Preventivní ZL 2020 RNDr. Petra Bořilová Linhartová, Ph.D. Přednáška 14 Individuální náchylnost pacienta k zubnímu kazu a zánětlivým onemocněním v dutině ústní • Genetické studie komplexních chorob • Kandidátní geny a genové varianty • Výsledky genetických studií v kontextu o zubního kazu o parodontitidy o EARR o RAS v české populaci Komplexní choroby • multifaktoriální, polygenní • roli hrají interakce různých vlivů: o genetických, o epigenetických, o behaviorálních, o psychosociálních a o environmentálních podílejících se na výsledném stavu – vzniku, rozvoji a průběhu onemocnění Komplexní choroby Monogenní Komplexní Nemoci způsobené zevními vlivy geny další faktory • pokud choroba má prokazatelně familiární výskyt, musíme očekávat podíl genetického podkladu na její manifestaci • epidemiologickou charakteristikou komplexních chorob je statistická kumulace v rodinách Komplexní choroby o fenotyp nevykazuje klasickou mendelistickou dominantní či recesivní dědičnost jako důsledek změn v jediném lokusu (tzv. jednolokusových) • predisponující „geny” zvyšují pravděpodobnost onemocnění, ale nedeterminuje jednoznačně jeho přítomnost o je nutné spolupůsobení negenetických faktorů (prostředí) = dieta, fyzická aktivita, kouření, …. a interakcí genů mezi sebou • stojí na vrcholu pomyslné pyramidy složitosti celé genetiky Genetická analýza Gen Nalezení „variant“ v příslušném genu Analýza genových variant Mendelistické nemoci Komplexní nemoci Diagnostika „Náchylnost“ (susceptibility) Klinický význam dosud „problematický“ Léčebná intervence Prognostický indikátor Genetické poradenství Genetika komplexních chorob Podklady pro hledání genetické determinace • Zvýšený výskyt v rodinách - FA • Zvýšená incidence u dvojčat : MZ > DZ • Dědičnost intermediárních fenotypů • neúplná dominance (heterozygot je intermediárním fenotypem) • mezi nejčastěji používané intermediární fenotypy patří profily genové exprese (transkriptom), variabilita v množství proteinů (proteom), metabolitů (metabolom), atd. Cíle genetického výzkumu – komplexní choroby • Zlepšit porozumění patofyziologii uvedených chorob • Přispět k diagnostice onemocnění • Nalézt parametry rizika progrese nemoci či stupně její závažnosti Nové poznatky by měly napomoci upřesnění diagnostických a/nebo léčebných postupů (individualizovaný přístup k terapii) a k PREVENCI. Genetika komplexních chorob • 1918 R. A. Fisher - polygenní model Genetika komplexních chorob • v polovině 60. let přišel s tzv. prahovým modelem D.S. Falconer ( limitní počet recesivních alel způsobí vznik onemocnění) Genetika komplexních chorob • současný model • se od těch klasických v několika ohledech dost zásadně liší o je jasné, že genotypová složka komplexních znaků není tak rozsáhlá, jak se předpokládalo (nezahrnuje stovky, max. desítky genů) o genotypová složka není homogenní ve smyslu rozsahu účinku jednotlivých genů (zahrnuje geny jak relativně velkého, tak i malého a středního účinku) o vzájemný vztah jednotlivých predisponujících genů není v žádném případě uniformně aditivní  vyjádřeno multiplikativním modelem multiplikativní model (epistatický) • souhrnný účinek predisponujících genů je roven součinu jejich dílčích účinků (interakční efekty) • uvažuje existenci dvou a více rizikových lokusů, kdy dispozice k nemoci je zvýšena při současném působení obou či více rizikových genotypů https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC138948/ Genetika komplexních chorob Genetika