Vyšetření funkce komplementu Mgr. Julie Štíchová FN u Sv. Anny v Brně Komplement oObjev – Jules Bordet – termolabilní substance v plazmě oSložka nespecifické humorální imunity oSystém několika desítek proteinů, většina tvořena v játrech oVelmi rychlá aktivace oSilné zánětotvorné a lytické účinky Komplementový systém tvoří: • Centrální proteiny C1-C9 • Komplementové receptory na buňkách • Stabilizátory komplementu • Inhibitory komplementu • Solubilní • Membránově vázané Komplement - funkce oAktivovaný komplement podporuje: o Rozvoj zánětlivé reakce (anafylatoxiny – C3a, C4a, C5a) o Opsonizace (C3b, C4b) o Chemotaxe (C3a, C5a, komplex C5,6,7) o Lýza buněčných membrán (C5b-C9 – MAC) o Imunokomplexy s C3dg – přemostění CD21 (komplementový receptor 2 – CR2) a BCR na B lymfocytech – zesílení signalizace, podpora diferenciace do plazmatických buněk Komplement - funkce oOdstraňování imunokomplexů z cirkulace (C3b)  vazba na CD35 (CR1) na RBC  zabránění tvorby velkých imunokomplexů likvidace ve slezině/játrech oNapomáhá odstraňování apoptotických tělísek makrofágy (opsonizace) RBC Makrofág Zdroj: Janeway Immunobiology 8th edition Regulace komplementu oAktivovaný komplement má amplifikační potenciál, nutná důsledná regulace 1) Regulátory pozitivní: o Properdin (faktor P) – stabilizace alternativní C3 konvertázy 2) Regulátory negativní a) Solubilní: ◦ C1 inhbitor (C1INH) ◦ Faktor H ◦ Faktor I b) Membránově vázané: ◦ Decay accelerating factor – DAF (CD55) ◦ Membrane cofactor protein – MCP (CD46) ◦ Protektin (CD59) Komplement – přehled laboratorních testů 1. Kvantitativní testy Stanovení koncentrace složek komplementu 2. Funkční testy stanovení funkce komplementové kaskády nebo inhibitorů 1. Kvantitativní stanovení oVyjádření výsledků – koncentrace g/l, mg/l 1) Nefelometrie – složky C3, C4, C1Q, C1-INH, MBL 2) ELISA 3) Radiální imunodifuze (RID) ◦ Stanovení C2 a C5 složky komplementu ◦ V gelu protilátka proti C2 nebo C5 ◦ Sérum pacienta difunduje do gelu ◦ V zóně ekvivalence se vytvoří precipitační prstenec ◦ Čím vyšší koncentrace C2/C5, tím větší průměr prstence Komplement – normální hodnoty oC1q (100-250mg/l) oC2 (10 – 30 mg/l) oC3 (0,7 – 1,5 g/l) oC4 (0,1 – 0,4 g/l) oC5 (80 – 170 mg/l) oMBL (> 0,3mg/l) oC1 inhibitor (210 – 390 mg/l) 2. Funkční vyšetření - odběry oNěkteré složky komplementu jsou termolabilní, proto: oSpeciální odběrové zkumavky bez separátorů oVyvarovat se teplotním šokům při transportu oZpracovat krev do 60 min od odběru oSérum zamrazit (-20 °C max. týden, -70 °C libovolně dlouho beze ztráty aktivity) oSérum po rozmrazení nesmí být opětovně zamraženo Hemolytický test CH50 oScreeningová metoda oZjištění funkčnosti klasické cesty aktivace komplementu  formace MAC oZájem o sníženou funkci komplementu oVýsledky se vyjadřují v % aktivace oSérum nutno zpracovat do 1 h od odběru oProč CH50?  