doc. RNDr. Monika Pávková Goldbergová, Ph.D. Genetika v ZL 3 Annual Reviews Annual Reviews Annual Reviews Variations Features Effects Advantages Disadvantages Applications in cancer research CRISPR/Cas9 WT Cas9; sgRNA Double-strand break at the target site Versatile; effective; stable; easy accessibility Off-target; PAM limited; different modified alleles Set up research model; functional gene study; drug target identification CRISPR/Cas9 Nickase Mutant Cas9 H840A or D10A; sgRNA Single-strand break Convenient; efficient; flexible; precise, scalable; robust PAM limited; 2 sgRNA for KO Manipulate epigenetic modifications; Simultaneous activation and repression CRISPRi dCas9; repressor peptide; sgRNA Block transcription elongation or knockdown transcripts Inducible; reversible; low off-target effects; low toxicity PAM limited; offtarget effects at bidirectional promoters Genome and transcriptome research; LncRNA knockdown and overexpression CRISPRa dCas9; activator peptide; sgRNA Increase transcription PAM limited; complicated to deliver the multiple components CRISPR/Cas9 – An evolving biological tool kit for cancer biology and oncology Application Targets sgRNA design Vehicle for delivery Features Advantages Disadvantages Generate cancer model HSPCs; healthy human organoids Targeting the model type- related suppressors oncogenes Pooled lentivirus Disrupt suppressors or edit oncogenes Rapid, efficient, and inexpensive Special delivery techniques; tissue limited Synergistic gene study Cells Targeting optional drug target from database Lenti-double sgRNA library Together with deep sequencing Effective, low cost, innovative approach Double sgRNA construction; need highly efficient sgRNA; special analysis Target validation Drug or anticancer reagent resistant cells Lentiviral library from Addgene; or optional targets Plasmid Identify the target from resistant cells by sequencing Effective False-positives Gene diagnose Genome Target sensitive genes Lentivirus Together with Cas13a or Cas12a to induce collateral effects Sensitive, rapid, low cost Certain template concentration CRISPR/Cas9 – An evolving biological tool kit for cancer biology and oncology Applications Target site Study phase Editing strategy Clinical trials identification Advanced esophageal cancer PD-1 Phase II PD-1 knockout NCT03081715 Castration resistant prostate cancer PD-1 Phase I PD-1 knockout NCT02867345 Muscle-invasive bladder cancer PD-1 Phase I PD-1 knockout NCT02863913 Metastatic non-small cell lung cancer PD-1 Phase I PD-1 knockout NCT02793856 EBV associated malignancies PD-1 Phase I Phase II PD-1 knockout NCT03044743 Metastatic renal cell carcinoma PD-1 Phase I PD-1 knockout NCT02867332 Relapsed or refractory leukemia and lymphoma CD19 and CD20 or CD22 Phase I Phase II Edit CD19 and CD20 or CD22 NCT03398967 Human papillomavirusrelated malignant neoplasm HPV16-E6/E7 HPV18 E6/E7 Phase I HPV16-E6/E7 or HPV18 E6/E7 knockout NCT03057912 CD19 + leukemia and lymphoma TCR B2M Phase I Phase II TCR and B2M knockout NCT03166878 Tumor of the central nervous system NF1 — Fix NF1 mutation allele NCT03332030 Multiple myeloma Melanoma Synovial sarcoma Myxoid/round cell liposarcoma TCR PD-1 Phase I TCR and PD-1 knockout NCT03399448 Anticancer applications in clinical trials GENETIKA ZUBNÍCH TKÁNÍ Odontogeneze •Komplexní série procesů zahrnujících buněčné interakce, diferenciace, rozvoj unikátní extracelulární matrix a mineralizace •Je maximálně regulována na molekulární úrovni • Terminální diferenciace specifických buněk • epiteliálně-mezenchymální interakce • Sekrece specifické extracelulární matrix • Kontrolované vyzrávání matrix • Regulace depozice iontů • Mineralizace zubních tkání Vývoj zubů = Odontogeneze • Orální ektoderm • Mezoderm • Buňky neurální lišty mezenchym (ektomezenchym či