komplexních chorob • má vždy statistický charakter  zdědění jednotlivé patologické alely není ani nezbytné, ani dostatečné pro manifestaci komplexního fenotypu = + • dosud se nepodařilo charakterizovat žádnou komplexní polygenní chorobu ve formě úplného souboru „patologických“ alel a jejich interakcí (navzájem a se zevními faktory) Fenotyp Zevní faktory Genetické faktory Genetika komplexních chorob Fáze studia: • formulace hypotézy • selekce kandidátních genů o s intermediárním fenotypem o s klinickou manifestací nemoci o s klinickou závažností nemoci o s odpovídavostí nemoci na léčbu Genetika komplexních chorob Genetika komplexních chorob http://www.intechopen.com/books/type-1-diabetes-pathogenesis-genetics-and- immunotherapy/genetics-of-type-1-diabetes Asociační studie • studie případů a kontrol (case – control studies) • srovnávání frekvencí alel studovaného genu mezi dvěma skupinami nepříbuzných osob ze stejné populace (zamezení tzv. stratifikace) • u metod retrospektivních se vyvinula daná nemoc a až poté se zjišťuje, zda postižená osoba byla nebo nebyla vystavena sledovanému rizikovému faktoru (například přítomnost určité formy genu) • nutné definovat kritérium, podle kterého se subjekty rozdělí do skupin (např. dle klinického vyšetření) • charakteristika skupin – srovnatelnost (např. věk, pohlaví nebo rasa)= strukturální vyvažování případů a kontrol (matching) • poměr šancí (OR, odds ratio) Asociační studie http://www.nature.com/nrg/journal/v10/n12/box/nrg2670_BX3.html Genetika komplexních chorob • v klinické praxi často kolísá názor na výsledky genetických studií o neodůvodněné očekávání nalezení genů velkého účinku o velká skepse k existenci genetického podkladu u nemocí, které jsou v populaci časté (>1 %) Polymorfizmy • v regulačních oblastech, intronech i exonech • důsledkem může být: o změna AA o ukončení translace, a tím pádem zkrácení polypeptidu (často dochází k rychlé degradaci) o vliv na sestřih, transkripci nebo stabilitu mRNA • cca 7 milionů známých lidských SNPs v dbSNP databázi • HapMap projekt – běžné SNPs s MAF>5 %, populační rozdíly • Haploview – k vizualizaci LD struktury dané oblasti genu Polymorfizmy • Sériové testování –menšího počtu SNPs u mnoha subjektů • Paralelní testování - až milionu SNPs u každého subjektu najednou • Cena za SNP: sériové > paralelní Nové směry (tzv. high-throughput techniky) • multiplexing (určení velkého množství markerů v jediná reakci) nebo DNA pooling (zjištění alelické frekvence při smísení DNA vzorků více jedinců) • DNA microarrays, SnaPshot, NGS, MS a další http://www.cshlpress.org/pdf/sample/GCHD16.pdf doi:10.1371/journal.pcbi.1004259 Genetika a orální zdraví Individuální náchylnost pacienta k zubnímu kazu a zánětlivým onemocněním v dutině ústní Aftózní stomatitida Etiopatogeneze zubního kazu Individuální náchylnost pacienta k zubnímu kazu a zánětlivým onemocněním v dutině ústní protektivní faktory rizikové faktory poruchy imunitního systému fermentabilní sacharidy kariogenní bakterie slina a její komponenty remineralizace fluoridy orální hygiena náchylnost hostitele k zubnímu kazu morfologie zubní tkáně systémové choroby složení a množství sliny dieta a chuťové preference Kandidátní geny pro zubní kaz Individuální náchylnost pacienta k zubnímu kazu a zánětlivým onemocněním v dutině ústní ENAM KLK4 TUFT ALOX AMELX DLX3 BMP2 MMPs SPP1 LTF VDR ACE DEF PRPs TASR GLUT Genetické asociační studie - zubní kaz Individuální náchylnost