Speciální koagulační
vyšetření I
Zavřelová J.
Koagulační faktory
Vyšetření funkční aktivity
 jednofázová metoda na principu APTT
 FF VIII, IX, XI, XII, PK, HMWK
 jednofázová metoda na principu PT
 FF II, V, VII, X
Vyšetření antigenu
 EID, ELISA
jiné faktory
VIII
?
jiné faktory
VIII
VIII
?
jiné faktory
F VIII deficitní plazmavyšetřovaná plazma
jiné faktory VIII
?
ředění 1:10 pufrem
APTT
koagulační čas závisí na aktivitě F VIII
Vyšetření funkční aktivity
koagulačních faktorů
Postup:
1 díl ředěné vyšetřované plazmy
1 díl neředěné deficitní plazmy
 FF vnitřního systému
1 díl APTT reagencie, inkubace
1 díl CaCl2
 FF vnějšího systému
inkubace, 2 díly Ca2+-tromboplastinu
stanovení koagulačního času APTT/PT
odečtení % z kalibrační křivky
Koagulační faktory - kalibrace
Kalibrační materiál
 komerční
Vyšetření
 různých ředění výchozí kalibrační plazmy s
udanou hladinou FF:100%, 50 %, 25 %,12,5% ,
(pro F VIII, IX 6,25 %, ...)
Kalibrace čtyř…více bodová
Závislost log/log (lin/log)
Klinický význam - zejména  FF ,  F VIII (IX, XI)
Snížení faktorů
Snížení - mimo kalibrovanou oblast (< 10 %)
Výchozí ředění vyšetřované plazmy 1 :10
 opakování vyšetření s nižším ředěním plazmy 1 : 5
 odečtení a vydělení výsledku dilučním faktorem (:2)
Kalibrační křivka Low
 kalibrovaná oblast cca 1,0 – 25,0 %
 výchozí ředění vyšetřované plazmy 1:5
Zvýšení F VIII
Zvýšení > 100 %
Výchozí ředění vyšetřované plazmy 1 :10
 opakovat vyšetření s vyšším ředěním plazmy 1 : 20
 odečíst a vynásobit výsledek dilučním faktorem (x2)
Pro F VIII > 200 %
 opakovat s ředěním 1:40
 odečíst a vynásobit 4x
Pro F VIII > 400 %
 opakovat s ředěním 1:80
 odečíst a vynásobit 8x
Defekty faktorů
Vrozený
 hemofílie A, hemofílie B, defekt FF XII, XI,
PK, HMWK, vWF, defekt FF II, V, VII, X
Získaný
 snížená syntéza
 zvýšená spotřeba
 zvýšené ztráty
FVIII -fotometrická metoda
Tvorba enzymatického komplexu- tenázy
 F VIIIa aktivovaný trombinem v přítomnosti
konstantního množství F IXa, PL a Ca 2+
která aktivuje F X dodávaný v konstantním
nadbytku na F Xa
Měření tvorby F Xa pomocí chromogenního
substrátu
Korekční testy
 sledování korekce (zkrácení) APTT/PT po
přídavku normální plazmy NP (směs 1:1)
 prodloužení se koriguje - defekt faktorů
 prodloužení se nekoriguje nebo jen
částečně - přítomnost inhibitoru
 specifického
 nespecifického
Korekční test
 korekce
Vzorek APTT (s)
NP 35,0
1NP + 1 PP 38,0
PP 75,0
Korekční test
 není korekce
Vzorek APTT (s)
NP 35,0
1NP + 1 PP 60,0
PP 65,0
Korekční test
 jen částečná korekce
Vzorek APTT (s)
NP 35,0
1NP + 1 PP 50,0
PP 65,0
Identifikace specifického inhibitoru
screening (prodloužení APTT/PT)
průkaz inhibitoru (cirkulující antikoagulans)
průkaz specifity inhibitoru (vyšetření faktorů)
kvantifikace inhibitoru (Bethesda metoda)
Průkaz specifického inhibitoru
Inhibitor namířený proti FF, časově závislý
Orientačně tzv. „cirkulující antikoagulans“ „CAg“
 Vyšetření APTT/PT u vzorků plazmy pacienta,
normálu a směsí PP+NP (1+4, 1+1, 4+1)
před a po 2 hodinové inkubaci při 37 °C
Hodnocení cirkulující antikoagulans
pokud není přítomnost/nepřítomnost zřetelná
vhodné spočítat pro jednotlivé směsi teoreticky
čas, který by odpovídal smíchání různého počtu
dílů PP a NP
 pro směs 1 po: (1xPPpo + 4xNPpo):5
 pro směs 2 po: (1xPPpo + 1xNPpo):2
 pro směs 3 po: (4xPPpo + 1xNPpo):5
