heparinu, je v obou zkumavkách nebo jamkách stanovený počet buněk. V první zkumavce/jamce probíhá inkubace vzorku bez přídavku stimulancia, ve druhé s přídavkem definovaného množství stimulační látky. Případně mohou být použity další zkumavky s různými stimulancii, v závislosti na druhu testu. Současně s proliferací krve či buněk pacienta by měla být provedena proliferace stejným způsobem taky u zdravé kontrolní osoby. Izolované buňky nebo krev se inkubují v médiu, které obsahuje dostatek zásobních látek umožňujících proliferaci buněk po dobu zpravidla 72 hodin. Při stimulaci B-lymfocytů se doba inkubace prodlužuje na pět dní, přičemž v tomto případě je třeba si uvědomit, že současně přítomné T-lymfocyty se stimulují rychleji, je jich více a zpravidla díky tomu spotřebují životně důležité látky z média dříve, než se začnou množit samotné B-lymfocyty. Výsledkem pak může být falešně nižší naměřená proliferace B-lymfocytů. Metody měřící proliferaci Nejjednodušším stanovením proliferace je sledování počtu buněk po stimulaci ve srovnání s nestimulovanou kontrolou. Tato metoda je však zatížena velkou chybou, proto se v praxi příliš nepoužívá. Zlatým standardem detekce proliferace je dlouhodobě používána metoda sledující inkorporaci triciem značeného thymidinu (3 H thymidin), který se přidává do média 12–24 hodin před ukončením inkubace. 3 H thymidin se během inkubační doby zabudovává jako jeden 29 ze základních kamenů do DNA proliferujících buněk. Po ukončení inkubace se proliferující buňky zamrazí a poté rozmrazí, čímž dojde k jejich rozpadu. Vzniklá směs je filtrována přes speciální filtrační papír, na kterém je pak zachycena buněčná drť a s ní i DNA se zabudovaným thymidinem značeného triciem. Filtrační papír je poté vložen do scintilační tekutiny a měří se počet záblesků, který je dán množství navázaného tricia v proliferujících buňkách. Scintilace je fyzikální jev, při kterém vznikají slabé světelné záblesky. Tyto záblesky jsou způsobeny dopadem ionizujícího záření na povrchy některých anorganických či organických látek, které nazýváme scintilátory. Při dopadu ionizujícího záření na scintilátor, či scintilační tekutinu, vniká cizí iont do krystalické mřížky scintilátoru, čímž se excitují elektrony krystalu a při jejich následné deexcitaci dochází k emisi fotonů viditelného světla, čili světelného záblesku. Počet záblesků se měří pomocí tzv. β-counteru. Výsledkem se udává jako počet záblesků za minutu (jednotka cmp; z anglického „counts per minute“) nebo jako proliferační index, což je poměr mezi množstvím záblesků ve stimulované a nestimulované zkumavce. Počet záblesků je závislý na množství navázaného thymidinu v proliferujících buňkách. Jedná se o metodu s vysokou citlivostí, avšak s vysokými náklady na přístrojové vybavení. Jednou z levnějších metod je měření celkové DNA pomocí interkalačních sond, jako jsou ethidium bromid, propidium jodid (PI) nebo hexidium jodid a podobně. Tato barviva s červenou fluorescencí se vmezeří mezi páry bází dvojité šroubovice DNA. Protože DNA je uvnitř jádra buňky, je třeba před přídavkem tohoto barviva buňky fixovat a permeabilizovat. Zároveň je nutné odstranit RNA přídavkem ribunukleázy (RNázy štěpící řetězce RNA), protože dochází i k nespecifickému obarvení této nukleové kyseliny. Výsledkem je stanovení počtu buněk v jednotlivých fázích buněčného cyklu. Měření proliferace pomocí PI nedává informaci o nově syntetizované DNA a nekoreluje se stanovením inkorporace 3 H thymidinu. K měření proliferace metodou obarvení cytoplazmy nebo membrány buněk se používá zelené fluorescenční barvivo označující bílkoviny Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) a červené fluorescenční lipofilní membránové barvivo PKH26, CellVue Claret a podobně. Tato barviva se liší ve svých chemických a fluorescenčních vlastnostech. Membránová barviva (PKH26 a CellVue Claret) jsou vysoce lipofilní