pacienta k zubnímu kazu a zánětlivým onemocněním v dutině ústní • LTF = bakteriostatický protein nespecifické imunitní odpovědi • děti 13-15 let s/bez zubního kazu • SNP v LTF genu - NS Genetické asociační studie - zubní kaz • VDR = nukleární receptor • děti 13-15 let s/bez zubního kazu • SNP VDR TaqI v LTF genu - NS Individuální náchylnost pacienta k zubnímu kazu a zánětlivým onemocněním v dutině ústní Genetické asociační studie - zubní kaz Individuální náchylnost pacienta k zubnímu kazu a zánětlivým onemocněním v dutině ústní • ACE = enzym • děti 13-15 let s/bez zubního kazu a děti 2-6 let se zubním kazem v dočasné dentici • I/D polymorfizmus v ACE genu – NS v dočasné dentici, ale ve stálé DD genotyp rizikový pro zubní kaz (i závažnost) Genetické asociační studie - zubní kaz • GLUT2 = glukózový transportér a TAS1R2 = chuťový receptor pro sladkou chuť • děti 13-15 let s/bez zubního kazu Individuální náchylnost pacienta k zubnímu kazu a zánětlivým onemocněním v dutině ústní Faktory ovlivňující percepci chuti Preference výběru potravin a dietní návyky • volba životního stylu • interindividuálními rozdíly ve vnímání chuti ✓celkový zdravotní stav - hormonální stav, emocionální stav… ✓variabilita v genech pro chuťové receptory • užívání xenobiotik (endokanabinoidy - posílení chuťové nervové odpovědi na sladké podněty) Pozn. off-target effects hypotéza – účinek hořkých léčiv (chloroquine, haloperidol, erythromycin aj.) mimo zamýšlenou tkáň doi: 10.1073/pnas.0912048107 doi: 10.1096/fj.12-215087 Receptory chuti • chemosenzory v dutině ústní: • „jazyková mapa“ • 3 modely kódování chuti na periferii doi: 10.1038/nature05401 Signalizace ve střevě: endokrinní odezva doi:10.1038/nrendo.2015.7 Variabilita v genech pro TR • polymorfizmy v genu pro translokázu mastných kyselin (CD36) byly spojeny s rozdíly v příjmu tuků a jsou považovány za biomarkery chronických kardiovaskulárních chorob • variabilita v genu pro receptor hořké chuti (T2R38) byla asociována s odmítáním brukvovité zeleniny a kompenzačně zvýšeným příjmem tučné a sladké potravy Hořká chuť • variabilita v genu pro receptor hořké chuti (T2R38) byla asociována s kouřením a při tvorbě závislosti na nikotinu Pozn. Kuřáci mají významně nižší expresi genu receptoru hořkosti chuť než nekuřáci. • funkční varianty v obou receptorech TAS2R16 a TAS2R38 korelují s konzumací alkoholu doi: 10.1371/journal.pone.0164157 doi: 10.1136/jmg.2008.057844 doi: 10.1111/j.1530-0277.2006.00297.x doi: 10.1186/1617-9625-12-12 Umami • z japonštiny (umai, česky chutný, delikátní) • chuťový receptor pro umami taste-mGluR4 byl objeven v roce 2000 a vnímá v jídle obsaženou kyselinu glutamovou nebo její soli (glutamáty) • varianty genů pro umami chuťové receptory (T1R1 a T1R3) a receptory pro slanou chuť (epiteliální sodíkový kanál ENaC a receptor pro kapsaicin - TRPV1) byly asociovány se zvýšeným příjmem glutamátu/L-aminokyselin a soli Sladká chuť • specifické varianty v genech receptorů pro sladkou chuť (T1R2 a T1R3) byly spojeny se zvýšeným příjmem sladkostí, obezitou a rizikem rozvoje zubního kazu • v ústech: stimulace receptorů cukry a umělými sladidly aktivuje intracelulární signalizační dráhu (agustducin) – vedení signálu přes periferní chuťové nervy do mozku dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0074461 Pozn. Inverzní vztah mezi obezitou a zubní kazem Sladká chuť • ve střevě: stimulace receptorů aktivuje intracelulární signalizační dráhu (agustducin) a