mezektoderm) • Sklovina vzniká z ektodermu • Ostatní tkáně z mezenchymu Odontoblasty vs. ameloblasty • Odontoblasty • vznik z mezenchymových buněk u vnitřního sklovinného orgánu • produkují (pre)dentin • Tomesova vlákna • cytoplazmatické výběžky zanechané v dentinu • Ameloblasty • z vnitřního sklovinného orgánu • bazální povrch se stává sekrečním • produkce skloviny Dentinogeneze • začíná diferenciací odontoblastů v hrbolcích budoucích zubů • Odontoblasty vznikají v průběhu vývoje z okrajových částí dentální papily; • z její vnitřní části zubní pulpa. • mírně předchází amelogenezi. Komponenty ECM dentinu • Kolagen typu I • Kolagen typu III a IV – predentin, není přítomen u normálního dentinu • Dentální sialofosfoprotein • Dentin phosphophoryn • Dentin sialoprotein • Dentin Matrix Protein 1 • Proteoglykany • Gla proteiny – • např. osteokalcin SIBLING-family genes SPARCL1: SPARC-like protein 1, DSPP: dentin sialophosphoprotein, DMP1: dentin matrix protein 1, BSP; bone sialoprotein, MEPE: matrix extracellular phosphoglycoprotein, OPN: osteopontin. AMBN: ameloblastin, ENAM: enamelin Ameloblasty  migrace ameloblastů k budoucí pulpě  sekretují proteiny podle přísně regulované programované genové exprese a načasování  vytváří extracelulární organickou matrix skloviny kostru, která sama reguluje iniciaci, růst a tvar anorganických krystalů hydroxyapatitu, které zralou sklovinu vytvářejí  tloušťka skloviny závisí na délce sekretorické fáze ameloblastů Faktory ovlivňující amelogenezi • Výživa • Kalcium, fosfáty, proteiny, … • Hypoxie • Hypertermie • Infekce • Fyzikální faktory • Prostor • Trauma • interakce Zrání skloviny  sekretorická fáze - „zrání“ skloviny“  završeno ukládáním iontů po stranách krystalitů skloviny a vytlačením zbytků proteinové matrix a tekutin ze struktury.  rozštěpena a odstraněna téměř všechna matrix organických proteinů a je nahrazena anorganickými krystaly.  po ukončení sekretorické fáze již nedochází k další tvorbě krystalů ani k prodlužování krystalů již vytvořených  apoptoza ameloblastů Dentin-enamel junction Bulk of enamel matrix: Amelogenin Lesser components Ameloblastin Enamelin Enamelin Degradation: MMP20, KLK4 Proteiny a ECM Nucleation of hydroxyapatite by acidic matrix proteins immobilized on insoluble collagen matrix. Some acidic matrix proteins, e.g. dentin phosphoprotein, have an affinity to collagen. The surface of the insoluble collagen matrix provides loci to reduce interfacial energy for nucleation. Calcium ions are bound to the acidic groups of the acidic proteins, and inorganic phosphates are attracted by the calcium ions. The ionic complex thus formed may constitute a crystal nucleus. Molekulární determinanty • Na vývoji zubu se podílí více než 10000 genů • Většina genů podílejících se na odontogenezi jsou exprimovány v jiných tkáních • Některé geny jsou specifické pro vývoj zubní tkáně (např. gen pro amelogenin) Geny a dráhy  více než 300 genů  mezi signální dráhy řídící vývoj zubů patří dráhy:  TGF beta (transforming růstový faktor),  FGF (fibroblastového růstového faktoru),  BMP (kostní morfogenetický protein),  SHH (Sonic hedgehog),  Wnt,  TNF,  EDA (Ectodisplasin) Geny a dráhy Regulace genů modulátory signálních drah – např. inhibitory BMP a inhibitory FGF.  geny, které se účastní rané fáze vývoje zubu, mají odlišnou funkci v dalších stádiích vývoje.  