Speciální hematologická
vyšetření
Bourková L., OKH FN Brno
Vyšetřování anémií
Sledování vyšetření
Hodnotit:
 hloubku anémie v KO
 změny v hodnotách měřených i počítaných parametrů RBC
 početní změny WBC i PLT
 morfologické změny erytrocytů v periferní krvi (barevné, tvarové, inkluze)
 morfologické změny WBC i PLT v celém nátěru
 morfologické a množstevní změny erytrocytární populace v KD
 morfologické změny i leukocytární populace a MGK
 komplexně výsledek celého KO a nález v KD: může se jednat o první
příznaky nádorového onemocnění
 souvislost se speciálními vyšetřeními
Vyšetření retikulocytů
 retikulocyty
 přítomné RNA → schopnost tvorby HGB (analýza HGB v Retic)
 odráží schopnost KD produkovat RBC
 během 1 – 2 dnů dospívá Retic ve zralý erytrocyt
 ↑ počet Retic → aktivace KD (zvyšování IRF)
 ↓ počet Retic → útlum KD (snižování IRF)
 mikroskopicky
 supravitální barvení RNA v buněčných organelách
(ribozomy, endoplazmatické retikulum)
 analyzátorem
 analýza prošlého a odraženého světla:
probíhá na precipitovaných síťových strukturách RNA
 analýza fluorescence:
vlákna RNA jsou obarvena fluorescenčními barvami
RBC
Retic
Cytochemické vyšetření zásobního železa
 Zásobní železo Fe3+:
ferritin, hemosiderin (agregované molekuly feritinu)
 Princip vyšetření:
(Fe3+) + ferrokyanid draselným - K4[Fe(CN)6] + HCl
→ barevný komplex = berlínská (pruská) modř - Fe4[Fe(CN)6]3
 Hodnocení:
 ve 100 NRBC
 zelenomodrá granula v:
o erytrocytech (siderocyty), NRBC (sideroblasty), NRBC okolo 2/3 jádra (prstenčité sideroblasty),
makrofázích (siderofágy), extracelulárně
 Normální hodnoty:
20 – 60 % pozitivních NRBC
2-4 siderofágy ze 6 nalezených makrofágů
 Klinický význam:
 snížení hodnoty:
o sideropenické anémie
 zvýšené hodnoty:
o sideroblastické (přítomné prstenčité sideroblasty)
o hemolytické anémie, megaloblastové anémie
o MDS, leukémie
Základní vyšetření pro hemolytické anémie
 Obecné testy:
 volný hemoglobin v plazmě (základní metodika pro vyšetřování intravaskulární hemolýzy)
 osmotická rezistence
 test autohemolýzy
 hemosiderin v moči
 Heinzova tělíska
 Testy na průkaz abnormálních hemoglobinů
 hemoglobin F
 hemoglobin A2
 elektroforéza hemoglobinu
 Testy na průkaz nedostatku enzymů
 glukózo-6-fosfátdehydrogenáza
 pyruvátkináza
 Heinzova tělíska
Obecné testy
 stanovení volného HGB v plazmě
 Princip - spektrofotometricky:
oxidace HGB (Fe2+) → methemoglobin (Fe3+) + KCN → barevný komplex - hemiglobinkyanid.
 vyšetření osmotické rezistence
 Princip - makroskopicky:
stanovení odolnosti RBC v různě koncentrovaných
hypotonických roztocích NaCl (fyziologického r.).
 test autohemolýzy
 Princip - spektrofotometricky:
sledování hemolýzy RBC v prostředí:
o fyziologického roztoku
o fyziologického roztoku s glukózou
o fyziologického roztoku s ATP.
 vyšetření hemosiderinu v moči
 Princip - mikrosopicky:
Fe3+ v hemosiderinu + HCl + K4[Fe(CN)6]
→krystalky - berlínská (pruská) modř - Fe4[Fe(CN)6]3
normál
patologie
Testy na průkaz abnormálních hemoglobinů
 hemoglobin F
 Princip - mikroskopicky:
Inkubace nafixovaných preparátů v kyselém prostředí (pH 3,3).
HGB A je z erytrocytů vyplaven.
HGB F je vůči prostředí rezistentní, v erytrocytech zůstává.
