Prietoková cytometria a stanovenie
lymfocytárnych subpopulácií
Peter Slanina (peter.slanina@fnusa.cz)
Ústav klinické imunologie a alergologie
FN u sv. Anny a Lékařská fakulta MU
Rozdelenie imunologických laboratórnych metód
serologické (humorálne)- detekcia antigénov a protilátok,
Metódy preukázanie tvorby protilátok proti infekčnému agens
bunečné- stanovenie počtu (relatívneho; absolútneho) a
funkčnosti jednotlivých typov leukocytov (nutný odber
nezrážlivej krvi do EDTA, heparínu, citrátu sodného)
Cluster Designation (Cluster of Differentiation)
• Bunky exprimujú (vystavujú) na svojom povrchu rôzne špecifické molekuly –
znaky, ktoré môžeme usporiadať do skupín charakterizujúcich bunečnú líniu, stav
diferenciácie jednotlivej bunky a jej aktiváciu
• CD klasifikácia: pokiaľ je molekula (znak, marker) na povrchu bunky známej štruktúry
a je rozpoznateľná monoklonálnou protilátkou je zaradená do skupiny diferenciálnych CD
znakov a označená číslom (CD1, CD2, CD3,...). V súčasnej dobe je na ľudských
leukocytoch charakterizovaných asi 400 znakov.
• Využitie:
- označenie plne definovaných molekúl na povrchu buniek
- rozdelenie podľa funkcie:
adhézne membránové molekuly, receptory pre cytokíny, molekuly na T a B
lymfocytoch, trombocytoch a ďalších bunečných populáciách
- Imunofenotypizácia buniek pomocou prietokovej cytometrie
Blausen.com staff (2014). "Medical gallery of Blausen Medical 2014". WikiJournal of
Medicine 1 (2). DOI:10.15347/wjm/2014.010. ISSN 2002-4436.
Leukocyty: počet leukocytov v krvi – 4-9x109/l
Granulocyty
T-lymfocyty (Th CD4+; Tc CD8+)
B-Lymfocyty
NK bunky
Imunofenotypizácia
buniek
• stanovenie leukocytárnych subpopulácií pomocou
prietokovej cytometrie (FACS- fluorescent-activated
cell sorting)
• odber krvi do skúmavky s EDTA
T lymfocyty
CD3 - povrchová molekula prítomná na všetkých T-lymfocytoch
Fyziologické zastúpenie v periférnej krvi: 58-85 % z Lymfocytov
http://www.cartage.org.lb/en/themes/sciences/lifescience/GeneralBiology/Immunology/Recognition/Tc
ell/Tcellcomplex/Tcellcomplex.htm
CD4+
TH (TH1, TH2)
pomocné T-lymfocyty
(T helper cells)
T- lymfocyty sa delia na:
CD8+
TC
cytotoxické T-lymfocyty
(cytotoxic T-cells)
Fyziologické zastúpenie z celkových CD3+ T-lymfocytov
30-60 % 15-35 %
Stavba T- bunečného receptoru TCR a umiestnenie
koreceptorových molekúl CD3, CD4, CD8 zapojených
do signalizácie cez T-bunečný receptor TCR
CD19
B lymfocyty
CD19, CD20 - povrchové molekuly najčastejšie využívané k rozlíšeniu B
lymfocytov v prietokovej cytometrii
Vhodne zvolená kombinácia iných CD znakov slúži k presnejšej
charakterizácii jednotlivých vývojových štádií a funkčných subpopulácií
(Warnatz K, Schlesier M 2008) Fyziologické zastúpenie v periférnej krvi: 7-23 % z Lymfocytov
Expresia CD znakov na povrchu B lymfocytov
počas ich vývoja.
Zastúpenie subpopulácií v kostnej dreni,
sekundárnych lymfatických orgánoch a periférnej
krvi
CD19 súčasťou B-bunečného receptoru BCR
NK (Natural Killer) bunky
CD16+CD56+CD3- - charakteristické povrchové markery
Fyziologické zastúpenie v periférnej krvi: 6-20 % z Lymfocytov
- rozpoznávajú bunky, ktoré majú na povrchu abnormálne málo MHC I (= nádorové a vírom infikované
bunky)
- Na zničenie bunky používajú cytotoxické mechanizmy
(perforin, granzymy)
Pozor!!! Okrem klasických NK ešte existujú
NKT bunky: CD16+CD56+ CD3+
Monocyty
CD14 - povrchová molekula charakteristická pre monocyty
Fyziologické zastúpenie v periférnej krvi: 0-10 % z Leukocytov
- súčasť nešpecifickej imunity
- schopnosť fagocytózy
- tkanivová forma = makrofág
- APC = antigén prezentujúca bunka
Na svojom povrchu exprimujú HLA DR – Human Leukocyte Antigen DR isotype
- naviazanie peptidov z pohltených patogénov →
→ rozoznanie pomocnými T-lymfocytmi
- cytometrický marker pre imunitnú odpoveď
CD14 ako koreceptor TLR4 zapojený do
detekcie bakteriálnych lipopolysacharidov
(LPS)
Príprava vzorky na FACS
Y
YYY
Y
Y
Y YY
YY
YY Y
Y
Y
Pretrepať
(vortexovať)
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
30min.
inkubácia
tma
lab. teplota
Y
Y
Y
Y
Y
Vzorka krvi 45µl
Pipetovať MIX potrebných MPL
Vzorka krvi 45µl + MPL
Voľné MPL - väzba na receptory Plná krv značená MPL
Erytrocyt
Lymfocyt
Debries?
