MUNI MED Genetická podmíněnost nemocí doc. RNDr. Monika Pávkova Goldbergová, Ph.D. Historie • brněnský kněz a středoškolský profesor Johann Gregor Mendel se zabýval křížením různobarevných odrůd hrachu Genotypové zákony: o Zákon o samostatnosti alel Genotyp je soubor samostatných genů určujících znaky. Každý znak je určen dvojicí samostatných alel. o Zákon o segregaci alel Dvojice samostatných alel se při zrání rozcházejí a do každé gamety přechází jedna z obou alel. o Zákon o nezávislé kombinaci alel • Fenotypové zákony o Zákon o uniformitě hybridů Křížíme-li dominantního homozygota s homozygotem recesivním, jsou jejich potomci Fl generace v sledovaném znaku všichni stejní. Reciproká křížení u jakýchkoliv jedinců Fl generace dávají shodné výsledky. o Zákon o štěpení v potomstvu hybridů Při křížení heterozygotů lze genotypy a fenotypy vzniklých jedinců vyjádřit poměrem malých celých čísel. Vzniká genotypový a fenotypový štěpný poměr. Genetika specializovaný biologický obor zabývající se variabilitou a dědičností o klinická genetika • zabývá se genetikou patologických stavů • zabývá se diagnostikou, léčením a prevencí genetických nemocí (u celé rodiny!) • genetické poradenství o lidská genetika • studuje variabilitu a dědičnost u člověka o cytogenetika • studium chromozomů o molekulární genetika • studium struktury a funkce jednotlivých genů o populační genetika • studium proměnlivosti populací o komparativní a evoluční genetika • mezidruhové srovnání a studium evoluce druhů společný předek moderní primáti č lověk • studuje strukturu a funkci genomu pomocí genetického mapování, sekvenování a funkční analýzy genu • snaží se o pochopení veškeré informace obsažené v DNA živých organizmů o strukturní genomika = pochopení struktury genomu • konstrukce detailních genetických, fyzických a transkripčních map genomů příslušných organizmů • reprezentovala zejména iniciální fázi analýzy genomů; konečným cílem byla kompletní znalost DNA sekvence (např. HUGO projekt) o bioinformatika = shromažďování, analýza a vizualizace biologických souborů dat • využívá metod výpočetní techniky, tvorba databází a softwarů o funkční genomika = studium funkce genů a ostatních částí genomu • využívá poznatků strukturní genomiky a snaží se o poznání funkce genů; velmi často k tomu využívá modelové organizmy (kvasinka, nematoda, Drosophila melanogaster, Mus musculus, Rattus norvegicus, Mesocricetus auratus aj.) jako časově a finančně výhodnou alternativu vyšších živočichů (zejm./Ďro možnost studovat mnoho generací v relativně krátkém čase) Základní genetické pojmy gen, alela, genom, chromozom lokus alely dominantní recesivní homozygot heterozygot genotyp fenotyp tím Gene Alleles Geře "Locus Homologous Chromosomes entromere regio DNA-histone fiber DNA Gene Gene DNA and proteins are multi-folded Homologous chromosomes A DfiAWrapBas ic_witJnR(QLmp4 Chromozomální podstata dědičnosti * DNA, RNA, proteiny DNA: nese potřebnou informaci potřebnou pro regulaci vývoje, růstu, metabolismu a reprodukce složena z nukleotidů (zbytek kys. fosforečné, deoxyribóza a dusíkatá báze [A, G, C, T]) • DNA kostra - polynukleotidový řetězec • zbytky deoxyribózy a kys. fosforečné spojené fosfod i esterovou vazbou • DNA dvojšroubovice - 2 polynukleotidové řetězce v opačné orientaci • jedno vlákno v 5' -> 3' směru, druhé opačně • vodíkové vazby mezi páry bází (A=T, G=C) RNA: transport informace z jádra do cytoplazmy proteiny: základní stavební kameny Molekulárně biologické dogma Centrální dogma DNA RNA => Protein DNA do DNA REPLIKACE FenOtyp DNA do RNA TRANSKRIPCE RNA do Protein TRANSLACE mu RNA do DNA REVERZNÍ TRANSKRIPCE Jeden gen jeden enzym (protein/polypeptid) molekula DNA jako taková byla objevena v roce 1869, kdy se švýcarskému lékaři Friedrich Miescherovi podařilo vyizolovat DNA z bílých krvinek 1962 obdrželi společně Francis Crick, James Watson a Maurice Wilkins Nobelovu cenu za fyziologii a lékařství. Rosalyn Franklin se pro tragické úmrtí této ceny nedočkala. Nukleosid x nukleotid x báze x DNA Gen základní jednotka dedičnosti konkrétní úsek molekuly DNA nesoucí informaci pro tvorbu proteinu nebo NA (rRNA, tRNA...) • geny strukturní • geny pro RNA geny regulační (promotory) • exony = funkční úseky genu, které jsou přepisovány do mRNA a dále translantovány při proteosyntéze introny = úseky genu, jejichž funkce dosud nebyla zcela objasněna a které nejsou využívaný pro translaci Dle jejich obsahu geny dělíme na: jednoduché - obsahují pouze exony složené - obsahují i introny genové rodiny = sekvenčně podobné geny, které vznikly zřejmě duplikací během evoluce, např. geny pro (hemo)globiny, imunoglobuliny... Gen (ONA) . bamcnpl (RNA) "Matwe"lranskfipl(mRNA)__ T Transkripce Spkang (sestřih) Translace OOCXXKÍ03 Struktura genu Enhancer (distal) Promoter (proxim al) ■ JUJ tip Introny a Exony Promotor Enhancer a Silencer Počátek transkripce Transkripciu faktoiy Signální sekvence TATA box i i qno I sequence Enhancer (distal) MS Eaon htrcn DNA-binding site for activator TATA GENE Figure 7-44. Molecular Biology o^f the Cell, 4th Edition. Introny a Exony: Kódující sekvence (ORF) mnoha eukaryotických genů je přerušená sekvencí známou jako