multifunkčnost umožňuje indukce nebo regulace odlišnými transkripčními faktory nebo regulátory (AMBN, BGLAP, IBSP a COLLA2; BGLAP, COLLA2; komplexVitamin D3/-VDR-RXR: CALB1, CST6, FOXO1) Geny a vývoj skloviny a dentinu  amelogenin, enamelin, ameloblastin, a MMP20 (matrix metaloproteináza 20) – počátek sekretotické fáze  kalikrein 4 (KLK4), amelotin a odam (apin) – iniciace maturace  KLK4 a MMP20 – degradace proteinů vrstvy skloviny  FAM83H - sekrece a reabsorpce proteinů skloviny  homeoboxové geny DLX (Distal less), přičemž geny DLX1 a DLX2 jsou specifické pro vývoj molárů Vrozené poruchy tvrdých zubních tkání Abnormality - podklad Genetic: Inherited disorders, Age, Sex Environment: Nutrition, Disease Socio-economic status Teeth formation cells Secretion and Maturation Timing Duration Intensity DENTAL DEFECTS Patologie těhotenství •Syphilis – poruchy vývoje skloviny, soudkovité zuby •Ionizující záření – anomálie vývoje skloviny •Užívání léků – změny zabarvení, hypoplasie skloviny •DM – hypoplasie skloviny Choroby tvrdých zubních tkání • získané • vrozené • abraze • eroze • resorpce • změny zabarvení zubů • geneticky podmíněné anomálie: • - zubů • - skloviny • - dentinu Vrozené poruchy zubů • změny velikosti zubů • změny tvaru zubů • změny počtu zubů • anomálie struktury zubů • poruchy prořezávání Zuby předmléčné dentes praelacteales • zuby natální (dentes natales) - prořezané již při narození • neonatální zuby (dentes neonatales) -mezi 1. - 30. dnem po narození. • Od dentes praelactealesje nutno odlišit předčasně prořezané dočasné zuby- dentitio praecox. Změny počtu zubů • anodoncie- úplná absence zubů • hypodoncie- snížený počet zubů, nejčastěji 3.moláry • oligodencie – chybění většího počtu zubů • hyperdoncie- přespočetné zuby, prořezané nebo retinované, hlavně v horní čelisti • mesiodens- v mezeře mezi horními středními řezáky • Gardnerův syndrom - neprořezané přespočetné zuby, polyposa tlustého střeva, osteomy v kostech včetně čelistí, epidermoidní cysty v kůži Mesiodens Fuze Hypodoncie Geny a změna počtu zubů  autozomálně dominantní (AD) nebo autozomálně recesivní (AR) - mutace v exonech genu pro MSX1 - řídí rozvoj všech epidermálních orgánů  dojde-li k mutaci PAX9, nedochází k aktivaci MSX1  vývoj zubu zastaven ve fázi pupene • MSX-1 - represor • PAX-9 Geny a změna počtu zubů Geny a změna počtu zubů  RUNX2 –TF pro diferenciaci osteoblastů - tvorba nadpočetných zubů ve stálé dentici  AXIN2 - těžké oligodoncie. Dochází k agenezi většiny stálých molárů, premolárů, dolních řezáků a horních postranních řezáků  Dlx (distal-less homeobox) selhání vývoje zubů a ztrátu horních molárů • RUNX-2 • AXIN-2 • DLX Geny a abnormality pozice zubů  Abnormality pozice zubů se často vyskytují spolu s agenezí zubů.  Předpokládá se, že mutace v genech spojených s agenezí zubů, zejména MSX1 a PAX9 by mohly být příčinou i abnormální pozice zubů. • MSX-1 • PAX-9 Změny velikosti zubů • mikrodoncie • makrodoncie • generalizovaná – všechny zuby menší (hypofyzární nanismus, Downův syndrom) • jednotlivý zub (hlavně přespočetný) • relativní generalizovaná (zuby normální či mírně menší, větší čelist) • generalizovaná – všechny zuby větší (hypofyzární gigantismus, akromegalie) • jednotlivý zub • relativní generalizovaná (zuby normální či mírně větší, menší čelist) Změny tvaru zubů  akcesorní hrbolky- moláry,řezáky  akcesorní kořeny  čípkovité zuby-konický tvar korunky  zdvojený zub- oddělené korunky a společný kořen s kořenovým kanálkem (geminace, srůsty)  taurodontia – abnormálně široké dřeňové dutiny  dens in dente - vzniká vchlípením ektodermu zubní korunky do mezodermu pulpy, před kalcifikací tvrdých zubních tkání- vsunutý zub menší do pulpy zubu normálního Poruchy prořezávání zubů • předčasná nebo zpožděná erupce • retence zubů-hlavně 3.stoličky • zuby nesprávně vyvinuté nebo atypicky postavené Vývojové poruchy zubů Dysplasie skloviny •Hypoplasie – amelogenesis imperfecta •Hypokalcifikace Poruchy tvorby dentinu •Dentinogenesis imperfecta Poruchy zbarvení zubů •Tetracykliny – žlutavé, žlutohnědé zbarvení, ireversibilní, poruchy mineralizace •Fluoridy – nadměrná dávka, špinavě šedé skvrny, eroze Poruchy struktury zubů Amelogenesis imperfecta (AI) • hereditární porucha tvorby skloviny • postižena je dočasná i trvalá dentice • hypoplastická – tenká sklovina normální tvrdosti • zuby se nedotýkají, povrch nerovný, často pigmentace • hypomaturační – sklovina měkká, normálně silná, snadno se odlupuje • hnědo-žluto-bílo skvrnitá • hypokalcifikovaná – zpočátku normální tloušťka, postupně ubývá, obnažuje se dentin • měkká, sýrovité konzistence Hypoplazie skloviny Hypomineralizace skloviny AI a geny  Dědičnost AI  X-vázaná,  autosomálně recesivní (AR) nebo  autosomálně dominantní (AD). Geny:  Autozomálně dominantní AMLEX (amelogenin), AMBN (ameloblastin enamel matrix protein), ENAM (enamelin) a AMTN (amelotin), FAM83H, DLX3  Autozomálně recesivní MMP20 KLK4  AMELX tvoří 90 % organické hmoty skloviny a je štěpen enzymem MMP20 a degradován enzymem KLK4.  ENAM tvoří 5 % organické hmoty skloviny;  AMBN je nezbytná pro aktivitu ameloblastů a  AMTN se podílí na zrání skloviny.  Mutace v jednotlivých genech vede k odlišnostem ve fenotypovém projevu onemocnění. Amelogenin • X – vázané formyAI • Mutace v genu pro amelogenin • cca.15 mutací • Mutace g4114delC – deleceC • Frameshift mutace - stop kodon • Zkrácený protein • Zkráceny o 18 AMK Další proteiny • ECM skloviny je komplexní mix mnoha proteinů, z nichž některé pocházejí z ameloblastů (enamelin, ameloblastin) • Enamelin • Ameloblastin • Amelotin • Amelin • Tuft protein • Keratin • Albumin Enamelin AD forma AI • Mutace v genu pro ENAM • Substituce nukleotidu v exonu 4 • Stop kodon • 52 AMK místo 1142 Delece nukleotidu Stop kodon 270 AMK místo 1142 MMP-20 - Enamelysin • Autozomálně recesivní AI • 483 AMK (54kD) • Exprimován ameloblasty a odontoblasty • Degraduje amelogenin Amelogenesis imperfecta • Hypoplazie i hypomineralizace • Autosomálně dominantní hypoplastická hypomaturačníAI s taurodontismem Poruchy struktury zubů  Dentinogenesis imperfecta • nedostatečná kalcifikace dentinu, který téměř vyplňuje dřeňovou dutinu • Zuby jsou šedé, žluté až žlutohnědé- snížená mechanická resistence, dochází rychle k abrazi Dentinogenesis imperfecta • autozomálně dominantních klinicky heterogenních poruchy • Klasifikace: • DGI typu I s asociací s osteogenesis imperfecta (OI), • DGI typu II bez asociace s OI; • dysplasie dentinu I (DD I), • dysplasie dentinu II (DD II). Dentinogenesis imperfecta DGI I  Molekulární defekty související s OI zahrnují mutace v pro-alfa řetězcích kolagenu typu 1 a jsou fenotypově charakterizované zvýšenou fragilitou kostí.  Kolagen typu 1, který je produktem genů COL1A1 a COL1A2.  méně než 10 % případů je onemocnění způsobeno recesivní dědičností danou poruchou genů CRTAP, LEPRE1 a PPIB  pohybují se v rozmezí od úplné absence dřeně a kořenů až po normálně vyvinutou zubovinu DGI II  Přibližně 10% organické hmoty dentinu je tvořeno jinými proteiny než kolagenovými, zejména pak charakteristickými proteiny:  dentinových fosfoproteinem (DPP),  dentinovým sialoproteinem (DSP) a  dentinovým glykoproteinem (DGP).  jsou kodovány chimérickým proteinem DSPP (dentinový sialofosfoprotein)  U DGI II je postižen dočasný i trvalý chrup, přičemž postižení primární dentice je mnohem závažnější než postižení sekundární dentice Dysplazie dentinu  DD-I  Zuby mají klinicky normální tvar, formu a konzistenci.  RTG - ostré kořeny s konickou apikální konstrikcí.  Dochází k preeruptivní obliteraci pulpy, což vede k pozůstatkům pulpy ve tvaru půlměsíce paralelně s cemento-sklovinným spojením ve stálé dentici a celkové obliteraci pulpy v dočasném chrupu  DD-II  podobají se symptomům u DGI-II, avšak trvalá dentice je buď nedotčena nebo vykazuje mírné radiografické odchylky.  RTG - chybí dočasným zubům dřeň, u stálých zubů je prostor dřeně trychtýřovitý s výrůstky vznikajícími jako patologicky zvápenatělé kousky dřeně.  Zubní kořeny v obou denticích jsou normální. Ektodermální dysplazie  souhrn 192 poruch  anomálie v nejméně dvou následujících strukturách pocházejících z ektodermu: vlasy, kůže, nehty a zuby.  