Príprava vzorky na FACS
Lýza erytrocytov
• Erytrocyty prítomné vo vzorke zahlcujú meranie (obraz je
ťažko odčítateľný), preto po značení plnej krvi MPL je
nutné previesť lýzu erytrocytov
• K vzorke sa postupne pridáva:
➢ Roztok A: 600ul
➢ Príprava roztoku A: 1,5 l destilovanej vody + 1,8 ml 99% kyselina
mravenčia – spôsobuje lýzu erytrocytov v kyslom prostredí
➢ Roztok B: 300ul
➢ Príprava roztoku B: 1,5 l destilovanej vody + 9,0 g bezvodého
Na2CO3, 21,75 g NaCl, 46,95 g bezvodého Na2SO4 – alkalický roztok =
zastavenie lýzy a úprava pH
➢ Roztok C: 100ul
➢ Príprava roztoku C.: 1,5 l PBS (pH 7-7,4) + 15 g paraformaldehydu –
fixácia buniek
Vzorky sa do začiatku merania uchovávajú v tme pri 4°C
Automatický lyzátor TQ-prep od Firmy Beckman
Coulter používaný na lýzu erytrocytov v rutinných
vzorkách
Monoklonálne protilátky (MPL)
• produkt jediného klonu B lymfocytov (klony vzniknuté fúziou
buniek produkujúcich Ab a myelomových buniek, ktoré schopnosť
produkcie vlastného Ig ztratili) nastimulovaných príslušným
antigénom
• totožné a prísne špecifické proti jednému epitopu na povrchu
použitého antigénu
Proces výroby MPL
Prietoková cytometria (Flow Cytometry, FACS)
Flow+cyto+metria = „meranie buniek v pohybe“
• Možnosť analýzy mnohých vlastností a charakteristík na úrovni jednej bunky
počas krátkeho časového úseku
• Dnešné stroje umožňujú meranie súčasne viac než 25 markerov na jednej bunke
➢Určovanie fenotypu buniek
➢Monitorovanie odpovede na liečbu
➢Výskum signalizačných dráh
• Kľúčový nástroj pre výskum porúch krvotvorby
Prietoková cytometria je technológia umožňujúca súčasné meranie a
analýzu niekoľkých fyzikálnych a chemických vlastností jednotlivých
častíc, ktoré sú unášané v prúde kvapaliny a prechádzajú lúčom svetla
Oblasti uplatnenia FACS
• Klinické využitie – imunofenotypizácia buniek a meranie ich
funkčných vlastností
• Bunečná biológia – DNA, RNA analýza
• Mikrobiológia – rezistencia na ATB, kinetika
Čo meriame???
• Lomené a odrazené svetlo - pri prechode buniek laserovým lúčom (paprskem)
dochádza k jeho lomu a odrazu na bunečnom povrchu a bunkových organelách
• Emitovanú fluorescenciu – pokiaľ použijeme MPL konjugované s fluorochromom
• Častice veľkosti 0,2-150 µm
- prokaryotické a eukaryotické bunky
- vírové častice, baktérie, huby
- komplexy Ag-Ab
Laser
MPL konjugovaná
s Fluorochromom
Bunka
Emitovaná fluorescencia
Lomené a odrazené svetlo
Princíp FACS
• Pri prechode častíc laserovým lúčom dochádza k rozptylu svetla a k fluorescencii
naviazaných fluorochrómov
• Svetelné signály sú prevedené na elektrické pomocou detektorov (PMT)
• Na každej bunke je možné zmerať niekoľko parametrov zároveň (rozptýlené svetlo
+ fluorescencia)
• Namerané dáta sa ukladajú a ďalej analyzujú
Cytometer tvoria
3 hlavné systémy
Fluidný systém
transport častíc k laserovému lúču
Elektronický systém
prevod detekovaných svetelných
signálov na signály elektronické,
vyhodnocované počítačom
Optický systém
laser, zrkadlá,
optické filtre
Fluidika
Zabezpečuje transport častíc (buniek) v prúde nosnej kvapaliny k laserovému lúču a
ich odvod do odpadu
Practical flow cytometry in haematology diagnosis, 2013
Prietoková komora (prietoková cela)miesto,
kde sú bunky v ideálnom prípade
unášané jednotlivo za sebou a ožiarené
laserovým lúčom
Rez prietokovou celou: uprostred vzorka (bunečná
suspenzia) unášaná nosnou kvapalinou (sheath fluid)
Hydrodynamická fokusácia
Vzorka Vzorka
Nízky tlak vzorky
Úzky prúd vzorky
Menší prietok buniek
Presnejšie meranie
vhodné napr. pre DNA analýzu a
meranie funkčných vlastností
Vysoký tlak vzorky
Široký prúd vzorky
Zbieranie velkého počtu častíc
vhodné napr. na Imunofenotypizáciu
buniek
Practical flow cytometry in haematology diagnosis, 2013
- jav, ktorý zabezpečuje usporiadanie buniek jednotlivo za sebou
- vzorka, napr. bunečná suspenzia je vyvedená doprostred Tzv. Sheath fluid (nosná kvapalina)
- nosná kvapalina postupne strháva jednotlivé bunky a usporadúva ich do radu za sebou
- tlak nosnej kvapaliny je nastavený výrobcom, meniť môžeme tlak vzorky (nastavenie rýchlosti prietoku buniek)
Optika
• Excitačná optika
laser a systém šošoviek
(čoček), ktoré zaostrujú a
smerujú laserový lúč – pred
ožiarením častíc
• Zberná optika
sústava šošoviek, ktorá vedie a
rozdeľuje svetlo do rôznych
vlnových dĺžok na príslušné
detektory – odrazené a
fluorescenčné žiarenie po
ožiarení častíc
Excitačná optika
Zberná optika
Band pass filtre
Dichroické zrkadlá
Long pass filtre (LP)
excitácia Ar-iontovým laserom (modrý) - 488 nm
FITC - fluorescein isothiokyanát (530 nm)
PE, RD1 - phycoerythrin (580 nm)
ECD - tandem. konjugát PE-texaská červeň (620 nm)
PerCP - perridin chlorophyl (678 nm)
PerCPCy5.5 - (696 nm)
PC5 - tandem PE-cyanine 5 (620 nm)
PC7 - tandem PE-cyanine 7 (778 nm)
excitácia He-Ne laserom/red diode (červený) - 633 nm
APC - allophycocyanin (670 nm)
APC-Cy7 - tandem APC-cyanine 7 (778 nm)
excitácia UV/violet diode (fialový laser) - 405 nm
Pacific Blue (452nm)
BV421 (421 nm)
BV510 (510nm)
Lasery – zdroj žiarenia
- Každý cytometer obsahuje ako zdroj žiarenia laser
- Dnes: najčastejšie využívané 3 až 4 lasery súčasne
v jednom stroji
- Každý laser má charakteristickú vlnovú dĺžku
žiarenia → excitácia rôznych fluorochromov
Fluorochromyexcitovateľné
jednotlivýmilasermi
Emisný peak
Emisný peak: Pri ožiarení fluorochromu lúčom lasera je
emitované žiarenie určitej vlnovej dĺžky. Podľa najvyššej
intenzity vlnovej dĺžky emitovaného žiarenia sa volí
vhodný detektor pre daný fluorochrom.