introny. Introny jsou úseky DNA jejichž transkripty nejsou přítomný ve zralé mRNA. Exony jsou části sekvence přítomné ve zralé mRNA a kódují produkt eukaryotického genu. Struktura genu Místo počátku transkripce: místo kde začíná syntéza mRNA (pozice O, -30bp od TAXA boxu) . Promotor: Oblast genu (5'-konec) upstream od místa počátku transkripce a iniciaci ind uktoru < provozní sloužící jako templát pro navázání transkripční jednotky transkripce. Inducibilní promotor — je závislý na přítomnosti {nízkomolekulární látka). Konstitutivní promotor — nezávislý „house keeping" geny). Enhancer Část sekvence genu která interaguje s transkripčními faktory a tak zvyšuje účinnost transkripce. Je umístěna upstream nebo downstream od kódující sekvence a může být stovky bází daleko od kódující sekvence kterou kontroluje. Silencer: Opak enhanceru. Transkripční faktory: Rroteiny interagující se specifickou sekvenci DNA, většinou ovlivňující terciální strukturu DMA a tak regulují transkripční jednotku. Jsou bud aktivátory nebo represory viz výše. Koaktivátory: Proteiny interagující s transkripčn ími faktory ■} Stop UOÄ Stop A UUG Leu UCG Ser UÄS Stop UGG Trp G CUU Leu CCU Pro CAU His CGU Arg U CUC Leu CCC Pro CAC His CGC Arg C CUA Leu CCA Pro CAA Gin CGA Arg A CUG Leu CCG Pro CAG Gin CGG Arg G AUU lle ACU Thr AAU Asn AGU Ser U AUC lle ACC Thr AAC Asn AGC Ser C AUA lle ACA Thr AAA Lys AGA Arg A AUG Met ACG Thr AAG Lys AGG Arg G GUU Val GCU Ala GAU As p GGU Gly U GUC Val GCC Ala GAC As p GGC Gly C GUA Val GCA Ala GAA Glu GGA Gly A GUG Val GCG Ala GAG Glu GGG Gly G • určuje pořadí AK v proteinu • univerzální • podobný princip u většiny živých organizmu • tripletový • trojkombinace z celkem 4 nukleotidů (A, C, G, T) • degenerovaný • 43 = 64, ale aminokyselin jen 21 Chromatin x chromatida x chromozom DNA je organizována v chromozomech • chromatin + chromozomální proteiny (histony) chromozom =olineární sekvence genu přerušovaných nekódujícími úseky v nedělící se buňceje chromatin rozprostřen volně v jádře u dělící se organizuje dg viditelných chromozomu struktura chromozomu • centromera • telomery (raménka) • dlouhé - q • krátké - p dvě kopie daného chromozomu po replikaci (před dělením) = sesterské cnromatidy Short region of DNA double helix 'Beads on a string" form of chromatin 30-nm chromatin fibre of packed nucleosomes Section of chromosome in an extended form Condensed section of chromosome 11 nm 30 nm Entire mitotic jtBftfltfBX I chromosome 1 ,.;C3 nm Karyotyp člověka každý biologický druh má svou charakteristickou chrom, výbavu (počet a morfologii) = karyotyp • u člověka rnají somatické diploidní bb. 46 chromozomu • 22 párů homologních autozomů • 1 pár gonozomů (44XX nebo 44XY) • gamety (vajíčko, spermie) 23 - haploidní • standardní klasifikace číslováním podle velikosti zpracování vzorku buněk pro karyotyp • nejlépe hodnotitelné jsou kondenzované chromozomy v metafázi nebo prometafázi mitózy • lymfocyty perif. krve nutno uvést do mitózy mitogenem a zastavit v metafázi např. colchicinem • barvením chromozomů (např. Giems) se dosáhne charakteristického pruhoyánía tím rozlišení jednotlivých chromozomu hodnocení karyotypu • manuální - obarvený chromozómový "rozptyl" (nejč. mitotické lymfocyty nebo bb. plodové vody) se po obarvení vyfotí, vystřihnou a seřadí do páru • automatizované (mikroskop + software) ) *' li Y\7 § \ ■ p ■ i m L 1 h 1 l \ 1 i í i : i t 1 ■ 1 g 1 I 1 f l í 3 t 1 ä 1 j 1 1 2 3 4 5 e 7 S 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1fl 19 20 21 22 X Y Dělení buněk MEIOSIS paternal homolog maternal homolog MITOSIS I DNA REPLICATION DNA REPLICATION | PAIRING OF DUPLICATED HOMOLOGOUS CHROMOSOMES BIVALENTS LINE UPON THE SPINDLE 24 DUPLICATED CHROMOSOMES LINE UP INDIVIDUALLY ON THE SPINDLE CELL DIVISION Mitóza = 2 dceřinné buňky s diploidním počtem chromozomů, 1 cyklus DNA replikace následuje rozdělení chromozomů a jádra (profáze —» prometafáze —» metafáze —» anafáze —» telofáze) a násl. celé buňky (cytokineze) Meióza = 1 cyklus replikace následován 2 cykly segregace chromozomů a buněčného dělení 1 .meiotické (redukční) dělení - rozdělení homologních chromozomů významné - odehrává se zde meiotický crossing-over (rekombinace) - žádná z gamet není identická! poruchy rozestupu - např. trisomie 2.meiotické dělení - rozestup sesterských chromatid 2 dceřinné buňky s haploidním počtem chromozomů vznik pohlavních buněk (spermie, vajíčko) dodatečné promíchání genetického materiálu crossing-overem Mitoza - detail Interphase: I) \ A is doubled in preparation for cell division Prophase: The nuclear envelope breaks down and a spindle forms between two centrioles. I'rumrLiph. The chromosomes attach to the spindle fibers. Met a phase: The chromosomes align at the equator of the cell. Figure 1.3 Diagram of mitosis in animal cells. During interphase, the DNA is doubled in preparation for cell division. During prophase, the nuclear envelope breaks down and a spindle forms between the Lidský génom Gény 13.