 Hodnocení – [%] :
novorozenci (50-90%), věk<2 roky (0-4%), věk>2 roky (0-4%)
 hemoglobin A2
 Princip - chromatograficky:
Na pozitivně nabité částice pryskyřice se se naváží negativně nabité části HGB,
jednotlivé frakce HGB se vymývají pufrem, 1. frakce je s HGB A2, 2. frakce je s HGB S.
 Hodnocení:
Podíly jednotlivých frakcí HGB se stanovují spektrofotometricky.
 elektroforéza hemoglobinu
 Princip:
V elektrickém poli a zásaditém prostředí se hemoglobiny pohybují různě rychle, na základě
velikosti negativního náboje globinového řetězce, v závislosti na přítomných aminokyselinách.
Negativně nabité molekuly HGB se pohybují k anodě (+).
postupná eluce frakcí
Testy na průkaz nedostatku enzymů
 Heinzova tělíska
 Princip - mikroskopicky:
Heinzova tělíska znázorňují vysrážený degenerovaný hemoglobin v případě, že glykolytické
enzymy erytrocytů nejsou schopny zabránit oxidaci hemoglobinové molekuly. Precipitáty se
jeví jako oválná tělíska v erytrocytech. Objevují se těsně u buněčné membrány, ke které
přiléhají, barví se supravitálně brillantcresylovou modří přímo nebo po inkubaci s
acetylfenylhydrazinem.
 glukózo-6-fosfát dehydrogenáza (G-6-PDH)
 Princip - spektrofotometricky:
Kinetické měření aktivity enzymu v UV oblasti. G-6PDH se podílí na redukci NADP+ na NADPH
(nikotinamid adenin dinukleotid fosfát), nárust NADPH je přímo úměrná aktivitě G-6-PDH.
 pyruvátkináza
 Princip - spektrofotometricky:
Kinetické měření aktivity enzymu v UV oblasti. V přítomnosti pyruvátkinázy dochází při
katalytické reakci ke spotřebě NADPH, jejíž pokles je nepřímo úměrné aktivitě pyruvátkinázy.
Retic
Heinz. těl. v ery
Bite cells
Cytomorfologická vyšetření krevních
buněk v souvislocti s onkologickou
hematologií
Sledování vyšetření
Hodnotit:
 celý krevní obraz
 početní změny WBC, RBC, PLT, přístrojová hlášení
 morfologické změny v periferní krvi
 WBC spolu s diferenciálním rozpočtem, RBC, PLT
 morfologické a množstevní změny v kostní dřeni
 u leukocytární, erytrocytární a trombocytární populace, včetně MGK
 referenční meze myelogramu dospělých:
http://www.hematology.cz/doporuceni/laboratorni_sekce/files/referencni_m
eze/Doporuceni_LS_CHS_CLS_JEP-Referencni_meze-
myelogram_dospelych_v1.pdf
 cytochemická vyšetření
 počet blastů pro diagnostiku akutní leukémie:
 dle WHO klasifikace > 20%
Příklady morfologických abnormalit u akutních lymfoblastických leukémií
Dělení dle FAB klasifikace (není součástí WHO klasifikace)
 ALL – L1
 morfologické nálezy:
o menší blastické buňky
o vysoký N/C (nukleo-cytoplazmatický) poměr
o jemnější chromatin
o nejasná jadérka
 ALL – L2
 morfologické nálezy:
o větší, často polymorfní blastické buňky
o bohatší cytoplazma
o jasná jadérka
 ALL – L3
 morfologické nálezy:
o velké buňky
o bazofilní cytoplazma
o vakuolizace (Burkittův lymfom)
Příklady morfologických abnormalit u akutních myeloblastických leukémií
Dělení dle FAB klasifikace
 AML – M0
 morfologické nálezy:
o AML s minimálními znaky myeloidní diferenciace
o agranulární blasty
 AML – M1
 morfologické nálezy:
o AML bez vyzrávání
o Auerovy tyče
 AML – M2
 morfologické nálezy:
o AML s vyzráváním
o podíl monoctárních buňěk <20%
o Auerovy tyče