Nejčastější ED jsouX-vázané recesivní hypohydrotická ED Hypohydrotická ED  způsobeno bodovou mutací, delecí nebo translokací v genu pro EDA, který je lokalizovaný na chromozomuX  není schopen spuštění normálních signálů potřebných pro interakce ektoderm- mezoderm Hydrotická ED (Cloustonův syndrom)  autosomálně dominantní porucha způsobená mutací v genu GJB6,  kóduje protein connexin 30 jako komponentu inracelulárních gap junction Molekulární defekty u ED • První zmínka o genetickém defektu u ED - 1996 • Molekulární defekty byly identifikovány u 10 z 20 ektodermálních dsyplazií • Hypohidrotic X linked ED • Reiger Syndrome • Tricho Dento Osseous Syndrome • Autosomal Dominant/Recessive ED • Clouston ED • Incontinentia Pigmenti Molekulární defekty u ED •X-vázaná hypohidrotická ED • transmembrane protein (ectodysplasin-A) • Genetický defekt – abnormální signál ve vztahu interakce ektoderm-mesoderm •Autosomálně dominantní a recesivní hypohidrotická ED • receptor tumor nekrotizujícího faktoru (Downless DL) • Mutace genu pro GJB6 • Riegerův Syndrom • homeobox geny (RIEG, PITX2) • Tricho-dento-osseous syndrome • homeobox gene (DLX3) Další geny a dysplazie Witkopův syndrom (Tooth-and-nail syndrome;TNS)  ojedinělá autosomálně dominantní ektodermální dysplazie  manifestuje se defekty nehtových lůžek a hypodoncií s normální funkcí potních žláz a normální strukturou vlasů.  mutace typu non sense v genu MSX1. Mutace v genu pro p63 se podílejí na patogenezi několika syndromů, které zahrnují ektrodaktylii, syndaktylii, ektodermální dysplazie a rozštěpy.  Exprese genu p63 je důležitá pro vývoj všech ektodermálních orgánů včetně zubů Syndromy asociované s orofaciálními defekty • SyndromVan derWoudeové je autozomálně dominantní poruchou, která je charakterizována rozštěpem rtu nebo patra a zřetelnými defekty dolního rtu - gen pro IRF6 (interferon regulatory factor). • Crouzonův syndrom je autozomálně dominantní poruchou, která je charakterizována předčasným uzavíráním kraniálních švů, maxilární hypoplazií a maxilární pseudo-rozštěpem - s mutacemi v genu pro FGFR2 a FGFR3 • Apertův syndrom je autozomálně dominantní genetická porucha, která způsobuje abnormální vývoj lebky - s mutacemi v genu pro FGFR2 Syndromy asociované s orofaciálními defekty II  Treacher Collinsův syndrom je charakterizován poruchami struktur odvozených z prvního a druhého branchiálního oblouku: hypoplastická zygoma a mandibula, mikrognacie, coloboma, defekty uší, laterání faciální rozštěp, rozštěp patra. mutacemi v genu pro TCOF1  Downův syndrom - nedostatečně vyvinuté obličejové kosti, charakteristický opožděný vývoj a prořezávání zubů (erupcio tarda), chybění zubů a chybné postavení – chromozomální aberace  Pierre-Robinův syndrom je autozomálně recesivní postižení s heterogenní etiologií. Je však známa i X-vázaná forma poruchy. Jedná se o syndrom charakteristický rozštěpem patra, hypoplastickou mandibulou a hypertrofií jazyka  Marfanův syndrom je vzácná autozomálně dominantní genetická porucha pojivové tkáně. Charakteristické maxillarní/mandibularní retrognacie, mikrognacie, úzké klenuté patro se stěsnanými zuby, a symptomy podobné symptomům u dentinogenesis imperfekta - mutacemi v genu pro fibrillin-1 (FBN1). FBN1 Zubní kaz (caries dentium) • dekalcifikace tvrdých zubních tkání • bakterie- Lactobacillus acidophilus a nehemolytické streptokoky, které rozkládají cukry zbytků potravy za tvorby organických kyselin způsobujících dekalcifikaci-proteolytické enzymy odbourávají organickou složku • zubní plak-tenký povlak z bakterií, hlenu a deskvamovaných epitelií • další vlivy-typ potravy, složení slin, pH prostředí • sklovina dekalcifikuje-bělavá křídová skvrna, měkne, vzniká dutina, vyplňuje se zbytky potravy a bakteriemi-další šíření kazu, proces zasáhne