ĚOO 26 • Human Genome Project (HUGO) - James D. Watson v r. 2001 zveřejnění prvních výsledků (The first complete human genome was only decoded in 2007) haploidní genom obsahuje cca 3.3xl09 bp • gen = konkrétní úsek molekuly DNA nesoucí informaci pro tvorbu proteinu nebo NA (rRNA, tRNA...). ~ 21 tisíc genů (2011) pseudogen = sekvence DNA, která je podobná genu, ale nedochází k jejímu přepisování v RNA (transkripci) ~ 20 tisíc pseudogenů genom = soubor všech genů v jedné buňce, genom jaderný a mitochondriální (mtDNA) několik desítek genů kódujících proteiny zapojené v mitochondriálních procesech m; přenos pouze od matky! v jádru diploidní lidské buňky 22 párů chromozomů (autozomy) a pár pohlavních chromozomů X/Y (gonozomy) = karyotyp • hustota genů na jednotlivých chromozomech heterogenní pouze ~ 10 % kódující sekvence ~ 75 % se skládá z jedinečné (neopakující se) sekvence zbytek repetitivní sekvence nejasný funkce, zřejmě udržují strukturu chromozomů, možná jsou evofuční"rezervou octomilka C. elegans člověk rýže mih inu niii nm ::::: iiiii 19.500 30,000 45,000 kukuřice • • * t • ::: ■ * * a a • •«> • • *«> * 50,000 Mimojaderná DNA Í-r<3 Í-rO '8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 B 10 11 12 13 14 15 mitochondriální DNA původ: alfaproteobakterie pohlcena eukaryotickou buňkou • mnoho genů během evoluce bylo z mtDNA horizontálně přeneseno do buněčného jádra (geny v jádře kódující různé mitochondriální proteiny silně připomínají bakteriální proteiny) ~ 16,5 tisíce bp kóduje 37 genů o 24 genů pro různou nekódující RNA o 13 genů kóduje vlastní mitochondriální polypeptidy zapojené v mitochondriálních procesech (využívány během oxidatívni fosforylace) • maternální dědičnost • genetické analýzy: na základě mtDNA určena migrace lidstva - „mitochondriální Eva", která žila ~ před 140 000 lety v místech dnesšní Etiopie, Keni nebo Tanzanie Repetitivní sekvence Repetitivní sekvence = DNA s vysokým množstvím kopií • se podílí na formování vyšších nukleoproteinových struktur, jako jsou telomery nebo centromery • při chromozómových přestavbách, mají vliv na regulaci genové exprese při procesu zvaném RNA interference, zajišťují ochranu konců lineárních chromozomů, řídí správný průběh mitotického i meiotického dělení buňky • zřejmě udržují strukturu chromozomů, možná jsou "evoluční" rezervou rozptýlené o DNA transpozony (př. „Sleeping Beauty" - genová terapie) o retrotranspozony • endogenní retrovity = LTR • autonomní - LINE - Ll-repetice • neautomní - SINE - Alu-repetice • tandemové = za sebou jdoucí identické repetice, VNTR o mikrosatelity - opakování 1- 5 bp o minisatelity - v rozsahu kilobazí, které se více vyskytl oblastech chromozomů • genetické markery 28 Repetitivní sekvence-význam Huntingtonova chorea, fatální neurologické onemocnění s nástupem v dospělosti, projevující se jako demence s extrapyramidovou poruchou motoriky. V genu pro huntingtin je repetitivní sekvence (CAG)n, která kóduje úsek bílkoviny tvořený zbytky glutaminu (polyglutaminový úsek, polyglutamine tract). Za normálních okolností mají lidé méně než 20 trinukleotidů CAG a tedy i glutaminu v huntingtinu, kde tyto tvoří důležitou doménu pro interakce s jinými proteiny. Pokud se však mutací toto množství zvětší nad 30 glutaminu, protein nepracuje správně s výsledným progresivním odumíráním neuronů v nucleus caudatus. myotonické dytrofie (svalová dystrofie se svalovou slabostí provázenou paradoxně zvýšeným svalovým tonem) se nachází patologická expanze trinukleotidů CTG v 3' nepřekládané oblasti genu DMPK (dystrophia myotonica protein kinase). Mutantní mRNA má sama o sobě patogenní potenciál. ^^^^^^^^ expanze trinukleotidových repetic ,—, m V M Sewre neonaralhypororiB UWiepeals 29 Telomery a jejich funkce telomery - ochrana pro konce chromozomů spolu s proteiny během každého cyklu se 5 konec zkracuje (odstranění primery z okazakiho fragmentu) Hayflickův limit pro každou buňku telomery - mitotické hodiny repetice TTAGGG telomeráza - v zárodečných buňkách - v nádorových buňkách telomerázová terapie: nízkomolekulární inhibitory antisense oligonukleotidy RNA interference genová terapie imunoterapie zpoždění! Náture Reviews | Cancer 30 Gen x alela x genotyp x fenotyp • gen - základní jednotka dědičnosti • genové rodiny • sekvenčně podobné geny, které vznikly zřejmě duplikací během evoluce • např. geny pro hemoglobiny, imunoglobuliny, některé enzymy, ... • pseudogeny • podobné konkrétním genům ale nefunkční • každý gen je umístěn na konkrétním místě konkrétního chromozomu = lokus (např. 12q21.5) • lokalizace genů je u všech lidí stejná, sekvence ale ne! • alela - konkrétní varianta genu • v populaci se pro naprostou většinu genů yyskytuje vícero variant (= alel), které mohou "být různě časté = genetický polymorfizmus • genotyp - kombinace alel v určitém lokusu na paternálním a maternálním chromozomu diploidního genomu • haplotyp - lineární kombinace alel na jenom z homologních páru chromozomu • fenotyp - vnější projev (vyjádření) genotypu • znak - jednoduše měřitelná, většinou spojitá proměnná • fenotyp - sobor znaků • intermediární fenotyp - podobný znaku, ne vždy musí být spojitý GENOTYP HAPLOTYP CHm CHp CHm CHp Jak velký genom sdílí člověk s banánem? • 50% - 60% Most DNA is involved in production of proteins, enzymes for creating or breaking down sugars, for building cellular structures and processes, etc. etc. Structure of the hemoglobin pigment (a protein) has a lot of common code with the structure of the chlorophyll pigment, the same basic molecule structure was basically readapted for two very different functions lot of DNA has no function called "junk DNA." It's this junk DNA that's really a tell-tale sign of common ancestry. Why else would there be common sequences of base-pairs in the DNA, that are present in both species, but serves no function in either species? 