pokud je naměřený čas delší než teoretický
svědčí to pro přítomnost inhibitoru
Cirkulující antikoagulans
vyhodnocení výsledků
Porovnání naměřených koagulačních časů
jednotlivých směsí PP + NP s časy PP a NP
 před inkubací
 po inkubaci
Průkaz inhibitoru
 příměs 1/5 PP výrazně prodlužuje čas NP (směs 1+4)
– silný inhibitor
 není žádná/částečná korekce (směs 1+1)
 příměs 1/5 NP nezpůsobí korekci časů PP pacienta
(směs 4+1) - slabý inhibitor
Cirkulující antikoagulans
grafické znázornění
 0% = NP
 20% = směs PP+NP 1+4
 50% = směs PP+NP 1+1
 80% = směs PP+NP 4+1
 100% = PP
Cirkulující antikoagulans APTT
- inhibitor nepřítomen
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0% 20% 50% 80% 100%
sec
před
ink
po ink
Cirkulující antikoagulans APTT
- časově závislý inhibitor
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0% 20% 50% 80% 100%
sec
před ink
po ink
Cirkulující antikoagulans APTT
- časově nezávislý inhibitor
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0% 20% 50% 80% 100%
sec
před ink
po ink
Průkaz specifického inhibitoru
Test „cirkulující antikoagulans“
orientační vyšetření, kterým pouze prokazujeme
 přítomnost/ nepřítomnost inhibitoru
 časovou závislost/ nezávislost inhibitoru
Průkaz specifity inhibitoru
Vyšetření funkční aktivity faktorů
 jednofázová metoda na principu PT a/ APTT
Snížení funkční aktivity jen jednoho faktoru
 faktor < 10%, ale může být i vyšší
Identifikace specifického inhibitoru
Kvantitativně Bethesda metoda
stanovení zbytkové aktivity faktoru po dvou
hodinové inkubaci různých ředění pacientovy
plazmy PP s normální plazmou NP (zdroj
faktoru)
1 Bethesda jednotka (B.U.)
množství inhibitoru, které během inkubace
inaktivuje 50 % nabídnutého faktoru
přítomnost inhibitoru  0,6 B.U.
Bethesda metoda - postup
 Titrace vyšetřované plazmy PP (neř, 1:2, 1:4, 1:8…) a
příprava směsí (1 díl PP a 1 díl NP)
 Příprava kontrolní směsi (1 díl pufru + 1 díl NP)
 Inkubace směsí PP a kontrolní 2 hod při 37 °C
 Vyšetření faktoru v směsích PP a kontrolní
 Výpočet zbytkové aktivity faktoru (Azb)
 =(aktivita směsi PP/ aktivita kontrolní směsi) x100
 Odečtení B.U. (graf závislosti Azb na B.U.)
 Azb 100%...0 B.U.
 Azb 50%.....1 B.U.
Nijmegen modifikace Bethesda metody
Přesné stanovení nízkých titrů inhibitorů
 eliminace vlivu změn pH použitím pufrované NP
 použití faktor deficitní plazmy k ředění namísto pufru
Příklady vyšetření inhibitoru
Bethesda metoda
 Kontrolní směs: 40%
 neř.: 0%
 1:2 1%
 1:4 2%
 1:8 6%
 1:16 20%
 1:32 28%
 1:64 32%
 1:128 39%
 1:256 40%
Inhibitor 16 B.U.
 Kontrolní směs: 60%
 neř.: 0%
 1:2 0%
 1:4 0%
 1:8 7%
 1:16 22%
 1:32 38%
 1:64 51%
 1:128 54%
 1:256 59%
Inhibitor 21 B.U.
Příklad vyšetření inhibitoru
Bethesda metoda – pacient 1,2
 Kontrolní směs: 48%
 neř.: 40%
 1:2 43%
 1:4 44%
 1:8 45%
 1:16 42%
 1:32 46%
 1:64 48%
 1:128 47%
 1:256 49%
Inhibitor ? B.U.
 Kontrolní směs: 54%
 neř.: 0%
 1:2 0%
 1:4 2%
 1:8 8%
 1:16 15%
 1:32 27%
 1:64 39%
 1:128 51%
 1:256 59%
Inhibitor ? B.U.
Příklad vyšetření inhibitoru
Bethesda metoda – pacient 1,2
 Kontrolní směs: 48%
 neř.: 40%
 1:2 43%
 1:4 44%
 1:8 45%
 1:16 42%
 1:32 46%
 1:64 48%
 1:128 47%
 1:256 49%
Inhibitor 0,24 B.U. - nepřítomen
 Kontrolní směs: 54%
 neř.: 0%
 1:2 0%
 1:4 2%
 1:8 8%
 1:16 15%
 1:32 27%
 1:64 39%
 1:128 51%
 1:256 59%
Inhibitor 32 B.U.