Zber optického signálu v prietokovej cytometrii
• Fluorochrom – po ožiarení lúčom lasera dochádza k emisii svetla v rozsahu
určitých vlnových dĺžok – napríklad FITC po ožiarení argonovým laserom s vlnovou
dĺžkou 488 nm emituje svetlo v rozsahu 480 – 674 nm, pričom emisné maximum
= emisný pík má v 521 nm.
• Detektor pre meranie fluorescencie emitovanej FITC by mal mať rozsah
detegovaných vlnových dĺžok medzi 500 – 560 nm – v závislosti na výrobcovi
cytometra.
Excitačné
spektrum
FITC
Emisné
spektrum
FITC
Detektor pre FITC
• Vo viacfarebnej prietokovej cytometrii dochádza k emisii niekoľkých
fluorochromov naraz – tj. je emitované žiarenie rôznych vlnových dĺžok a je nutné
takto vzniknuté žiarenie rozdeliť tak, aby bolo jasné, čo vyžarujú jednotlivé
fluorochromy.
• Pri výbere fluorochromov sa v prietokovej cytometrii postupuje tak, aby sa
emisné spektra vo svojich píkoch neprekrývali.
• K rozdeleniu emitovaného žiarenia slúžia filtre uvedené na ďalšej snímke:
Zber optického signálu v prietokovej cytometrii
Optické filtre
Long Pass (LP)
Prepúšťa všetky dĺžky vyššie
ako špec. vlnová dĺžka
500LP
Practical flow cytometry in haematology diagnosis, 2013
- súčasť zbernej optiky
- odfiltrovanie vhodnej vlnovej dĺžky emitovaného svetla pred
dopadom na detektor
Slúži k rozdeleniu emitovaného svetla napríklad tak, že prepúšťa
žiarenie vyššie ako 500 nm – tým dôjde k oddeleniu napr.
odrazeného svetla lasera, ktorý má vlnovú dĺžku 488 nm.
Takto upravené prepustené žiarenie je rozdelené ďalšími filtrami.
Pre usmernenie žiarenia na detektory pre jednotlivé fluorochromy potrebujeme rozdeliť emitované
žiarenie tak, aby na určitý detektor dopadalo žiarenie v danom rozsahu vlnových dĺžok. K tomu
potrebujeme short pass filtre a band pass filtre.
Short pass filter prepúšťa žiarenie kratšej vlnovej dĺžky a žiarenie s vyššou vlnovou dĺžkou odrazí.
Prepustené žiarenie putuje smerom k detektoru, kde je jeho rozsah upravený pomocou band pass filtrov
– je teda prepustené žiarenie vlnovej dĺžky typickej pre emisný pík jedného fluorochromu.
Optické filtre
Short Pass (SP)
Prepúšťa všetky dĺžky
kratšie ako špec. vlnová
dĺžka
Band Pass (BP)
Prepúšťa špecifické
rozmedzie vlnových dĺžok
500SP 500/50
500±25
Practical flow cytometry in haematology diagnosis, 2013
Odrazené žiarenie putuje k ďalším
short pass filtrom, ktoré následne
prepustia žiarenie vyššej vlnovej
dĺžky ako v predchádzajúcich short
pass filtroch.
Optické filtre
Dichroické filtre (zrkadlá)
- usmerňujú odrazené a emitované žiarenie do detekčnej dráhy smerujúcej k detektorom
- rozdeľujú odrazené a fluorescenčné žiarenie tak, aby dopadalo na vhodný detektor
- najčastejšie umiestnené pod uhlom 45°, v tom prípade časť svetla odrážajú pod uhlom 90°, časť prepúšťajú
- sú používané ako long pass a short pass filtre
Elektronika
• Svetelné signály sú prevádzané na elektrické
• Typy detektorov:
- lavinové fotodiódy: detekcia FSC
- fotonásobiče PMT (PhotoMultiplierTube): detekcia SSC a fluorescencie
PMT
- veľmi citlivé, sú schopné zachytiť i slabé signály
- zvyšujú signál primárneho dopadajúceho žiarenia
Princíp PMT
Žiarenie vo forme fotónov dopadá na fotokatódu. Z nej sú na
základe fotoelektrického javu vyrazené eletróny, ktoré sú ďalej
usmernené na tzv. dynódy (katódy z pozitívnym napätím). Na
jednotlivé dynódy je privádzané stále vyššie napätie, čo
umožňuje urýchlenie elektrónov a zvýšenie ich energie.
Urýchlené elektróny majú dostatok energie na vyrazenie ďalších
elektrónov z povrchu dynód. Počet elektrónov exponenciálne
rastie. Vzniknuté elektróny dopadajú na koniec na anódu, na
ktorej dochádza k vzniku napäťového pulzu. PMT umožňuje
premeniť slabý počiatočný signál na silný napäťový pulz.