90% identita savcu, 99,9% identita mezi lidmi 32 Genetická variabilita (—0.1%) nucleus divides into two daughter nuclei daughters subdivide into four i V. i'' 5s Chromosomes replicate Homologous chromosomes pair up Homologues swap sections of DNA Homologous pairs divide. Daughter nuclei have single chromosomes GAMETES Chromosomes divide. Gametes have single chromosomes and a new mix of genetic material DNA sekvence kódujících i nekódujících úseku genomu je variabilní v populaci pro daný gen vyskytuj^ vícero variant ( = aíel) s různou populační frekvencí = genetická variabilita, Která je 0 výsledkem několika procesu • 1) sexuální reprodukce • 2) nezávislé meiotické segregace • 23 párů ch. 5-» 223 kombinací = 8,388,608 různých gamet • 3) rekombinace (meiotický crossing-over) • >> kombinací než 8 miliónů • 4) mutageneze de novo • chyba při DNA replikaci • proof-reading DNA polymerázy ani mismatch DNA repair není 100% • působení externích mutagenů • 5) genetický drift • 6) přirozená selekce Crossing-over a rekombinace při meióze získává každá gameta náhodně 1 z páru homologního chromozomu - paternálního (CHp) nebo maternálního (CHm) při celkovém množství 23 páru je tedy teoreticky možných 223 kombinací (= 8,388,608 různých gamet) ve skutečnosti ale gameta obsahuje směs homologního CHm a CHp chromozomu v důsledku procesů během prvního meiotického děleni = crossing-overu a rekombinace • takže např. alely, které původně pocházely od různých prarodičů, mohou být na jednom chromozomu vzniká tedy mnohem vyšší počet kombinací než 8 miliónů pravděpodobnost rekombinace ale není pro každý úsek DNA stejná, ale záleží na vzdálenosti čím blíže jsou geny u sebe tím menší je pravděpodobnost rekombinace • vzdálenost se může udávat i v centimorganech (lcM = 1% pravděpodobnost rekombinace) existence haplotypů lineární kombinace alel (SNPs) na vícero sousedních lokusech jednoho z homologních chromozomů přenášená pohromadě (0 rekombinace) statistická asociace mezi DNA variantami na dané Chromatide se tedy vyskytují skupiny těsně vázaných variant = haplotypové bloky Vliv prostředí na lidský genom Genetická výbava jedince je sice osudově zadána v okamžiku zplození, ale není pro další život konečná, protože v průběhu života se může měnit jak pod vlivem četných faktorů epigenetických (vlivy prostředí), tak pod vlivem dalších faktorů genetických (např. mutacemi somatických buněk v průběhu maligní transformace). Biologické mutageny: onkogenní viry: adenoviry, herpes viry, virus Epsteina-Barrové, Rousův sarkomální virus a Rauscherův virus leukémie Fyzikální mutageny: záření (rentgenové, gama, UV - tvorba thymidinových dimerů) Chemické mutageny: organické, alkylační činidla (ATB), anorganické látky, alkaloidy, kationty těžkých kovů, peroxidy, dusitany, aromatické chlorované deriváty, volné radikály (O) Genetická proměnlivost • je zdrojem individuální variability (vytváří se nové kombinace alel): • segregace alel při vzniku gamet • rekombinace při crossing-overu • vznik náhodných kombinací alel při oplození Mutace • procesy, při kterých se mění počet alel (mění se kvalita a kvantita genů) • mutageneze = proces vzniku mutací • mutace = náhodné změny genotypu, změna genetické informace, poměrně vzácné Typy mutací (indukované nebo spontánní, ty mají četnost ~10"7, oprava polymerázou a proteinem p53): • Genové mutace • Chromozómové mutace = aberace • Genomové mutace Vzácné mutace a polymorfismus vzácné mutace - jsou výrazně patologické a tudíž jsou z populace odstraňovány selekcí, nebo vznikly nedávno a nestačily se v populaci rozšířit), vyskytuje se v populaci méně než v 1 % polymorfismus - častá mutace, tyto mutace jsou základem interindividuální variability jedinců, v jediném genu je často mnoho polymorfizmů, jejich kombinace tvoří haplotypy, vyskytuje se v populaci více než v 1 % - SNP = jednonukleotidový polymorfismus - bialelické - minisatelitní a mikrosatelitní polymorfismy - multialelické Germinativní a somatická mutace germinativní mutace - přenášeny na potomstvo (často příčinou zániku plodu), u potomka přítomny ve všech buňkách, mají vliv na vývoj druhu, „úspěšnost" germinativní mutace 1:100000 • somatické mutace - vznikají v somatických buňkách v průběhu života (maligní transformace x žádný fyziologický vliv) 37 Genové mutace • mění jednotlivé geny (alely), většinou jsou indukované • podstata je molekulární, mění se struktura DNA, ale nenarušuje se celistvost stavby chromozomu • v somatických nebo v pohlavních buňkách • mutace v regulačních genech pro množení a diferenciaci—^nádorového onemocnění • bodové mutace - substituce = záměna páru nukleotidu za jiný (—»změna AA sekvence, změna v regulaci, ovlivnění transkripce a