dentin, šíří se dentinovými kanálky do hlobky a do šířky až do dřeně a vznikne pulpitis • Mutace v genech, které způsobují poruchu strukturální tvorby skloviny (AMLEX, ENAM, KAL4 a MMP20) vedou k tvorbě skloviny mnohem náchylnější k zubnímu kazu. Zubní kaz  onemocnění multifaktoriální-faktory endogenní a exogenní  predisponující faktory:  dědičnost- vztah ke kazivosti nebo odolnosti proti kazu  dieta bohatá na sacharidy  obsah fluoru v pitné vodě- zuby odolné proti kazu mají vyšší obsah fluoru v tvrdých tkáních  osobní hygiena-intenzivnější tvorba zubního plaku při nedostatečné hygieně  tvar zubu-zuby s fisurami jsou kazivější Zánětlivé postižení parodontu Monogenní onemocnění • Jasná demonstrace genetické mutace v jednom lokusu podmiňuje náchylnost k rozvoji periodontitidy. Papillon LeFevre Syndrom (PLS) •Klinicky charakterizováno jako: • Palmoplantarní hyperkeratosa • Těžký časný nástup parodontitidy, která vede k předčasné ztrátě primárního a sekundárního chrupu (odlišuje PLS od jiných plamoplantarních keratodermií) •Prevalence 1/4 miliony •Bez vztahu k pohlaví CTSC gen kodující Katepsin C proteázu • CTSC gen leží na chromosomu 11q14-Q21; 7 exonů kóduje lysozomální proteázu katepsin C • Je exprimována ve vysokých hladinách v různých imunitních buňkách, včetně polymorfonukleárních leukocytů, makrofágů a v epiteliálních oblastech běžně postižených PLS, včetně dlaně, plosky, kolena, a ústní keratinizované gingivy (RT-PCR) (Hart et al., 1999). • Kathepsin C je proteáza, která zpracovává a aktivuje řadu granulárních serinových proteáz důležitých pro imunitní a zánětlivé reakce myeloidních a lymfoidních leukocytů Mutace v genu pro katepsinu C (CTSC) • Exon 1 „nonsense“ mutace (856C→T): předčasný stop kodon v pozici 286. aminokyseliny • Tři mutace v exonu 2: • delece jednoho nukleotidu (2692delA) v kodonu 349: frameshift a předčasný stop kodon, • 2 bp delece (2673-2674delCT): stop kodon v pozici aminokyseliny 343, • substituce G/A v kodonu 429 (2931G/A): předčasným stop kodon. • Zkrácený nebo konformačně alterovaný proteinu nemusí být transportován do organely a nemusí být schopen aktivovat protein kinázy • Jinými slovy, aktivita KatepsinuC u těchto pacientů téměř chybí Multifaktoriální onemocnění Zevní prostředí a získané rizikové faktory Současná koncepce patogeneze parodontitidy Page & Kornman Mikrobiální infekce Imunitní odpověď hostitele Metabolizmu s pojivových tkání a alveolární kosti Klinické známky onemocnění a jeho progrese Genetické rizikové faktory Ab PMNs LPS+ Ag Ck PG MMP Únik bakterií před obrannými mechanizmy hostitele ⚫ Mohou tvořit imunorepelentní látky odpuzující fagocytózu ⚫ Přítomnost bakteriální stěny - ztěžuje fagocytózu (S. aureus tvoří plazmakoagulázu – umožní obalení fibrinem, což působí antifagocytárně) - chrání před účinky komplementu ⚫ Přežívání v makrofázích (odolná stěna, zábrana splynutí fagolysosomu, zábrana respiračního vzplanutí, přechod z fagosomu do cytoplazmy) ⚫ Antigenní variabilita → snižuje účinnost specifické imunity ⚫ Poškozování imunitního systému hostitele (např. leukocidin S. aureus) Reakce organizmu na bakteriální infekci • Branou vstupu → obvykle slizniční povrchy (porušení integrity) • Osud hostitele závisí na: - obranyschopnosti (z velké části determinována geneticky) - patogenitě bakterie (invazivní schopnost, tvorba toxinů, schopnost odolávat obranným mechanizmům hostitele) neinvazivní – množí se v místě vstupu do organizmu ohrožují v případě produkce toxinů (obranou jsou pouze neutralizační Pt) invazivní – pronikají do organizmu (extracelulární x intracelulární) (obranou jsou Pt, komplement, fagocytóza vs. makrofágy) - velikosti infekční dávky Onemocnění parodontu – lokální problém? IL-1 Gene Polymorphisms •1997 Kornman et al – asociace polymorphismů v genu kódujícím IL-1a(-889) a IL-1B(+3953) se