Vznik napäťového pulzu / Intenzita fluorescencie
- prechod bunky laserovým lúčom generuje vznik napäťového pulzu na
detektore
- veľkosť napäťového pulzu je daná intenzitou žiarenia (intenzitou fluorescencie),
ktoré dopadlo na PMT
- intenzita fluorescencie závisí na:
• expresii jednotlivých povrchových znakov
• počte naviazaných fluorochromov
• na sile fluorochromu (fluorochromy nevykazujú rovnakú intenzitu
fluorescencie)
- napäťovým pulzom sú pomocou
prevodníkov pridelené digitálne hodnoty
rozdelené do 0-1024 kanálov na základe
veľkosti pulzu
- každý z týchto kanálov odpovedá určitej
intenzite fluorescencie
Veľkosť vs. granularita
• Veľkosť a členitosť bunky určujeme na základe rozptylu žiarenia (light scatter): prechádzajúca častica vychýli
dopadajúce žiarenie
Forward Scatter (FSC) – rozptyl žiarenia v priamom smere → závisí na veľkosti buniek = určuje veľkosť
Side Scatter (SSC) – rozptyl žiarenia do strán → závisí na členitosti buniek = určuje granularitu
• Stačí jeden laser
• Nie je to fluorescenčné žiarenie (nepotrebujeme MPL s fluorochrómami)
FSC vs. SSC
Lymfocyty
Granulocyty
Monocyty
RBC, debris,
mrtvé buňky
veľkosť
FSC
SSC
granularita
Kombináciou FSC a SSC získavame rozlíšenie
základných subpopulácií Leukocytov
Veľkosť: lymfocyty < monocyty < granulocyty
Granularita: lymfocyty < monocyty ≤ granulocyty
Diferenciálny rozpočet
Stanovenie relatívneho počtu leukocytárnych a lymfocytárnych
subpopulácií pomocou prietokovej cytometrie
SSC
SSC
CD45 FITC CD45 FITC
CD45- panleukocytárny znak, prítomný na všetkých leukocytoch
x+y+z = 100 % = Leukocyty
x % Lymfocyty + y % Monocyty + z % Granulocyty
x1 % T-lym. + x2 % B-lym + x3 % NK bunky
x1+x2+x3 = 100 % = Lymfocyty
x11 % CD4 Th + x12 % CD8 Tc
x11 + x12 = 100 % = T-lymfocyty
Fluorescencia
Veľa buniek má rovnakú alebo podobnú morfológiu- na základe expresie povrchových znakov ich vieme
roztriediť do skupín
- využívajú sa k tomu monoklonálne Ab značené fluorochromom špecifické k určitému epitopu
- fluorochrom je molekula schopná absorbovať žiarenie špecifickej vlnovej dĺžky (excitácia) a následne
vyžiariť kvantum energie (emisia) vo forme fluorescenčného žiarenia
- čiastočná strana energie (premena na teplo) = Stokesov posun Fluorochrom
- charakteristické excitačné a emisné
spektrum
- Stokesov posun je daný štruktúrou
molekuly
Fluorochromy
• Sú excitované vhodnou vlnovou dĺžkou (nutné zvoliť správny laser)
• Emitujú svetlo špecifickej vlnovej dĺžky (nutné zvoliť detektor v správnom pásme
vlnových dĺžok)
• I neznačené bunky môžu byť fluorescenčné vďaka slabej autofluorescencii
Fluorochromy
• Polycyklické organické molekuly a ich deriváty
- Fluorescein isothiokyanát (FITC), Cyaniny, Texas Red, rada Alexa, Pacific a
Cascade
- AmCyan, Propidium Iodide, 7-AAD, CFSE
• Fluorescenčné proteíny
- Phycoerythríny (PE), Allophycocyaniny, PerCP, GFP,...
• Quantum Dots
Schopné absorbovať fotóny budiaceho žiarenia (napr. 488 nm) a následne (10-8 s)
emitovať fotóny s dlhšou vlnovou dĺžkou (nap. 500 – 800 nm). Fluorescenčné
žiarenie má teda inú „farbu“.
Emisné
spektrá
Ukážka prekrytia emisných spektier niektorých fluorochromov
Prekrytie spektier
• Fluorochromy typicky emitujú svetlo v širokom spektre vlnových dĺžok
• V závislosti na usporiadaní filtrov, detektory môžu zachytiť fluorescenciu od iných fluorochromov,
ktoré sú detekované v iných kanáloch (priesvit, prekrytie)
Prekrytie spektier- potrebné odčítať signál FITC v
kanále (detektor) pre PE = „kompenzácia“ –
matematicky sa odčíta percento nárastu signálu
spôsobeného druhým fluorochromom
Vlnová dĺžka
Intenzitafluorescencie
Pásmo vlnových dĺžok, ktoré zachytia detektory
pre FITC a PE
Treshold (prah)
• Detektory sú extrémne citlivé = detekujú signály z rôznych zdrojov – prach, malé častice, debris
• Na elimináciu slúži nastavenie tzv. Tresholdu
• Nastavenie na jednom parametry (najčastejšie FSC) = v tomto prípade eliminujeme signál malých
častíc na základe rozptylu svetla
napr. zadefinujeme Treshold odpovedajúci intenzite žiarenia u častíc veľkosti 5 µm = zaznamenané
udalosti (eventy) menšie ako nastavený Treshold cytometer nebude zaznamenávať
Treshold 5µmTreshold 2,5µmTreshold <2,5µm
Názov gatu, z ktorého sa zobrazujú bunky
Gatovacia stratégia: postupný výber buniek záujmu.
Namerané vzorky obsahujú okrem rôznych typov buniek, taktiež zlepené bunky, mŕtve bunky alebo
prachové častice. Gatovacia stratégia slúži v odfiltrovaniu nechcených častíc z analýzy a k výberu cieľovej
populácie buniek, na základe rôznej kombinácie požitých znakov. V grafe sa následne ohraničia len bunky,
ktoré nás zaujímajú (vytvorí sa tzv. gate). Ďalší graf už zobrazuje len bunky výberu (ohraničené) z
predchádzajúceho grafu.