translace... nebo tvorba STOP kodonu), transverze/tranzice, spíše v exonech • delece/inzerce = ztráta/zařazení nukleotidů (zmožný posun čtecího rámce), spíše v intronech 38 Genové mutace Srpkovitá anemie missense mutace genu pro hemoglobin na 6. pozici v Í3-řetězci (hydrofóbní valin místo hydrofilní glutamové kyseliny, tvorba shluků Hb a tím změna tvaru ery) —► HbS autosomálně recesivní ancestral mutant DNA -CTC- -CAC- mRNA -GAG- -GUG- AA -glu- -val- Srpkovité červené krvinky mnohem huř přenášejí kyslík. Lidé se srpkovitou anémií mají proto ve srovnání s obyčejnými lidmi červených krvinek víc. To jim dává proti malárii velkou výhodu, díky níž mají lepší šanci přežít. Genové mutace P° thalasemie • nonsense mutace pro Hb - chybná syntéza jednoho z řetězců globinu • autozomálně recesivní ancestral mutant DNA -AGT- -ACT- mRNA -UCA- -UGA- AA -ser- -STOP Huntingtonova choroba • trinukleotidová expanze ancestral mutant DNA ...TAC-GTC-... ...TAC-(( 2Q-GTC-... mRNA ...-AUG-CAG-... ...-AUG-(CAG-CAG-CAG)20-CAG-... AA ...-met-gln-... ...-met-(gln-gln-gln)20-gln-... Genové mutace Hemofílie A = nedostatek srážecího faktoru VIII • inzerce 3000 bp - snížení tvorby proteinu • gonozomálně recesivní - vazba na X chromozom • žena je přenašečka Genová mutace Cystická fibróza • deleční mutací genu produkujícího protein CFTR (chloridový ABC transportér na buň. membráně) —► nefunkční protein • delece 3 bp v pozici 1652 až 1655 v exonu 10 (delece phe v kodonu 508) • autozomálně recesivní Outside cell Mucus Mutant CFTR Channel xx>o© OOOOOOOOCCOOOCOoOO ocooooc Normal il^ CFTR Channel Inside cell o ° o o o ° • o o Chloride ions o 0 o 42 ancestral mutant DNA -TAG-AAA-CCA- -TA A-CCA- mRNA -AUC-UUU-GGU- -AUU-GGU- AA -ile- e-gly- -ile-gly- Genová mutace Duchennova svalová dystrofie • „frameshift" mutace = posun čtecího rámce v genu pro protein dystrofin • gonozomálně recesivní -vazba na X chromozom ancestral mutant DNA -CAC-TGT -CAC-TTG-T..- mRNA -GUG-ACA- -GUG-AAC-U..- AA -val-thr- -ile-gly- Extracellular matrix 43 Chromozómové mutace - aberace nemění strukturu samotných genu, ale mění strukturu chromozomu, dají pozorovat ve světelném mikroskopu mohou být překážkou normálního průběhu meiózy a jimi postižené gamety mohou být sterilní nebo mohou po splynutí vznikat neživota schopné zygoty. Strukturní chromozómové aberace • následkem chromozómových zlomů, na které navazuje určitá přestavba. Primární je tedy porucha struktury, přičemž původní množství genetického materiálu může - ale nemusí - být zachováno. Dělíme je na balancované (kdy je zachováno původní množství genetického materiálu) a nebalancované (kdy část genetického materiálu chybí či přebývá). deficience = ztráta koncové části chromozomu, oddělený kousek se rozpadne v cytoplazmě, dochází ke ztrátě genů, ztráta důležitých genů vede ke smrti • delece = ztráta vnitřní části chromozomu. • duplikace = zdvojení některých částí chromozomů • inverze = převrácení části chromozomu o 180° • translokace = přesun části chromozomu na jiný chromozom, může vést k vytvoření nového znaku fragmentace = rozpad na malé části 44 Genomové mutace Numerické chromozómové aberace • způsobeny abnormálním počtem chromozomů v karyotypu struktura chromozomů je neporušená, patologicky se uplatňuje nestandardní množství genů • vznikají díky chybě při rozchodu chromozomů do dceřiných buněk během buněčného dělení (nondisjunkce) nebo abnormalitami fertilizace či časné embryogenéze • aneuplodie - numerická odchylka se týká pouze určitého chromozomu nebo chromozomů, ne však celé sady. Konkrétní chromozom může být bud' znásoben - trisomie (3x - tři kopie chromozomu), tetrasomie (4x - čtyři kopie chromozomu), nebo naopak ztracen - monosomie (lx - jedna kopie chromozomu), nulisomie (Ox - žádná kopie chromozomu) Polyploidie - znásobena je celá chromozómová sada - porucha rozdělení celých sad nebo oplození spermiemi (dispermie]), u člověka přichází v úvahu zejména triploidie (3n = 69 chromozomů) a tetraploidie (4n = 92 chromozomů), většinou ale: • těhotenství je potraceno • molla hydatidosa (a pak těhotenství nutno ukončit potratem) • porod novorozence s triploidií - velmi časná letalita Genomové mutace 46 Aneuploidie (změna počtu chromozomu v sade) o monosomie • gonozomální • Turnérův sy. (45, XO) o trisomie • autozomální • Downův sy. (47, XX/XY +21) • Edwardsův sy. (47, XX/XY +18) • Patauův sy. (47, XX/XY + 13) • gonozomální • Klinefelterův sy. (47, XXY • XXX sy. • XYY sy. Short stature Low hairline Shield-shaped thorax Widely spaced nipples Shortened metacarpal IV Small finger nails — Brown spots (nevi) Characteristic facial features Fold of skin Constriction of aorta Poor breast development Elbow deformity Rudimentary ovaries Gonadal streak (underdeveloped gonadal structures) No menstruation polymorfizmus = existence několika (přinejmenším dvou) alel pro daný gen, z nichž nejméně častá má populační frekvenci alespoň 1% mutace = méně častá alela má populační frekvencí <1% pozor, existuje ale značná nejednotnost v terminologii - někdy se mutací myslí záměna v kódující oblasti genu a polymorfizmem záměna v nekódující, jindy např. mutací záměna vedoucí k rozvoji patologického fenotypu, polymorfizmem