závažnějšími formami parodontitidy. •IL-1 polymorfní klaster (PST-periodontitis susceptibility trait) byl asociován se závažností PD pouze u nekuřáků, rozlišil jedince s těžkou parodontitidou od mírného onemocnění. Genetic control of IL-1: Genes and Locus of SNPs associated with controlling IL-1 biological activity Genes Polymorphism Locus Current Locus assessed with test Controlled product IL-1A Allele 2 -889 Allele 2 IL-1A +4845 IL-1 alpha IL-1B Allele 2 +3953 Allele 2 IL-1B +3954 IL-1 beta IL-1RN Protein receptor antagonist (impedes IL-1 alpha and beta) Genetic Susceptibility Test for periodontitis: tests for the presence of at least one copy of allele 2 at the IL-1A +4845 loci and at least one copy of allele 2 at the IL-1B +3954 locus. *IL-1A +4845 is being used because it is easier to identify than IL-1A -889 and it is essentially concordant with it. ** IL-1B +3953 has been now renumbered as IL-1B +3954 because the current convention indicates that the numbering of the transcription should begin at +1 instead of zero. Interleukin 1 • Prozánětlivý multifunkční cytokin. • Umožňuje pronikání zánětlivých buněk do míst infekce • Podporuje kostní resoroption • Stimuluje uvolňování eikosanoidů (PGE2) monocyty a fibroblasty • Stimuluje uvolňování MMP, která degraduje proteiny ECM. • Formy IL-1α a IL-1B IL-1 jako modulátor periodontitidy +IL-1 genotyp a IL-1 protein • Konkrétní parodontitidy-asociovaný IL-1 genotyp sestává z varianty v IL-B genu, který je spojen s vysokými hladinami IL-1 (Poiciot et al 1992) • Pacienti pozitivní pro sloučený IL-1A (4845) a IL-1B (3954) sparodontitidou-asociovaný genotyp mají vyšší hladiny IL-1B na GCF, ale ne v gingivální tkáni před a po ošetření (Kornmann et al 1999) • Nositelé alely 2 (-889) u pacientů s chronickou parodontitidou vykazovali téměř čtyřnásobný nárůst hladiny IL-1 (Shirodaria et al., 2000) Clinical Significance of IL-1 Genotype Bleeding Upon Probing Lang et al. (2000) - after periodontal surgery, maintenance patients were monitored for BOP and tested for the candidate genotype. - no significant relationship between BOP and the candidate polymorphism when the entire study population was evaluated (N=333). - non-smokers genotype positive demonstrated significantly more bleeding (when compared to non-smokers genotype-negative). • Genotype and tooth loss McGuire and Nunn (1999) • Genotype-positive individuals had a 2.7 greater chance than genotype-negative patients of losing a tooth. • Combined effect of being genotype-positive and heavy smoker increased the odds of tooth loss to 7.7 compared with genotype-negative non-smokers. • PST can be helpful in treatment planning. • Genotype and healing after surgery De Sanctis and Zucchelli (2000) • Evaluated the impact of patient’s genotype on maintenance of gained clinical attachment after guided tissue regeneration (GTR) • At base line: no difference between genotype-positive (N=14) and genotype-negative (N=26) with reference to clinical parameters (BOP, PD, and CAL) • At one year: no difference (gain of CAL 5.1 mm vs 5.2 mm; residual PD 6.3 mm vs 6.4 mm) • At four years: genotype positive patients demostrated a significantly greater loss of clinical attachment (2.3 mm vs 1.0 mm) and increased probing depth (2.2 mm vs 0.8 mm) • Periodontal Pathogens Socransky et al (2000) Found that the mean counts of specific species were higher in general IL-1 positive genotypes compared to negative subjects. Species detected at higher levels were those frequently detected with periodontal inflammation. Prevalence of genotype positive individuals in different ethnic groups • Frequency of many genetic alleles varies between ethnic groups, therefore, it is necessary to establish allele frequencies in populations before genetic test can be evaluated and used. • Caucasions: • 29% of