Analýza nameraných dát – Gating Strategy
Oddelenie doubletov- zlepených buniek Mŕtve bunky a prachové častice
Pokračovanie na
nasledujúcom slide
(už len gate
Lymfocyty)
K zobrazeniu dát sa používajú viaceré typy grafov: Histogram, Dot Plot
Z gatovaných buniek vytvárame štatistiku:
- údaje o počte buniek
- relatívnom zastúpení (percento buniek; %) bunkových subpopulácií
- porovnanie mediánu intenzity fluorescencie MFI = miery expresie sledovaných znakov
Analýza nameraných dát – Štatistika
Dot Plot
Histogram
CD3+
CD3-
Počet
buniek
Intenzita fluorescencie
MFI CD3MFI
CD3+
HISTOGRAM
Percento CD3+ buniek
DOT PLOT
Intenzita fluorescencie
Intenzita
fluorescencie
- každá bodka (tečka) zobrazuje 1 bunku a
vyjadruje expresiu daného znaku na bunke
- príklad grafu: Dot Plot rozdelený do 4
kvadrantov, na základe expresie
sledovaných znakov:
1. CD19+ CD3- = B-lymfocyty
(11,40% z Lymfocytov)
2. CD19+ CD3+
3. CD19- CD3+ = T-lymfocyty
(83,91% z Lymfocytov)
4. CD19- CD3-
v jednotlivých kvadrantoch sa nachádzajú
bunky s podobnou expresiou znakov
1. 2.
3.4.
B-lymfocyty
T-lymfocyty
CD3- CD3+
CD19+
CD19-
MPL
Fluorochrom
Percento buniek v jednotlivom kvadrante
Výhody a nevýhody prietokovej cytometrie
Výhody
• Veľké množstvo analyzovaného
materiálu – veľké množstvo dát
• Analýza trvá niekoľko minút
• Kvalitatívna + kvantitatívna analýza
• Možné manipulačné operácie- napr.
triedenie buniek s vybranými
vlastnosťami (cell sorting)
Nevýhody
• Vysoká finančná náročnosť
• Zostavenie experimentu, analýza a
vyhodnotenie dát závislé na
skúsenostiach obsluhy
• Analýza vzoriek čo najskôr po odbere
• Nevidíme lokalizáciu signálu na bunke
Krvný diferenciál
Základné vyšetrenie v imunologickom laboratóriu: stanovenie lymfocytárnych subpopulácií
Pripravujú sa dve skúmavky:
Sledujeme počet: Lymfocytov (GADJ); Monocytov (Mono); Eosinofilov (Eo); množstvo Debris (spád = mŕtve bunky)
Krvný diferenciál
Základné vyšetrenie v imunologickom laboratóriu: stanovenie zastúpenia lymfocytárnych subpopulácií v
plnej krvi
Prietokovou cytometriou sa stanovuje počet buniek v jednotlivých subpopuláciách leukocytov a porovnáva
sa s tabuľkovými hodnotami.
Pripravujú sa dve skúmavky s nasledujúcou kombináciou monoklonálnych protilátok MPL:
Skúmavka A: 45µl krvi + x µl MPL CD45 FITC
CD3 PC5
CD4 RD-1
CD8 ECD
Skúmavka B: 45µl krvi + x µl MPL CD45 FITC
CD3 PC5
CD19 ECD
CD16/56 RD-1
MPL + Fluorochrom
Rovnaké fluorochromy ale
konjugované s inou MPL =
musia byť rozdelené do
dvoch skúmaviek
Vzorky krvi s MPL sa inkubujú 25 min, nasleduje lýza erytrocytov a meranie na prietokovom cytometry
Krvný diferenciál – gatovacia stratégia + výsledky
Z oboch skúmaviek získame relatívny počet (%): Lymfocytov + Monocytov + Granulocytov
Do výsledku sa zapisuje priemerná hodnota z oboch skúmaviek
Krvný diferenciál –
gatovacia stratégia
Skúmavka A:
CD3+ CD3+
CD3+
CD8+ CD4+
Skúmavka B:
Krvný diferenciál –
gatovacia stratégia
CD19+ CD16/56+
Krvný diferenciál – výsledky
Cytometrické meranie:
Zo skúmavky A získame relatívny počet:
CD3+ T-lymfocytov
CD3+CD4+ pomocných Th-lymfocytov
CD3+CD8+ cytotoxických Tc-lymfocytov
Zo skúmavky B získame relatívny počet:
CD3+ T-lymfocytov
CD19+ B-lymfocytov
CD16/56+ NK buniek
eosinofilov
Zo skúmavky A+B získame relatívny počet:
Monocytov
Lymfocytov
Granulocytov
Relatívny počet: percentuálne zastúpenie danej
populácie buniek
Absolútny počet: počet buniek na 1l krvi
- Pomocou počítača leukocytov stanovíme počet
leukocytov na 1l krvi
- Z relatívneho počtu danej subpopulácie a
absolútneho počtu leukocytov dorátame absolútny
počet danej subpopulácie buniek
Vo výsledkovom liste sa udáva relatívny a taktiež
absolútny počet buniek jednotlivých subpopulácií a
porovnáva sa s fyziologickými/tabuľkovými hodnotami
Stanovenie absolútneho počtu lymfocytárnych
subpopulácií
Počet Leukocytov 3,6-10 x109l
Lymfocyty 20-55 %
Monocyty 0-10 %
Granulocyty – neutrofily, eosinofily, bazofily 37-75 %
Príklad: relatívny počet abs. počet
Leukocyty 5 x109l Lymfocyty: 20% 1,0 x109l
CD3: 75% 0,75 x109l
CD19: 10% 0,1 x109l
CD15,56: 15% 0,15 x109l
Hodnotenie výsledkov
• Bola dostatočná lýza erytrocytov? (Ak nie, erytrocyty prekryjú všetky leukocyty a nie je
možné odčítať jednotlivé subpopulácie leukocytov, výsledky sú skreslené)
• Sú prítomné všetky MPL → Ak nie → boli pridané? ; je to pacientom? ; liečbou?
• Sú dáta správne skompenzované?