způsobuje uvolňování hormonů GLP- 1(glukagonu podobný peptid- 1) a GIP (na glukóze závislý inzulinotropní polypeptid) ✓mj. tyto hormony stimulují expresi glukózového transportéru (SGLT1) v enterocytech, což zvyšuje absorpci glukózy z lumen střeva Anthony Sclafani PNAS 2007; 104:14887-14888 ©2007 by National Academy of Sciences Genetická studie kontrol a případů • na STK FNUSA klinicky vyšetřeno 637 českých dětí ve věku 11-13 let ze studie ELSPAC ✓155 se zdravou denticí (KPE=0) ✓482 se zubním kazem (KPE1) • izolace DNA ze slin 155 215 482 422 0 100 200 300 400 500 600 700 KPE kaz Studovaná kohorta Metodika • analýza SNPs v genech pro T1R2 (Ile191Val, rs35874116) a glukózový transportér GLUT2 (Thr110Ile, rs5400) – TaqMan realtime PCR metodika • statistické vyhodnocení Výsledky • dentice dětí s alelou C (Val) T1R2 Ile191Val jsou častěji postiženy zubním kazem než je tomu u dětí s alelou T (Ile) ✓p<0,05, OR=1,413, 95% interval spolehlivosti: 1,014-1,969 23.9 30.7 76.1 69.3 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 děti s KPE=0 děti se zubním kazem Alelickéfrekvence[%] T1R2 Ile191Val C alela (Val) T alela (Ile) p<0.05 Výsledky • dentice dětí s alelou A (Ile) GLUT2 Thr110Ile jsou častěji postiženy zubním kazem než je tomu u dětí s alelou G (Thr) ✓p<0,05, OR=1,639, 95% interval spolehlivosti: 1,089 - 2,466 Pozn. Ile alela spojena s vyšším příjmem cukrů 12.9 19.5 87.1 80.5 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 děti s kpe=0 děti se zubním kazem Alelickéfrekvence[%] GLUT2 Thr110Ile A alela (Ile) G alela (Thr) p<0.05 Shrnutí • nové poznatky z molekulárně biologických a genetických studií na poli chuťových receptorů mohou přispět k pochopení jejich funkce ve zdraví i nemoci a napomoci tak k vývoji personalizované strategie prevence vzniku a rozvoje vybraných chronických chorob Genová variabilita v chuťových receptorech – biomarkery zdraví sladká "tučná" kyselá hořká slaná umami ↑příjem cukrů obezita zubní kaz ↑příjem cukrů a tuků ↓brukv. zelenina závislost na nikotinu a alkoholu obezita choroby KVS ↑příjem tuků obezita choroby KVS ↑příjem glutamátu a soli choroby KVS dx.doi.org/10.1080/10408398.2016.1152229 Genetické asociační studie - zubní kaz Individuální náchylnost pacienta k zubnímu kazu a zánětlivým onemocněním v dutině ústní • DLX3, BMP2 – proteiny hrající úlohu při amelogenezi • děti 13-15 let s/bez zubního kazu a děti 2-6 let se zubním kazem v dočasné dentici • SNPs v DLX3 a BMP2 genech - NS Genetické asociační studie - zubní kaz Individuální náchylnost pacienta k zubnímu kazu a zánětlivým onemocněním v dutině ústní • ENAM – protein hrající úlohu při vývoji skloviny • děti 13-15 let s/bez zubního kazu a děti 2-6 let se zubním kazem v dočasné dentici • SNP v ENAM genu - NS Zubní kaz - hodnocení rizika Cariogram • klinické posouzení rizika 1 2 3 Etiopatogeneze parodontopatií Individuální náchylnost pacienta k zubnímu kazu a zánětlivým onemocněním v dutině ústní Yucel-Lindberg T, Båge T. Inflammatory mediators in the pathogenesis of periodontitis. Expert Rev Mol Med. 2013;15:e7. doi: 10.1017/erm.2013.8. Accessed April 16, 2014. Hajishengallis G, Darveau RP, Curtis MA. The keystone-pathogen hypothesis. Nat Rev Microbiol.¨2012;10(10):717-725. Vztah DM a orálního zdraví Individuální náchylnost pacienta k zubnímu kazu a zánětlivým onemocněním v dutině ústní Kuo LC, Polson AM, Kang T. Associations between periodontal diseases and systemic diseases: a review of the inter-relationships and interactions with diabetes, respiratory diseases, cardiovascular diseases and osteoporosis. Public Health. 