barviva, která se stabilně, ale nekovalentně zachycují v lipidech buněčných membrán. Proteinové barviva (CSFE), kterými jsou typické amino-reaktivní sloučeniny, tvoří stabilní kovalentní vazby s buněčnými proteiny. CSFE je lipofilní molekula, která dokud není transportována do buňky, vykazuje jen minimální fluorescenci. CSFE proniká do buňky pasivní difuzí. Buněčné esterázy štěpí acetylové skupiny CSFE a vzniklý produkt (succinimidyl ester) se stává výrazně fluorescenční. Tento ester se 30 kovalentně váže k volným aminoskupinám na makromolekulách v cytoplazmě. Jak toto proteinové, tak výše uvedená membránová barviva zbarvují buňky jasnou homogenní fluorescencí. Intenzita fluorescence při každém následujícím dělení klesá u dceřiných buněk přibližně na polovinu. Proto porovnáním původní a konečné intenzity fluorescence vyšetřovaných buněk získáme informaci také o počtu dělení, kterým vyšetřované buňky prošly. Ze znalosti počtu dělení a relativního počtu buněk v každé dceřiné generaci lze zpětně vypočítat počet buněk v původní populaci (tj. buněk přítomných v době stimulace), které se následně začaly dělit. Pomocí těchto informací lze vypočítat rozsah expanze prekurzorových buněk na zkoumaný specifický antigen nebo buněčný mitogen. Nevýhodou barvení CSFE je relativně vysoká cytotoxicita. Podobně probíhá značení i vyhodnocení proliferace při použití membránových barviv PKH26, CellVue Claret a dalších. Mezi další metody sledování buněčné proliferace patří metoda inkorporace bromdeoxyuridinu (BrdU), při které se vyžívá zabudování značených pyrimidinových bazí do DNA dělících se buněk s následným měřením pomocí průtokové cytometrie. Ve standardním BrdU testu se buňky společně se stimulancii inkubují také s BrdU. Následně je provedena denaturace DNA pomocí enzymů, kyseliny nebo tepla tak, aby byla umožněna detekce zabudovaných molekul BrdU pomocí protilátek anti-BrdU. Používané metody denaturace DNA mohou negativně ovlivnit morfologii buněk a rozpoznávání antigenů, stejně jako kvalitu obrazu při cytometrickém měření. Denaturační činidla rovněž omezují schopnost BrdU vázat se s fluorescenčními proteiny (např. GFP, RFP, mCherry) nebo fluorescenčními barvami na bázi phycoerythrinu, které se pravidelně používají v mikroskopickém zobrazování nebo v průtokové cytometrii. Vylepšením BrdU testu je metoda Click-iT® Plus EdU, kdy se v průběhu aktivní syntézy DNA začleňuje do jejího řetězce analog thymidinu EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridin) obsahující alkiny. Vložený EdU obsahuje ve své ethynylové části alkyn. Při konečném zpracování se k buňkám přidají fluorescenčními barviva, např. Alexa Fluor® nebo Pacific Blue™ obsahující pikolyl azidovou skupinu, která se váže na alkyn v EdU tzv. azid-alkynovou cykloadicí (tzv. přepínací reakcí neboli kliknutím, která dala metodě název). Reakce je katalyzovaná měďnatými ionty. Standardní fixace buněk na bázi aldehydu a jejich následující permeabilizace pomocí detergentu postačí k tomu, aby detekční činidlo obsahující fluorescenční barvu s pikolyl azidem získalo přístup k EdU v DNA. Není tedy třeba žádných tzv. tvrdých denaturantů. Nově syntetizovaná DNA může být detekována a kvantifikována za použití obrazových technik nebo průtokové cytometrie. 31 Velice citlivou alternativou k měření proliferace pomocí BrdU je měření proliferace metodou DELFIA, (z anglického „Dissociation-Enhanced Lanthanide Fluorescent ImmunoAssay“), která je založena na časově modulovaném měření fluorescence (TRF; z anglického „time-resolved fluorescence“). Metoda je založen na inkorporaci bromdeoxyuridinu (BrdU), při které se vyžívá zabudování značených pyrimidinových bazí do DNA dělících se buněk. Pro detekci proliferujících buněk se používají anti-BrdU protilátky značené fluorescenční sondou, což bývá stabilní chelát lanthanidu (nejčastěji europia - Eu). Po přídavku europiem značené protilátky