Identifikace LA (dle SSCC ISTH)
 průkaz prodloužení fosfolipid závislého testu
(dAPTT, dRVVT) = screening
 průkaz inhibitoru (negativní korekční testy)
 průkaz fosfolipidové závislosti inhibitoru
(neutralizační testy)
vyloučení jiných koagulopatií
Použití bezdestičkové plazmy (PFP)
 dvojnásobná centrifugace
Laboratorní diagnostika - LA
Screening (reagencie s PL)
 dAPTT
 dRVVT (aktivuje F X v přítomnosti PL a Ca2+ )
Korekční testy
 na principu testů, které ve screeningu pozitivní
 vyšetření PP, NP, směsi 1:1 PP+NP bez inkubace
(časově nezávislý inhibitor)
Konfirmační testy ( PL)
 na principu testů, kde screening pozitivní
 vyhodnocení zkrácení koagulačních časů
Vyhodnocení screeningové testy - LA
dAPTT
 R > cutt off pozitivní
 R < cut off negativní
dRVVT
 R > cutt off pozitivní
 R < cut off negativní
Vyhodnocení korekční testy LA
Vyhodnocení
 Ratio R = t1:1 / tN
 > cutt of pozitivní
 Index Cag (Rösnerův index) ICA=(t1:1 - tN)/tP x100
 < cut off negativní
 > cut off pozitivní
Korekční test dAPTT
30
40
50
60
70
80
90
0% 50% 100%
sec
defekt ff
LA
spec.inh.
Vyhodnocení konfirmačních testů - LA
Zkrácení koagulačních časů v přítomnosti PL
Reagencie s PL (APTT, RVVT-Confirm)
 Vyhodnocení normalizované Ratio
 nR = R Screen / R Confirm > cutt off pozitivní
Po přídavku nadbytku PL – reagencie stejná
jako pro screening (dAPTT, dRVVT)
 vyhodnocení rozdílu časů
 CT1(screen) – CT2(screen +PL) > 8s pozitivní
Vyšetření faktoru XIII
Stanovení funkční aktivity
 sledování rozpustnosti koagula
 fotometricky
Stanovení antigenu
 LIA
 EID
 ELISA
Testy primární hemostázy
počet trombocytů (+ morfologie)
doba krvácení (Duke, Ivy)
PFA
agregace trombocytů
retrakce koagula
Agregace trombocytů
Turbidimetrická metoda
 sledování změn průchodnosti světla (T) při
tvorbě agregátů krevních destiček
Impedanční metoda
 sledování změn vodivosti vyvolaných tvorbou
agregátů krevních destiček
Turbidimetrická metoda
Impedanční metoda
Agregace trombocytů
Agregace samovolná (spontánní)
Agregace stimulovaná (indukovaná)
 induktory ADP, kolagen, adrenalin, ristocetin
primární agregace - vlivem vnějšího podnětu
sekundární agregace - vlastní příspěvek trombo
reversibilní agregace
ireversibilní agregace
Agregace trombocytů
Postup
příprava PRP, PPP diferenciální centrifugací
stanovení počtu trombocytů (event. ředění PRP)
 PRP 250 - 300 x109, PPP <20x109
vyšetření agregace
 vložení kyvety s PPP a PRP (rozdíl T = 100%)
 sledování agregační odpovědi v PRP
 samovolná 10 min
 po přídavku induktoru 6 min
vyhodnocení agregační křivky
Vyhodnocení agregační křivky
Maximální amplituda A max (%)
 v maximu (reversibilní křivka)
 v 6. minutě (ireversibilní křivka)
Desagregace (%)
 jen u ADP v případě reversibilní křivky
Doba latence (s)
 časová prodleva před agregační odpovědí
 jen u kolagenu
Strmost křivky = slope (%/min)
Agregační křivka
Agregace ADP 2,5
čas měření (min)
A max
100%
0 %
1 6
Transmise %
 T/min desagregace
0
Agregační křivka
Agregace ADP 5
čas měření (min)
A max
100%
0 %
1 6
Transmise %
 T/min
0
Agregační křivka
Agregace ADP 10
čas měření (min)
A max
100%
0 %
1 6
Transmise %
 T/min
0
Agregační křivka
Agregace kolagen
čas měření (min)
A max
100%
0 %
1 6
Transmise %
 T/min
latence
0
Agregační křivka
Samovolná agregace
čas měření (min)
A max
100%
0 %
1 10
Transmise %
pozitivní
negativní
0
Vyhodnocení - impedanční metoda
Klinický význam vyšetření agregace
Snížení agregační odpovědi
 hypofunkce trombocytů (vyloučit vliv léků)
Zvýšení agregační odpovědi
 u spontánní agregace - trombofilní riziko
 u indukované agregace lze hodnotit zvýšení
pouze při nízkých koncentrací induktorů (ADP,
adrenalin) při podezření na syndrom lepivých
destiček
Monitorování antiagregační léčby
Retrakce
Schopnost trombocytů smršťovat krevní nebo
plazmatické koagulum (metoda dle Bethause)
Postup
 získání PRP sedimentací
 ředění PRP + přídavek Ca2+, Ca2+-tromboplastin
 vytvoření plazmatického koagula v graduované
zkumavce a oddělení koagula od stěn zkum.
 odečtení délky koagula po 3 hod
 odečtení % retrakce z tabulky