2008;122(4):417-433. Parodontální bakterie Inzulínová rezistence Hyperglykémie Endotoxin LPS IL-1β TNF-α PGE2 Nástup nebo zhoršení DM Onemocnění parodontu → Diabetes mellitus • v důsledku rozdílné imuno-/zánětlivé reaktivity na bakteriální osídlení parodontu při hyperglykémii se přibližně 3krát zvyšuje riziko vzniku parodontitidy u diabetiků s nediabetiky Kandidátní geny pro parodontitidu Individuální náchylnost pacienta k zubnímu kazu a zánětlivým onemocněním v dutině ústní MMPs Cytokiny ApoE VDR CD14 OPG SPP1 Genetické asociační studie - parodontitida • ApoE = pluripotentní glykoprotein, role v mtb lipidů, protizánětlivé účinky • CP vs. kontroly, lipidové koncentrace v plazmě, parodontální bakterie • CP - ↑TC a LDL (ApoE) Individuální náchylnost pacienta k zubnímu kazu a zánětlivým onemocněním v dutině ústní Isoformy ApoE • celkem asi 30 isoforem apoE • v evropské populaci - isoformy E2, E3 a E4, lišící se aminokyselinami na 112. a 158. místě (kódovány alelami ε2, ε3 a ε4) – kodominance • isoforma E3, v populaci nejvíce rozšířená, leží obecně svými biochemickými a funkčními vlastnostmi mezi E2 a E4 • genotyp ε2/ε2 je podmínkou nutnou, ne však postačující k rozvoji familiární hyperlipidémie III. typu (FHLP III se vyskytuje u <10% nositelů ε2/ε2, ostatní jsou spíše normo- až hypolipidemičtí) • nosičství alely ε4 je vůbec nejvýznamnější genetickou determinantou pro vznik late-onset Alzheimerovy demence ApoE Genetické asociační studie - parodontitida • IL-4 = inhibuje Th1 a stimuluje Th2 • CP vs. kontroly, in vitro stimulace PBMCs, cytokinová produkce po stimulaci parodontální bakterie - T. forsythia i P. intermedia + IL-4 genotypy + IL-6 koncentrace Individuální náchylnost pacienta k zubnímu kazu a zánětlivým onemocněním v dutině ústní Genetické asociační studie - parodontitida • IL-8 = chemokin a aktivátor neutrofilních granulocytů, iniciace a amplifikace akutní zánětlivé reakce a chronických zánětlivých procesů • CP, AgP vs. kontroly, paropatogeny • CP - protektivní haplotypy, vztah variability v IL-8 sekvenci a přítomnosti specifických bakterií Individuální náchylnost pacienta k zubnímu kazu a zánětlivým onemocněním v dutině ústní Genetické asociační studie - parodontitida • IL-17 = pluripotentní cytokin, autoimunita (akcelerace apoptózy 𝛽 buněk pankreatu), obranné reakce proti bakteriálním a kvasinkovým infekcím aktivací produkce antimikrobiálních peptidů a prozánětlivých cytokinů, chemokinů, MMPs a proteinů zapojených v mtb kostí • T1DM (+CP), CP vs. kontroly, IL-17 koncentrace u PBMCs po stimulaci, paropatogeny • IL-17A −197 A alela riziková pro T1DM, A alela - ↑ c HbA1c u T1DM • A alela - ↑ c IL-17 v PBMCs (stimul P. gingivalis i nestimul) • SNP + bakterie červeného komplexu u CP i T1DM+ CP Individuální náchylnost pacienta k zubnímu kazu a zánětlivým onemocněním v dutině ústní Genetické asociační studie - parodontitida Individuální náchylnost pacienta k zubnímu kazu a zánětlivým onemocněním v dutině ústní • IL-1 a IL-6 = prozánětlivé cytokiny • pilotní data Individuální náchylnost k parodontitidě - test PerioPredict x OralDNALabs x GenoType IL-1 • IL-1 genové varianty Etiopatogeneze EARR Individuální náchylnost pacienta k zubnímu kazu a zánětlivým onemocněním v dutině ústní Darcey J, Qualtrough A. Resorption: part 1. Pathology, classification and aetiology. Br