Příklady morfologických abnormalit u akutních myeloblastických leukémií
Dělení dle FAB klasifikace
 AML – M3
 morfologické nálezy:
o AML - promyelocytární
o do nádorové populace buněk zahrnovány
blasty i abnormální promyelocyty
 typ M3 – hypergranulární
Auerovy tyče, snopce Auerových tyčí
 typ M3 – variantní
dvoulaločnatá, mnoholaločnatá jádra
až agranulace cytoplazmy, oválné inkluze,
Auerovy tyče
 AML – M4
 morfologické nálezy:
o AML - myelomonoctární
o podíl monoctárních buněk > 20%
o v KO bývá monocytóza
 AML – M5
 morfologické nálezy:
o AML - monocytární
 typ M5A
monoblasty, méně granulace, vakuolizace
 typ M5B
více promonocytů, monocytů > 80%
M5A M5B
Příklady morfologických abnormalit u akutních myeloblastických leukémií
Dělení dle FAB klasifikace
 AML – M6
 morfologické nálezy:
o erytroleukémie
o erytroblasty (proerytroblasty + NRBC) > 50% ze všech jaderných buněk
o myeloblasty > 20% (mohou být Auerovy tyče)
o dysplázie v erytrocytární řadě (členitá jádra, karyorexe, vícejaderné NRBC, vakuolizace, megaloblasty
 AML – M7
 morfologické nálezy:
o megakaryocytární leukémie
o blasty většinou megakaryoblasty
o dysplatické změny MGK
Příklady morfologických abnormalit u lymfoproliferativních onemocnění
 základní nálezy
 změny v počtu WBC (snížení, normální počet, zvýšení – dle typu onemocněí až nad 100x109/l i přes 500x109/l)
 lymfoctóza
 reaktivní LY, atypické LY (atypie jádra a cytoplazmy), mladší lymfocyty, holá jádra (jaderné/Gumprechtovy stíny)
 morfologické abnormality
lymfocyt
reaktivní LY
CLL
jaderné stíny
PLL
proly
HCL
splenický lymfom
vilózní LY
zářezy v jádře
vysoký N/C poměr
členitá jádra
LGL lymfocyt
myelom
D - Příklady morfologických abnormalit u myeloproliferativních onemocnění
 základní nálezy
 zvýšený počet WBC ( často až 100x i více), zvýšený počet PLT (možný extrémní počet až k 1000x109/l)
 možné morfologické nálezy v návaznosti na typ onemocnění:
o neutrofilie a mladší vývojová stádia (myelocyty, metamyelocyty), bazofilie, může být eozinofilie,
možná přítomnost různého podílu blastů, v KD hyperplazii granulocytárních řad
o NRBC v periferní krvi, sledovat morfologické odchylky RBC (slzičkovité RBC)
o patologická morfologie PLT, i gigantické PLT, v KD zmnožené dysplatické MGK, holá jádra MGK v periferii
 morfologické abnormality
↑WBC
BASO
CEL
holé jádro MGK
ET
ET
MF
PV
CML
Laboratorní nálezy u myelodysplastického syndromu
 základní nálezy v periferní krvi
* cytopenie
 erytrocyty:
anémie, ↑RDW, polychromázie, poikilocytóza, inkluze v RBC, dysplázie NRBC, ↓RETIC
 leukocyty:
obvykle ↓WBC, ↓NE, hypo/hyper(>5segmentů) - segmentace NE, pseudo-Pelgerova-Huëtova anomálie,
hypo/hyper/nerovnoměrná-granulace NE, vakuolizace NE, evt. přetrvávající bazofílie cytoplazmy NE,
abnormální mono/promonocyty
 trombocyty:
většinou ↓PLT, ↑PDW, makro PLT, hypogranulární PLT, fragmenty cytoplazmy MGK, mikro MGK, jádra MGK
 základní nálezy v kostní dřeni
 dyserytropoéza:
podobné dysplatické změny jako v PK, dále:
o jádro: mezijaderné můstky, karyorexe, vícejadernost, megaloidní rysy, zneokrouhlení jádra
o cytoplazma: vakuolizace, nerovnoměrná barvitelnost
 dysgranulopoéza:
podobné dysplatické změny jako v PK, dále:
o asynchronie vyzrávání jádra a cytoplazmy, Auerovy tyče, pseudo-Chediakova-Higashiho granula
 dysmegakaryopoéza:
o mikro/obrovské MGK, hypo/hyper - lobularizace MGK, vícejaderné MGK, vakuolozace, hypogranulace MGK
 Sledovat:
 charakter dysplazie pro rozlišení typu MDS
 počet blastů v PK a KD
 cytopenie v KO (bez dysplastických změn by neměla být návaznost na diagnostiku MDS)
Příklady morfologických abnormalit u myelodysplastického syndromu
heterozygot homozygothomozygot
hyposegmentace
hypogranulace
dysplázie NRBC
mitóza
NRBC
pseudo-
Chediakova-Higashiho
granula
Auerovy. tyče
makrofág
dysplatický
MGK
dysplatický
MGK
dysplatický MGK
hyposegmentace
hypogranulace
hyposegmentace
hypogranulace
blast
hyposegmentace
dysplázie NE
interplazmatický
můstek
substrát
↓
inkubační roztok +
enzym
(glykogen,
lipidy)
↓
buňka

obarvené precipitáty
↓
v místech přítomnosti enzymu
(substance) v buňce
Cytochemická vyšetření
hodnocení -mikroskopicky:
negativní (0) až počet (+)
intenzita zbarvení je úměrná
množství enzymu (glykogenu,
lipidů)
fixace nátěru
Cytochemická barvení:
o neutrofilní alkalická fosfatáza
myeloeroxidáza
PAS (Periodic Acid – Schiff)
nespecifická esteráza (s blokádou fluoridem sodným)
kyslá fosfatáza (s rezistencí na kyselinu L-vinnou)
Cytochemická vyšetření
o neutrifilní alkalická fosfatáza
 hodnocení: v periferní krvi, neutrofilní tyče a segmenty
 klinický význam: ↓ALP u chronické myeloidní leukémie, ↑ALP u chronické neutrofilní leukémie
 myeloperoxidáza
 hodnocení: v primární granulaci NE, EO, MO (množství enzymu se zvyšuje s vyzráváním buněk),
lymfocyty jsou vždy negativní, sledování přítomnosti Auerových tyčí
 klinický význam: rozlišení myeloblastické nebo monoblastické leukémie od lymfoblastické
 PAS
 hodnocení: typ pozitivity (difúzní, jemně nebo hrubě pozitivní granula)
o fyziologická: myel.buňky (difúzní), monocytárníbuňky (jemná granula),
lymfocyty (mohou být výraznější granula), NRBC (negativní)
o patologická: LY u CLL (většinou výrazná granulární pozitivita), lymfoblasty u ALL (většinou pozitivní),
NRBC hrubozrná pozitivita
 klinický význam: leukémie, MDS, anémie
2+ 3+
Cytochemická vyšetření
 nespecifická esteráza s blokádou fluoridem sodným
 princip: enzym reaguje se substrátem nebo je reakce blokována NaF (současné barvení dvou nátěrů)
 hodnocení:
o po inkubaci bez blokády: myeloidní buňky a lymfocyty pozitivní (0/+), monocyty (+/+++)
o po inkubaci s NaF: pozitivita u myeloidních buněk a lymfocytů stejná nebo jen lehce zeslabená, u monocytů
zeslabení (0/+)
 klinický význam: k průkazu AML M4 a AML M5
 kyselá fosfatáza s rezistencí na kyselinu L-vinnou
 princip: enzym reaguje se substrátem nebo je reakce blokována kyselinou L-vinnou,
pokud je v buňce přítomen isoenzym -5, potom je reakce na kyselinu L-vinnou
rezistentní (současné barvení dvou nátěrů)
 hodnocení:
o po inkubaci bez blokády: granulocyty, monocyty, lymfpcyty pozitivní na (0/+)
o po inkubaci s kyselinou L-vinnou: pozitivita zůstává pouze v lymfocytech s izoenzymem-5
 klinický význam: pozitivita v lymfocytech po inkubaci s kyselinou L-vinnou slouží k diagnostice
klasické formy HCL
HCL
po blokádě NaF
po blokádě k. L-vinnou
před blokádou
před blokádou
Podpořeno MZ ČR – RVO (FNBr, 65269705)