• Bola dodržaná gatovacia stratégia?
• Výsledné hodnoty: fyziologický rozsah hodnôt zastúpenia leukocytárnych subpopulácií závisí
na veku, k hodnoteniu sú dostupné tabuľky uvádzajúce fyziologické hodnoty pre rôzne
vekové skupiny)
v norme – výsledky sa môžu uvoľniť
zvýšené/znížené oproti norme? → je nutné opakovať
meranie, prípadne dovyšetriť s použitím iných MPL, u
patologických hodnôt je nutné opakovať odber v iný deň
Vyšetrenie lymfocytov periférnej krvi
ZNAK EXPRESE FUNKCE ZASTOUPENÍ NA
LYMFOCYTECH PERIFERNÍ
KRVE (%)
CD3 všechny T-lymfocyty asociován s TCR, přenos
signálu
58-85
CD4 pomocné T-lymfocyty receptor pro MHC II,
aktivace
30-60
CD8 cytotoxické T-lymfocyty receptor pro MHC I,
aktivace
15-35
CD19 B-lymfocyty regulátor aktivace 7-23
CD16/CD56 NK-buňky FcR pro IgG/mediátor
adheze
6-20
HLA-DR B-lymfocyty, monocyty,
aktivované T-lymfocyty
MHC II, prezentace Ag B-lymfocyty konstitutivně (na
všech B-lymfocytech),
T-lymfocyty 3-7
(na aktivovaných T-lymfocytech)
Hodnotenie nálezu jednotlivých subpopulácií
Snížení/
zvýšení
subpopulace onemocnění

CD19+, CD3+,
CD4+, CD8+
při imunosupresi – např. cyklosporin (způsobuje lymfopenii)
 CD19+ u některých pacientů s CVID
 CD19+ B – buněčná leukémie
 CD3+ při expozici člověka toxickými chemikáliemi
 CD3+ T – buněčná leukémie
 CD4+
u některých pacientů s CVID (běžný variabilní imunodeficit – common variable
immunodeficiency)
- virové infekce (EBV, CMV, HIV)
 CD4+ autoimunity, alergie
 CD8+ autoimunity (roztroušená skleróza, systémový lupus erythematodes-SLE)
 CD8+
u některých pacientů s CVID
- virové infekce (EBV, CMV, HIV)
Skúmavka A
Obsahuje: vzorka krvi + MPL (aCD45; aCD3; aCD4; aCD8)
Získame relatívny počet:
T-lymfocytov CD3+
Pomocných Th-lymfocytov
CD3+ CD4+
Cytotoxických Tc-lymfocytov
CD3+ CD8+
Skúmavka B
Obsahuje: vzorka krvi + MPL (aCD45; aCD3; aCD19; aCD56)
Získame relatívny počet:
B-lymfocytov CD19+ NK buniek CD56+CD3-
Eosinofilov
Príklady využitia FACS v praxi
Základom imunologického vyšetrenia je krvný diferenciál, určenie základných leukocytárnych subpopulácií. V prípade
patologických hodnôt je nutné merania doplniť s využitím iných MPL a bližšie charakterizovať možný patologický stav.
Zdravá osoba
CD3+CD3+
CD3+
CD8+CD4+ CD19+ CD16/56+
Fyziologické hodnoty:
T LYMFOCYTY
•CD3+ : 82 (58-85)%
•CD3+ 4+: 57 (30-60)%
•CD3+ 8+: 19 (15-35)%
B LYMFOCYTY
• CD19+ : 11 (7-23) %
NK LYMFOCYTY
•CD16,56+: 6 (6-20)%
6,37%
Vplyv infekcie
Bakteriální infekce
• Počet leukocytů:  Th: CD3+ 4+: 
• Lymfocyty:  Monocyty: CD14+HLA DR+ : 
• Granulocyty: 
Virová infekce
• Počet leukocytů:  Tc: CD3+ 8+: 
• Lymfocyty:  CD3+8+HLA DR+ : 
• Granulocyty:  CD3+8+38+ : 
Pacientka: Ž, *1957
- v krvnom diferenciáli chýbajú B-lymfocyty (0,0 % z
celkových lymfocytov)
- v nemocničnom systéme zistená liečba rituximabom
– pacientka reumatológie
- výsledok: deplécia B lymfocytov vplyvom liečby (po
4-6 mesiacoch návrat k normálnym hladinám)
- odber a meranie nutné opakovať po niekoľkých
mesiacoch
Krvný diferenciál: X-viazaná agamaglobulinémia
T LYMFOCYTY
•CD3+ : 59 (58-85)%
•CD3+ 4+: 41 (30-60)%
•CD3+ 8+: 15 (15-35)%
B LYMFOCYTY
• CD19+ : 0 (7-23) %
NK LYMFOCYTY
•CD16,56+: 34 (6-20)%
41%
15%
0%
34%
59% 59%
X-viazaná agamaglobulinémia
• mutácia v géne kódujúcom Brutonovu tyrosinkinázu – dôležitá pre diferenciáciu B lymfocytov
• ženy prenášačky, manifestácia u mužov
• dochádza k zastaveniu vývoja B lymfocytov
• neprítomnosť B lymfocytov v krvnom obehu
- v krvnom diferenciáli chýbajú B-lymfocyty (0,0 % z celkových lymfocytov)
- zastúpenie ostatných lymfocytárnych subpopulácií v norme
- výsledok:
Pacient: M, *1966
- v krvnom diferenciáli vysoké B-lymfocyty (95,50 % z
celkových lymfocytov)
- Prvo-záchyt: bez histórie v nemocničnom systéme
- výsledok: podozrenie na leukémiu
- nutné doplniť vyšetrenie CD5+CD19+ buniek Pokračovanie nasledujúci slide
Doplnenie vyšetrenia na zistenie prítomnosti
CD5+CD19+ buniek
CD5+CD19+ : 94.8%
- CD5+CD19+ bunky = marker chronickej lymfoproliferatívnej choroby
- u zdravej osoby sa znak CD5 vyskytuje na T-lymfocytoch, normálne hodnoty CD5+ na B-lymfocytoch u zdravého
dospelého človeka: do 10% zo všetkých B-lymfocytov
Pacient: M, *1966
Výsledok: vysoký počet CD5+CD19+ = odporúčanie na
hematoonkologické vyšetrenie
Vzorka: periférna krv odobraná do EDTA
Značenie MPL:
CD45 KO- panleukocytárny znak
CD19 PC7- B-lymfocyty
CD5 FITC
Pacient: M, *1999
- v krvnom diferenciáli zistený obrátený pomer
CD3+CD4+ k CD3+CD8+ (13,2 : 50,9)
- Fyziologické hodnoty: pomer CD3+CD4+ > CD3+CD8+
- Prvo-záchyt: bez histórie v nemocničnom systéme
- výsledok: podozrenie na vírovú infekciu
- nutné doplniť vyšetrenie CD8+CD38+ buniek
Pokračovanie nasledujúci slide
Pacient: M, *1999
Fyziologický obraz
Nastavenie polohy gatov je fixnénastavené
podľa zdravých kontrol
CD8+CD38+ 83,2%
CD8++CD38++ 92,2%
Doplnenie vyšetrenia na
zistenie zvýšenej expresie
znaku CD38 na CD3+CD8+
T-lymfocytoch
- CD8+CD38+ bunky = marker vírových infekcií
- u zdravej osoby je zastúpenie CD8+CD38+ T- buniek nízke, u vírových infekcií sa zvyšuje, patologické hodnoty = ???