Dent J. 2013 May;214(9):439-51. doi: 10.1038/sj.bdj.2013.431. Kandidátní geny pro EARR Individuální náchylnost pacienta k zubnímu kazu a zánětlivým onemocněním v dutině ústní Cytokiny P2RX7 VDR OPG SPP1 Genetické asociační studie - EARR Individuální náchylnost pacienta k zubnímu kazu a zánětlivým onemocněním v dutině ústní • IL-1 = α a β formy (pro-), antagonista receptoru (protizánětlivý) • EARR vs. kontroly, po ortodontické léčbě, 11-21 let • IL-1RN – krátká alela riziková pro vznik EARR u dívek Genetické asociační studie - EARR Individuální náchylnost pacienta k zubnímu kazu a zánětlivým onemocněním v dutině ústní • P2RX7, IL-17, SPP1, OPG • EARR vs. kontroly, po ortodontické léčbě, 11-21 let • délka léčby i P2RX7 haplotyp rizikový pro EARR Etiopatogeneze RAS Individuální náchylnost pacienta k zubnímu kazu a zánětlivým onemocněním v dutině ústní Kandidátní geny pro RAS Individuální náchylnost pacienta k zubnímu kazu a zánětlivým onemocněním v dutině ústní Kandidátní geny pro RAS Individuální náchylnost pacienta k zubnímu kazu a zánětlivým onemocněním v dutině ústní Genetické asociační studie - RAS • IL-1 a IL-6 = prozánětlivé cytokiny • pacienti s RAS vs. kontroly, vyloučení osob s chorobami projevujícími se vředy • SNPs v IL-1 a IL-6 genech - NS Individuální náchylnost pacienta k zubnímu kazu a zánětlivým onemocněním v dutině ústní Genetické asociační studie - RAS • NLRP3 = inflamzóm • pacienti s RAS vs. kontroly, vyloučení osob s chorobami projevujícími se vředy • jen NLRP3 rs4612666 TT genotyp asociován s rizikem RAS Individuální náchylnost pacienta k zubnímu kazu a zánětlivým onemocněním v dutině ústní ̶ symptomatická terapie, podpůrná terapie – Škachova kůra kyselina listová, pyridoxin ̶ kyselina listová je pouze prekurzorem biologicky aktivní látky – folátu označeného jako vitamin B9 ̶ glukosaminová sůl 5-methylfolátu (4. generace) - oproti 3. generaci je dlouhodobě stabilní, má vysokou rozpustnost ve vodě, lepší biologickou dostupnost a bezpečnost Farmakogenetická studie 6 4 ̶ polymorfizmy: C677T, A1298C ̶ geneticky podmíněná snížená aktivity enzymu → zpomalená metylace homocysteinu na methionin → akumulace homocysteinu v plazmě → KV riziko ❖ Zvýšená prevalence tromboembolických poruch u nositelů ❖ u homozygotních nositelek variantních alel zvýšené riziko spontánních abortů ❖ výšená toxicita cytostatika CMF (cyklofosfamid, MTX, 5-FU) • MTHFR (methylen-tetrahydrofolát-reduktáza) Farmakogenetická studie 6 5 Kyselina listová Dihydrofolát Enzym MTHR 5-methylfolát Tetrahydro folát • Pilotní studie Farmakogenetická studie 6 6 • Design pilotní studie Farmakogenetická studie 6 7 ̶ 10 pacientů – genotypizovaní na haplogenotypy v genu MTHFR (IM a PM) ̶ Farmakoterapie v upraveném designu dvojitě zaslepené zkřížené studie (cross-over design) probíhala od jara 2018 v délce trvání 3 měsíců. ̶ Pacientům byl ve třífázovém schématu podáván aktivní folát (glukosaminová sůl 5methylfolátu), vitamíny B6 a D3 28x placebo 1x D3 28x B9 + B6 I. fáze kontrolní (28 dní) II. fáze terapeutická (28 dní) III. fáze sledovací (28 dní) 28x placebo Farmakogenetická studie 6 8 • Výsledky pilotní studie Farmakogenetická studie 6 9 • Výsledky pilotní studie ̶ zprostředkovává biologickou aktivitu vitaminu D • VDR Farmakogenetická studie 7 0 1,25(OH)2 D3 jádro VDRE DNA mRNA protein protein • ↑ funkce IS • ↑ apoptózy • ↓ angiogeneze VDR VDR mRNA VDR RXR 1,25(OH)2 D3 VDR RXR 1,25(OH)2 D3 Upraveno dle Khan TA, et al., 2015