dochází k její vazbě na BrdU zabudovaný v DNA. Po ukončení inkubace s protilátkou následuje promytí, čímž se odstraní přebytek nenavázané protilátky. Dalším reakčním krokem je přídavek ligandu β-diketonu. Tato část reakce probíhá v kyselém prostředí, které způsobí odtržení europia, a na jeho místo se v chelátu naváže přidávaný ligand. Nově vzniklá sloučenina vykazuje intenzivní fluorescenci, která je dlouhodobá (řádově stovky mikrosekund) a navíc s velkým rozdílem mezi vlnovou délkou excitace a fluorescence (Stokesův posun). Měření probíhá na přístroji EnSight, kde je vzorek pulzně excitován vlnovou délkou světelného záření (např. vlnovou délkou 340 nm). Záření se pak elektronicky měří se zpožděním, jakmile vyhasne fluorescence pozadí. Měření záření se provádí opakovaně během přednastaveného časového intervalu (za 1 s lze získat až 1000 měření). Výsledkem je (podobně jako u metody inkorporace thymidinu) počet impulsů, který se zvyšuje s počtem proliferujících buněk. 32 V současné době se často používá k měření proliferace detekce jaderného proteinu Ki-67. Tento protein je exprimován během všech aktivních fází buněčného dělení, avšak není exprimován v klidové fázi G0. Toto měření je relativně jednoduché, neboť nevyžaduje přídavky dalších reagencií během inkubační doby proliferačního testu. Výsledkem vyšetření je procento Ki-67 pozitivních lymfocytů. Nevýhodou této metody je, že protein Ki-67 se exprimuje už v G1 fázi buněčného cyklu, kdy se buňka k proliferaci teprve chystá, ale nemusí ji ještě dokončit (například při selektivním působení cytostatik). Z tohoto důvodu je zapotřebí v rámci kontroly správnosti výsledku tohoto měření sledovat také velikost a počet proliferujících buněk, přičemž oba tyto parametry by měly při úplné proliferaci lymfocytů stoupat. Ki-67 se také stanovuje jako diagnostický znak pro některé typy nádorů (karcinom, prsu, prostaty a další). Protože se jedná o protein vnitřku buněčného jádra, je třeba k jeho měření použít fixaci a permeabilizaci buněk. Tato metoda zpracování (tedy fixace a permeabilizace) se používá ve většině metod vyšetření proliferace a dále např. při měření cytokinové produkce leukocytárních populací pomocí průtokové cytometrie. Obrázek č. 2: Buněčný cyklus a proliferační sondy Různé metodiky meření proliferace se vyznačují odlišnou dynamikou ve vztahu k buněčnému cyklu. Zatímco jaderný protein Ki-67 (červená) je exprimován ve všech fázích buněčného cyklu (nikoli v G0 fázi), Brdu či interkalační sondy (zelená a modrá) cílí na inkorporaci či interkalaci do nově vznikající DNA během S fáze. 33 Intracelulární stanovení antigenů Cytometrické stanovení intracelulárních proteinů je založeno na permeabilizaci buněčné membrány, při které se detekční protilátky (zpravidla konjugované s fluorochromy) navazují na struktury uvnitř buněk nebo buněčného jádra. Aby při permeabilizaci nedocházelo k úniku buněčného obsahu přes porušenou buněčnou membránu, je třeba buňky nejprve fixovat. K tomu se používají alkoholy nebo aldehydy. Fixace buněk: Alkohol, aldehyd paraformaldehyd Alkoholy (obvykle ethanol nebo methanol) jsou precipitační nebo denaturační fixační látky, které koagulují proteiny. Rozpouštějí také lipidy, což vede k tvorbě relativně velkých pórů v plazmatických i jaderných buněčných membránách. Alkoholy jsou vhodné pro analýzu DNA. Koagulace proteinů kolem DNA totiž umožňuje rovnoměrný přístup barvivu, což vede k dobrému variačnímu koeficientu při měření intenzity fluorescence pro jednotlivé píky Obrázek 3: Intenzita fluorescence u metodik CSFE a Ki-67 Proteinové barvivo CSFE zbarvuje homogenně buněčnou cytoplazmu a v průběhu buněčného dělení je i CSFE děleno mezi dceřinné buňky. S každým dělením intenzita fluorescence klesá přibližně o polovinu vzhledem k buňce mateřské. Naproti tomu Ki-67 protein je exprimován pouze v jádře buněk, přičemž jeho množství stoupá v pořadí G1