záměna bez patologického důsledku Most Variants Change a Single DNA Base: Single Nucleotide Polymorphism ("SNP") Person 1 Person 2 Person 3 '■li'ÉiÉM'rtéti ■'IiéMéMi'IéIM ylyáyyyylAly TATCG^GTACAG Klasifikace geneticky podmíněných nemocí • prakticky každá nemoc (ti. její vznik a progrese) je u daného jedinej modifikována genetickou výbavou, avšak s různým podílem na finá ním fenotypu • snad s výjimkou úrazů, závažných intoxikací a vysoce virulentních infekcí, kde individuální genetická konstituce nehraje prakticky žádnou roli • monogenní nemoci • jedna kritická "chyba" (tj. alela) konkrétního genu je^sama o sobě nejDO v homozygotní kombinaci téměř výhradne zodpovedný za rozvoj nemoci (fenotypu) nebo prenašečství a tedy zvýšenému riziku pro potomky • chromozomální poruchy • nejedná se o konkrétní chybu ale o nadbytek/nedostatek genu obsažených v celých chromozomech nebo jejich segmentech (gene dosage" efekt) • komplexní (poly-, multigenní) nemoci • genetická dispozice podmíněná kombinací alel několika genů je výrazně manifestovaná prostředím a komorbiditami 48 Monogenní nemoci • Rozvoj molekulárně biologických metod umožnil detailní analýzu genetického podkladu mnoha mendelisticky děděných, tzv. monogenních nemocí. • U těchto chorob se dědičný podklad uplatňuje jako velký faktor, tj. je přítomen prakticky u všech nemocných a jedná se prokazatelně o faktor příčinný (např. defekty v dystrofinovém genu u muskulárních dystrofií), k němuž se přidávají jen jako přídatné další faktory genetické i faktory zevního prostředí. Příčinou těchto nemocí bývají především tzv. vzácné alely. • je determinována alelami v jednom lokusu • variantní alela, která vznikla mutací někdy v nedávné nebo vzdálené minulosti a je většinou relativně málo častá, nahrazuje původní „divokou" alelu na jednom nebo obou chromozomech • mají charakteristický způsob přenosu v rodinách 49 Monogenní nemoci • choroby dětského věku • méně než 10% z nich se manifestuje po pubertě a pouhé 1% se objeví po skončení reprodukčního věku často výrazně patologické • V populační studii na 1 milionu živě narozených dětí byla incidence vážných monogenních chorob odhadnuta na 0,36%, u 6-8% hospitalizovaných dětí se uvažuje o monogenních chorobách. • doposud známé shrnuje OMIM (On-line Mendelian Inheritance in Man) ~6000 klinicky významných fenotypu čtyři základní typy dědičnosti: dominantní recesivní autosomál ní autosomálně dominantní (AD) autosomálně recesivní (AR) X-vázaný X-dominantní (XD) X-recesivní (XR) 50 Monogenní nemoci 51 typy přenosu • autozomální • geny na obou autozomech aktivní • gonozomální (X-chromozom vázané) • muži hemizygotní • u žen 1 X-chromozom inaktivován!! Pedigree 0T0 S6 jine ííl>í 0^ ô ô imprinting, mozaicizmus, Kry I I male ^ alfected male J/j^ deceased male O female % aifeeted fe(nale^2řdeceased female podle projevu genotypu ve fenotypu • recesivní • nemoc jen u mutovaného homozygota • dominantní • nemoc stejná u heterozygota a mutovaného homozygota • neúplně dominantní • odstupňovaná tíže nemoci u heterozygota a mutovaného homozygota • kodominantní • jak normální tak patologická alela jsou vyjádřeny ve fenotypu Monogenní nemoci - AR • u heterozygotu s 1 mutovanou alelou stačí produkt k udržení normální funkce • manifestní onemocnění u heterozygota je důsledkem: • haploinsuficience - pro normální funkci je potřeba >50% aktivního genového produktu • dominantě negativního efektu - syntéza abnormálního proteinu, který "soutěží" s normálním a ovlivňuje fenotyp (např. Osteogenesis imperfecta) • zesílení funkce ("gain-of-function") - mutací je posílena přirozená vlastnost proteinu • ztráty heterozygozity (loss-of-heterozigosity, LOH) v somatické buňce -např. familiární predispozice k nádorůmv důsledku mutací v supresorových genech (např. retinoblastom) • velmi často enzymové defekty postižen je mutovaný homozygot (popř. sourozenci), heterozygotní rodiče jsou přenašeči (asymptomatičtí) - riziko 0.50 x 0.50 = 0.25 • frekvence přenašečů nemoci v populaci >>> frekvence nemocných • nejčastější AR nemocí u bělochů je cystická fibróza (f nemocných 1/2000, f přenašečů 1/22) • konsanguinita (příbuzní rodiče) a geneticky izolované populace (např. Aškenazi židé -Tay-Sachsova choroba ) 52 Monogenní nemoci - AD nemoci jsou důsledkem jak mutací přenášených mezi generacemi tak vzniklých nově nemoc se projevuje v každé generaci - postižený jedinec má postiženého rodiče (a prarodiče), a to matku nebo otce riziko pro potomka 0.50 (pokud by byli oba rodiče postižení pak 0.75, ale to je vzácné) familiární hypercholesterolemie (1/500), myotonická svalová dystrofie (1/1000) Huntingtonova chorea (1/3000) Monogenní nemoci - X-vázané ženy 3 genotypy, muži pouze 2 X-vázané nemoci se manifestují u všech mužů, kteří zdědili mutaci, a pouze u homozygotních žen hemofílie A Duchenneova muskulární dystrofie Wiskott-Aldrichův syndrom (imunodeficience) inaktivace X-chromozomu u žen • kompenzace dávky a exprese X-vázaných genů • hypotéza Lyonové ("lyonizace") • v somatických bb. je 1 X inaktivovaný a v interfázi se zobrazuje jako "Barrovo" tělísko (viz sporné identifikace pohlaví) • proces je náhodný, může se týkat jak otcovského