- hodnoty vyššie ako 50% CD8+CD38+ T-buniek z celkových CD3+CD8+ T-buniek nutné výsledok hlásiť doktorovi
Výsledok: vysoký počet CD8+CD38+ T-lymfocytov =
možná napr. EBV infekcia; odporúčanie na
mikrobiologické vyšetrenie
Vzorka: periférna krv odobraná do EDTA
Značenie MPL:
CD45 KO- panleukocytárny znak
CD3 PC7- T-lymfocyty
CD8 APC H700 – cytotoxické T-lymfocyty
CD38 APC H750 – aktivačný znak T-lymfocytov
CD8+CD38+ 83,2%
CD8++CD38++ 92,2%
EBV infekcia – nutno dovyšetřit v
mikrobiologické laboratoři
SCID - Severe Combined Immunodeficiency
Ťažké kombinované imunodeficiencie
• Primární imunodeficience (vrozená), postižena je buněčná složka imunity
• Jedná o nejzávažnější vrozenou imunodeficienci (záhy po narození těžké infekce)
• Bez léčby (transplantace kostní dřeně) úmrtí v prvním roce života (vyvíjí se také genová terapie)
• Klinické projevy:
• Infekce způsobené atypickými patogeny (pneumocysty, kandidózy, atypické mykobakteriózy, cytomegalová pneumotitida)
• Chronické průjmy (bez průkazu etiologického agens), neprospívání, kožní infekce, komplikace po vakcinaci BCG
• Molekulární podstata je heterogenní, rozlišuje se několik skupin SCID:
1. Porucha ADA (adenosindeaminázy): Dysfunkce nebo absence tohoto enzymu způsobuje akumulaci produktů metabolismu purinů, které
jsou pro časné thymocyty toxické → rozvíjí se těžká T lymfopenie
2. SCID T-B-: Absence T i B lymfocytů, NK buňky zachovány. Molekulární podstata heterogenní (některé případy deficit rekombinázy RAG-2,
porucha exprese receptoru pro IL-7)
3. SCID T-B+: Chybí T lymfocyty a NK buňky, B lymfocyty zachovány. Nejčastější forma SCID (60% všech případů). 70% případů vázáno na
chromosom X – mutace genu pro gama řetězec receptoru pro IL-2. Tento gama řetězec je ale společný i receptorům pro IL-4, IL-7, IL-9
a IL-15 → funkční porucha mnoha cytokinů.
4. Retikulární dysgeneze: Postižení kmenové buňky, blokován vývoj myeloidní i lymfoidní linie.
SCID
Severe Combined Immunodeficiency – Ťažké kombinované imunodeficiencie
Príklad pacienta s SCID
- záchyt u novorodencov a detí
- nízky absolútny počet Leukocytov a Lymfocytov, v podstate chýbajú CD3+ T-lymfocyty, počet B-lymfocytov a
NK buniek môže byť taktiež znížený
Leukocyty: 5,0x10*9/l
Lymfocyty: 4,0x10*9/l
8% 2%
T LYMFOCYTY
•CD3+ : 14 (58-85)%
•CD3+ 4+: 8 (30-60)%
•CD3+ 8+: 2 (15-35)%
Nízký počet leukocytů i lymfocytů vzhledem k věku pacienta
Velice nízký počet T-lymfocytů!!
SCID
Severe Combined Immunodeficiency – Ťažké kombinované imunodeficiencie
71% 13%
B LYMFOCYTY
• CD19+ : 71 (7-23) %
NK LYMFOCYTY
•CD16,56+: 13 (6-20)%
Výsledok: možné doplniť funkčný test proliferácie T-lymfocytov; dieťa je smerované k transplantácii kostnej dreni
SCID
Leu : 5,0x109/l
Ly: : 4,0x109/l
T LYMFOCYTY
•CD3+ : 14 (58-85)%
•CD3+ 4+: 8 (30-60)%
•CD3+ 8+: 2 (15-35)%
B LYMFOCYTY
• CD19+ : 71 (7-23) %
NK LYMFOCYTY
•CD16,56+: 13 (6-20)%
8% 2%
71% 13%
14%
14%
Výsledok: T-B+NK+ SCID
Poznámka: všetky jaderné T-lymfocyty boli materské, aktivované, vyvolávajúce reakciu štěpu
proti hostiteľovi.