northern european caucasions were genotype positive (Kornman et al., 1997) • African Americans: • 14.5% of non-diseased individuals and 8% of patients with localized form of aggressive periodontitis were genotype-positive. (Walker et al., 2000) • Chinese: • 2.3% of sample of 132 mod-severe periodontitis cases were genotype-positive (Armitage et al., 2000) • Hispanics: • 26% of hispanic individuals with peridontitis were genotype-positive (Lopez et al., 2005) Take home message: Dissimilarity in the prevalence of genotypes in different ethnic groups precludes extrapolating data from one group to another. GENETIC RISK DETERMINATIONWITH GENOTYPE® PST® PLUS TLR • Poprvé popsány jako gen pro typ I transmembránového receptoru → důležitá úloha při dorzoventrálním vývoji embrya Drosophily → absence tolls vedla i k vážnému postižení obranyschopnosti proti plísním a G+ bakteriím Nalezeny savčí homologa – podobná úloha ??? TLRs receptory a jejich ligandy u onemocnění parodontu Periodontitis - akutníAkutní periodontitis (apikální) • Hyperémie a serozní exsudace • Hnisání, osteoklastická přestavba kostní tkáně • 4 fáze ✓Periodontální (desmodontální) ✓Endoseální ✓Perisotální ✓Submukosní • Silná bolestivost ve všech fázích, otoky v pozdějších fázích • vztah polymorfismů v genech pro IL1B, IL1RN, FcγRIIIb,VDR a TLR4 s agresivním typem parodontitidy. Periodontitis - chronická  Sekundárně z akutní periodontitis  Primárně chronická (častější) Formy  Cirkumskriptní (granulomatozní)  Granulomatozně progresivní – píštěle (slizniční, kožní)  Difúzní – odbourávána i alveolární kost ✓ Granulační tkán ✓ Makrofágy ✓ Možnost tvorby radikulární cysty S chronickým typem parodontitidy jsou spojovány polymorfismy v genech pro IL1B, IL1RN, IL6, IL10,VDR, CD14,TLR4 a MMP1. Meta-analýza publikovaných dat asociovala varianty polymorfismů IL1A-889, IL1B 3954, IL1B-511,TNFA-308 a IL6-174 k agresivní i chronické parodontitidě. Nádory čelistních kostí – neodontogenní - benigní Osteom Exostoza ✓Torus palatinus ✓Torus mandibularis Gardnerův syndrom (autozomálně dominantní) – mnohotné osteomy čelistí, polyposis coli s vysokým maligním potenciálem, epidermální cysty, fibromy Osteochondrom – chrupavčitý povrch Cemento-osifikující fibrom ✓Mandibula, premolárně, molárně ✓Fibroblasty, kolagen a kalcifikace – různého stupně ✓Pomalu rostoucí, dobře ohraničený Nádory čelistních kostí – neodontogenní - benigní Obrovskobuněčný (reparativní) granulom • Spíše hyperplasie, nejasná etiologie • Mladší jedinci, expanzivní růst, může být destruktivní • Proliferující dobře vaskularizované stroma s četnými obrovskými buňkami (osteoklasty) • Prokrvácení a hemosiderin • Diferenciální diagnostika obrovskobuněčných lézí ✓Hyperparathyroidismus – zvýšená hladina kalcia ✓Cherubinismus – oboustranná léze ✓Osteoklastom – agresivní růst ✓Aneuryzmatická kostní cysta – cévní prostory ✓Fibrozní dysplasie - neohraničená Nádory čelistních kostí – neodontogenní - benigní Hemangiom kosti – vzácný Melanotický neuroektodermový tumor - progonom •V dětství •Vzácný •Pigmentace Nádory čelistních kostí – neodontogenní - maligní Osteosarkom • Vzácný • Mandibula • Lepší prognóza než u osteosarkomů dlouhých kostí Chondrosarkom Ewingův sarkom – PNET Mnohotný myelom • Biopsie kostní dřeně • ELFO • RizikoAL amyloidózy • Makroglosie Nádory čelistních kostí – neodontogenní - maligní Histiocytosis X (Langerhansovy buňky) • Solitární eosinofilní granulom • Mnohotný eosinofilní granulom (a Hand Schüller Christian) • Letterer-Siwe ✓Birbekova granula v elektronové mikroskopii ✓Zub „floating in the air“ – destrukce kosti v okolí zubu Metastatické nádory ✓Mléčná žláza ✓Plíce ✓Prostata ✓Thyroidea Patologie čelistního kloubu Ankylóza •Fibróza •Trauma •Tumor Dyslokace kloubu •Ehlers Danlosův syndrom, Marfanův syndrom Dysfunkce •„pain dysfunction syndrome“