tak mateřského X • důsledkem je variabilní exprese X-vázaných genů u heterozygotek ("manifestující přenašečka") • funkční mozaicismus (xx) Zva°,e xVÍ j^Pj^rtlJ Early Divisions (TÍ) (TÍ) ^"isc ^7**^ Inactivation hyii WW* activation passes to all cell's esce n d ants Producing a MOSAIC 54 Komplexní nemoci • multifaktoriální, multigenní • roli hrají kombinace určitých genů a určitých faktorů zevního prostředí • Na odhalení nejobecnějších principů genetiky multifaktoriálních nemocí se na rozdíl od genetiky nemocí mendelistických v současné době stále ještě čeká. • v klinické praxi často kolísá názor na výsledky genetických studií, které se snaží odhalit genetický podklad komplexních nemocí, od neodůvodněného očekávání nad nalezenými geny velkého účinku až po velkou skepsi vzhledem k existenci genetického podkladu v populaci četných nemocí ( nad 1%), jako je v kardiológii např. esenciální hypertenze. • pokud choroba má prokazatelně familiární výskyt, musíme očekávat podíl genetického podkladu na její manifestaci, a to i v tom případě, že není dosud dobře definován nebo dosavadní znalost nepovažujeme za přesvědčivou. • Své genetické pozadí mají i tak relativně vzdálené proximální fenotypy, jako je např. kvalita života u nemocných s chronickým kardiovaskulárním onemocněním. Každá choroba má nějaké genetické pozadí, jehož podíl na manifestaci dané choroby je různý. 55 Komplexní choroby 56 choroby, na jejichž vzniku a progresi se podílí „komplex" genetických, epigenetických a vnějších faktoru • fenotyp nevykazuje klasickou mendelistickou dominantní či recesivní dědičnost jako důsledek změn v jediném lokusu (tzv. jednolokusových) predisponující "geny" zvyšují pravděpodobnost onemocnění, ale nedeterminuje jednoznačně jeho přítomnost • je nutné spolupůsobení negenetických faktorů (prostředí) • dieta, fyzická aktivita, kouření, .... • a interakcí genů mezi sebou nejčastější komplexní nemoci • diabetes (1. i 2. typu) • dyslipidemie • esenciální hypertenze • alergie in O c ■U o c in a c ■U V >u fyziologické populační variabilita riziko polygenn! nebo monogermí porucha glukóza (mmol/l) fyziologická populační variabilita optimum ^ /^V riziko ,-polygenn [ porucha / normotenze J\i y p e r te n z e^^^^^^_ krevní tlak (mmHg) fyziologická populační variabilita riziko hypec hole sterole mie pclygenní porucha monogenní porucha cholesterol (mmol/l) Komplexní nemoci komplexní onemocnění jsou charakterizována: • neúplnou penetrancí patologického fenotypu • u určité části osob, přestože zdědí nevýhodný genotyp (zde ve smyslu souboru vícero genů) se patologický fenotyp nerozvine • existencí fenokopií • patologický fenotyp může být přítomen u lidí, kteří nejsou nosiči zmíněného genotypu • genetickou heterogenitou (lokusovou a alelickou) • klinický obraz není specifický, ale může se rozvinout v důsledku záměn v genech ležících na různých lokusech (= lokusová heterogenita), v jednotlivých genech může být přitom vícero mutací či polymorfizmu (= alelická heterogenita) • polygenní dědičností • predispozice k rozvoji patologického fenotypu se zvyšuje pouze při simultánním výskytu určitého souboru alel • vysokou populační frekvencí alel zodpovědných za rozvoj patologického fenotypu • každá jednotlivá predisponující alela pravděpodobně není sama o sobě výrazně patogenní • spolupůsobením dalších mechanizmů přenosu • mitochondriální dědičnost, imprinting Komplexní nemoci Obezita - Hypotéza typu „thrifty genotype" • V současné populaci jsou selektovány alely, které favorizují přírůstek váhy a skladování tuků, aby byl zajištěn dostatek živin pro častá období nedostatku potravy. • Při konstantně vysoké nabídce potravy a poklesu fyzické aktivity tato predispozice vede k pandemii obezity v rozvinutých zemích. Jednolokusové nemoci Komplexní nemoci Závažnost 59 Genetické studie • Základní debata nad genetickým podkladem nemocí logicky začíná od strategie výběru tzv. kandidátních genů. Tato otázka je podstatně jednodušší u mendelisticky děděných nemocí, kde se změněná funkce jednoho genu snadněji identifikuje. • Celogenomové asociační studie (GWAS=Genome-Wide Association Study) vyhledávají polymorfismus jednotlivých nukleotidů nebo běžné genové variace, které se typicky chovají jako ukazatelé genových oblastí s malým efektem u stoupajícího rizika nemocí. • Dalším významným momentem je výběr statistické metodologie, která zhodnotí sílu asociace genů s chorobami. Možnosti jsou v zásadě dvě: linkage (vazebná) analýza a asociační studie. K detekci specifických genetických oblastí a genů, které se účastní v transmisi nemoci, je v principu možné použít obě metody. 60 Genetické studie • s intermediálním fenotypem • s klinickou manifestací nemoci • s klinickou závažností nemoci • s odpovídavostí nemoci na léčbu Linkage (vazebná) analýza • testuje kosegregaci genového markem a fenotypu nemoci v rodině. Čili marker a nemoc se v dané rodině mají vždy vyskytovat spolu. Asociační studie • vyšetřují souvýskyt markem a nemoci na populační úrovni, tj. u nepříbuzných jedinců, obvykle srovnáním frekvencí markem u nepříbuzných nemocných a kontrolních subjektů (studie case-control). Statistickou sílu asociace je možno dále zvýšit obohacením o další kritéria, jako jsou klinické subtypy nemoci (studie case-case), závažnost nemoci, časný začátek nemoci, rizikové faktory pro nemoc včetně pohlaví a vhodné biologické znaky (např. plasmatické hladiny cytokinů při asociaci genetických polymorfismů v cytokinovýcn genech; studie genotyp-fenotyp). 