Krvný diferenciál: DiGeorgův syndrom
T LYMFOCYTY
•CD3+ : 40 (58-85)%
•CD3+ 4+: 22 (30-60)%
•CD3+ 8+: 4 (15-35)%
B LYMFOCYTY
• CD19+ : 22 (7-23) %
NK LYMFOCYTY
•CD16,56+ : 36 (6-20)%
22%
4%
22% 36%
40% 40%
DiGeorgův syndrom
• Embryonálna porucha – narušenie vývoja v oblasti 3. a 4. embryonálního oblúka
• Abnormality v arteriálnom obehu, srdci, jícne a čeľustiach
• Porucha vo vývoji thymu – znížené zastúpenie T lymfocytov
- v krvnom diferenciáli výrazne znížené T-lymfocyty (pomocné CD4+ aj cytotoxické CD8+)
- zastúpenie ostatných lymfocytárnych subpopulácií v norme
- výsledok:
HLA-B27
negatívny pozitívny
Znak HLA-B27 je asociovaný s radou nešpecificky zápalových ochorení, akými sú zápaly kĺbov, vnútorných štruktúr oka
(uveitida), krátkych kostí rúk, nôh a šliach, ďalej psoriázou, chronickými bolesťami spodnej časti chrbta (zad) a
spondyloarthropatiou, z ktorej najznámejšou je ankylózujúca spondylitida (zápalové systémové ochorenie osového
skeletu a kĺbov – Bechtěrevova choroba)
Vzorka: periférna krv odobraná do EDTA
Značenie MPL:
CD3 PE- T-lymfocyty
HLA-B27 FITC
Výsledok: cytometrické vyšetrenie HLA-B27 je len
screeningová metóda, pozitívny výsledok sa vydáva s
odporúčaním na genetické vyšetrenie
Vyšetrenie HLA-B27 nie je doplňujúcim meraním ku
krvnému diferenciálu, je to samostatné meranie
Bronchoalveolárna laváž - BAL
• diagnostické bronchoskopické vyšetrenie
• pacientovi sa do bronchu (vetvy bronchu) pomocou fibrobronchoskopu aplikuje a následne späť aspiruje 150-
200 ml fyziologického roztoku
• sleduje sa zastúpenie množstva a percentuálneho podielu jednotlivých typov leukocytov
• indikuje sa u zápalových pľúcnych ochorení, nádorových ochorení, intersticiálnych pľúcnych procesoch,
pneumokoniózach
Vyšetrenie HLA-B27 nie je doplňujúcim meraním ku krvnému diferenciálu, je to samostatné meranie
- vzorka: bronchoalveolárna tekutina
- Spracovanie:
- filtrácia vzorky kvôli prípadnému obsahu nečistôt, tkanív, premytie, značenie MPL:
CD45 FITC – panleukocytárny znak
CD3 PC5 – T-lymfocyty
CD4 RD1 – Th- lymfocyty
CD8 ECD – Tc-lymfocyty
Pozn. Vzorka BAL nesmie obsahovať krv.
V krvi je iné zastúpenie lymfocytárních subpopulácií ako v BAL, v prípade „znečištěnia“ BAL krvou nie je
možné rozpoznať, ktoré lymfocyty pocházajú z krvi a ktoré z BAL, čo vedie k znehodnoteniu vyšetrenie.
Bronchoalveolárna laváž - BAL
v v
- Diagnosticky dôležitý je pomer CD3+CD4+ k CD3+CD8+ T-lymfocytov (= imunoregulační index)
- Fyziologické hodnoty: pomer CD3+CD4+/CD3+CD8+ = 1,1 až 3,5
- Patologické hodnoty:
- výrazná prevaha pomocných CD4+ T-lymfocytov = podozrenie napr. na sarkoidózu, pneumóniu,
nádory dýchacích ciest,...
- prevaha cytotoxických CD8+ T-lymfocytov = podozrenie na hypersenzitívnu pneumonitídu,...
CD4-RD1
CD8-ECD
CD4-RD1CD8-ECD
CD8- CD4-
Bronchoalveolárna laváž (BAL)
Prevrátený pomer CD4+/CD8+ = podozrenie na sarkoidózu
Idiopatická intersitciálna pnemuonie?
Využití průtokové cytometrie v alergologii
Test aktivace bazofilů (bazotest - BAT)
funkční test umožňující vyšetření aktivace bazofilů po setkání se s určitým alergenem in vitro
Na povrchu bazofilů - FcεRI (receptor pro IgE)
CD203c Založen na expresi aktivačního znaku (CD63) na
povrchu periferních bazofilů po jejich expozici
alergenem in vitro
ohraničíme subpopulaci bazofilů (IgE pozitivní)
- sledujeme expresi CD63 (viz.obr.) a CD203c (není uvedeno) Sledujeme expresi CD63 na povrchu bazofilů
Reakce přecitlivělosti jsou podstatou alergických onemocnění.
Reakce přecitlivělosti I. typu neboli IgE mediovaná alergie - je
zprostředkovaná protilátkami IgE.
IgE se naváže na bazofily ve fázi senzibilizace.
Při dálším setkání s alergenem – alergen přemostí IgE, to vede k
aktivaci bazofilů - masivnímu uvolnění produktů degranulace
bazofilů a mastocytů zvýšená exprese CD63 a CD203c
na aktivovaných bazofilech.
Obrázky převzaty z prezentace MUDr. Zity Chovancové PhD., FNUSA ÚKIA Brno
Vyšetření periferní
heparinizované krve,
stimulace alergenem
při 37 °C ve vodní lázni,
zastavení reakce, lýza
erytrocytů a měření na
průtokovém cytometru
Test aktivace bazofilů – gatovací strategie
(Pacient alergický na kočku – alergen Fel)
1. Na Forward
scatteru a Side
scatteru gatovány
lymfocyty
2. Z lymfocytů
gatovány pouze IgE
pozitivní buňky -
bazofily
3. Bazofily –
sledujeme CD63
a CD203c
Negativní kontrola
Bazofily jsou CD63 neg.
Pozitivní pacient – vidíme
populaci CD63 pozitivních
bazofilů