61 Klinická genetika zabývá se diagnostikou, léčením a prevencí genetických nemocí genetické poradenství vrozené vady - poruchy utváření orgánů, které vznikly v období nitroděložního života, i poruchy funkční (např. duševní opoždění) a poruchy na úrovni biochemické a molekulární (např. vrozené vady metabolismu). Skupina Příčina chromozomální Primárně (geneticky) aberace monogenní Sekundárně (prostředí) Neznámé (multifaktoriální) dědičnost léky, infekce, záření porodní poranění infekce po narození 7 % geny + prostředí 46 % Zastoupení 10 % 20 % 5 % 12 % 62 Klinická genetika Prenatální diagnostika •zahrnuje vyšetřovací vyhledávání statisticky struktuře nebo funkci, fenotypové variability •umožňuje v závažných případech ukončení gravidity, u dalších je možno v předstihu plánovat optimální perinatální péči. postupy směřující k významné odchylky ve která přesahuje hranice Rizikové faktory: •věk matky v době porodu je vyšší jak 35 let •pozitivní biochemický screening z krve matky •ultrazvukový nález, který zvyšuje riziko přítomnosti chromozomální aberace (nahromadění tekutiny v podkoží, nepřítomnost nosní kůstky, srdeční vada plodu aj.) •přítomnost chromozomální aberace v rodině 63 Klinická genetika Vyšetření karyotypu plodu •invazivní metody - amniocentéza, biopsie choriových klků, kordocentéza •genetické vyšetření, přesněji vyšetření cytogenetické (neboť se vyšetřují chromozomy), ovšem nejedná se o test DNA •FISH - fluoresceční hybridizace in situ •vazba denaturované sDNA se specifickou sondou •AmnioPCR je moderní metoda sloužící ke genetickému vyšetření plodu. •porovnání DNA markem matky i plodu —> stanovení početu jednotlivých chromozomů u plodu. •výsledek je následně potvrzen klasickým cytogenetickým vyšetřením •K dispozici je v současné době vyšetření 21. chromozomu - amnioPCR, nebo sada vyšetřující chromozomy 13,18, 21, X a Y- tzv. multiamnioPCR. i »! f.. 11 \ f\ \\ A ?()í 4 t )(]| K ii \r V> ti II !t H 13 14 11 * % 11 ja l& 1T 1» H H M ľ ! ' !!>( n ; i n H u m;n >m II H '..... • ••...... k 'J í! X M U IIII ii ii íl U II /I tl M Klinická genetika Stanovení pohlaví plodu •volné fetální DNA kolující v krvi matky •neinvazivní s přesností ~98 % •od 10. týdne těhotenství •DNA plodu z venózní krve matky •z klinického hlediska je určení pohlaví plodu důležité v případě rizika nějaké genetické choroby vázané na určité pohlaví (např. hemofilie). Preimplantační diagnostika •metodu časné prenatální diagnostiky, která je vázána na techniky umělého oplodnění. Za účelem minimalizace chyby genetického vyšetření je třeba k oplozování vajíček použít metody intracytoplazmatické injekce spermie •buňky pro genetické vyšetření jsou odebírány z embrya nejčastěji ve stadiu 8 buněk nebo blastocysty Postnatální diagnostika •např. trombofilie , cystická fibróza. 65 i Trombofilie •vrozený sklon ke zvýšenému srážení krve •může být v některých případech pro své nositele výhodná (omezení ztrát krve při poranění) •i příčinou různých komplikací v těhotenství, při dlouhodobém znehybnení nebo při užívání některých léků může způsobit hlubokou trombózu či plieni embólii •genetické vyšetření u: gravidních, před začátkem užívání hormonální antikoncepce, před chirurgickým zákrokem •Leidenská mutace - mutace genu pro inhibitor koagulace faktor V - riziko trombembolie ~30 %, genová mutace rs6025 G1691A, R506Q (arg^gln), AD •Hyperhomocysteinemie - mutace enzymu konvertujícího kyselinu listovou -metyltetrahydrofolátreduktáza (MTHFR) - projeví při nedostatku vitaminů B6, B12 a kyseliny listové, genová mutace rsl801133 C677T, AR •Defekt antitrombinu (FII) - mutace koagulačního faktoru II zvyšujícího hladinu protrombinu - riziko trombembolie ~70 - 90 %, genová mutace rsl799963 G20210A 66 Klinická genetika Cystická fibróza •více než 30 mutací, které způsobují toto onemocnění důvody k vyšetření jsou: •podezření na klinické onemocnění •příbuzenský vztah rodičů •opakované potraty •léčená neplodnost 67 Obecný princip molekulárního klonování klonovací vector + DNA obsahující požadovaný gen (izolace) restrikce ligace transformace selekce pomocí selekčních markerů reprodukce a syntéza cílového proteinu izolace ivannr] una Huiikwť DNA ■i i Hj Iiiiihj ■ rMHTrttilnlnfl QflA . gene ot iiiliľĹ'.l AHTZ qons HBHlrldlíi Nin plavn " ftilrkv" Q l;Lt tkoih ur, Ar. Willi :,in-e r»sírle*iůri *niym«- O MIK |hw DNA st; Irivy Jatai try beat puta dng. (Sama filíwmkď*. idiu Ihla «-cjwl. Ij oti t If v chnK of cbIIe. cd nil b fri I r roc cm b In ári t placmUi by tľiulr utf HHy 1o trw In o r* B-e«i c-t d r.H'.=Hliri and Iheh-iwhllv whr. RA^lMlfil clarw BFrying i GQpvrlanl.& Pt-arsc-n education. Inc.. puD-Nardna aa Líenl-ůmin Cumrmnfla. Dolly - přenos jádra somatické buňky do oocytu buňky (mtDNA!) PpORClGK/ And ]>o/v|ESTIC DNA RCPAIR "You're lucky nobody was injured. Your base pairs are out of alignment and that has your reading frames all messed up."