jednotka CD50 Množství séra, které za standardních podmínek způsobí 50% lýzu definované suspenze beraních erytrocytů – 30min, 37 stupňů CH50 Reagencie: 1) 5% suspenze beraních erytrocytů ◦ (Příprava: Beraní krev 3 krát proprat fyziologickým roztokem, naředit na 5%) 2) Amboceptor – králičí protilátka IgM proti beraním RBC ◦ (Příprava: rozpustit lyofylizovaný prášek od výrobce v 1 ml destilované vody, poté naředit v poměru 1:1001 ve fyziologickém roztoku, např. 2 ul amboceptoru + 2 ml fyziol. Roztoku) Příprava hemolytického systému Do 5% suspenze RBC přidejte stejné množství amboceptoru (ne naopak!) Inkubace 15-30 min v lednici CH50 - vyhodnocení Jamka s fyziologickým roztokem = blank - 0% hemolýza (pozice 6H, 8H) Jamka s destilovanou vodou = 100% hemolýza (pozice 5H, 7H) 1) Z dubletů spočítat průměr absorbance pro každé ředění 2) Z průměrné absorbance (A) spočítat % lýzy pro každé ředění dle vzorce: 𝐀 𝐝𝐚𝐧é𝐡𝐨 ř𝐞𝐝ě𝐧í − 𝐀 𝐛𝐥𝐚𝐧𝐤𝐮 𝐀 𝟏𝟎𝟎% 𝐥ý𝐳𝐲 − 𝐀 𝐛𝐥𝐚𝐧𝐤𝐮 × 𝟏𝟎𝟎 = % 𝑙ý𝑧𝑦 𝑝𝑟𝑜 𝑑𝑎𝑛é ř𝑒𝑑ě𝑛í CH50 - hodnocení 3) Sestrojit graf – závislost procenta lýzy na ředění (kontrola i pacient) – 1 graf Odečíst ředění při 50% lýze  je aktivita komplementu u pacienta srovnatelná nebo nižší v porovnání s kontrolou? CH50 - souhrn oZjištění funkčnosti klasické (CH50) nebo alternativní (AH50) cesty komplementu oProjeví se lýzou definované suspenze RBC  nárůst absorbance supernatantu v důsledku uvolnění hemoglobinu oVýsledky se vyjadřují v % aktivace oPozor – se vzorkem pacienta nutno zpracovat i zdravou kontrolu, aby bylo pacienta s čím srovnat (u tohoto testu nejsou dány přesné referenční meze) Alternativy CH50 - ELISA oV některých laboratořích CH50/AH50 nahrazeno ELISA metodou o Princip – na dně jamky aktivátor určité cesty komplementu  detekce neoepitopu při formaci membranolytického komplexu Klasická cesta Lektinová cesta Alternativní cesta C1-INH funkční test oSérum nebo plazma se inkubuje s reaktantem - aktivovanou exogenní složkou C1s (je součástí setu), která je vazebným místem pro C1 INH oPokud je C1 INH funkční, naváže se na C1s oNásleduje odmytí nenavázaných složek o Do jamky se následně přidá konjugát - kozí protilátka proti lidskému C1 INH - značená křenovou peroxidázou (přeměna substrátu na barevný produkt) oSpektofotometrie - určí množství navázaného C1-INH oNefunkční C1 INH – ke zbarvení nedojde, protože se neutvořily detekovatelné komplexy C1s-C1INH Indikace k vyšetření komplementu oPodezření na funkční deficit komplementu o Testuje se CH50/AH50  v případě nalezení patologie se stanoví koncentrace jednotlivých složek oMonitorování zánětu o Složky komplementu se chovají jako pozitivní reaktanty akutní fáze – ↑↑ koncentrace oMonitorování imunokomplexových chorob o Silná aktivace komplementu – dochází ke konzumpci jeho složek – ↓↓ koncentrace oPodezření na poruchu regulátorů komplementu – C1 inhibitor + složky C3 a C4 Deficience složek komplementu oDeficience C1–C4 (podílí se na odstraňování imunokomplexů) oČastý výskyt imunokomplexových chorob (SLE-like) oNáchylnost k pyogenním infekcím oDeficience C5-C9 ◦ Náchylnost k pyogenním infekcím ◦ Opakované infekce Neisseria meningitidis o Deficience MBL – častější infekce u dětí Deficience složek komplementu oDeficit C1-inhibitoru – Hereditální angioedém oDeficit membránových inhibitorů CD55 a CD59 – Paroxysmální noční hemoglobinurie (PNH) oDeficit sérových inhibitorů faktor H a faktor I – atypický hemolyticko-uremický syndrom (aHUS) Když ochrana chybí… oMutace genu pro GPI kotvu v hematopoetické kmenové buňce  na povrchu BRC dochází k deficitu proteinů, které jsou normálně pomocí GPI kotvy vázány o DAF (CD55) – inhibice aktivace C3 a C5 o Protektin (CD59) – inhibice aktivity MAC (C5b-C6-C7-C8-C9) oRBC citlivé ke stopovým množstvím aktivovaného komplementu - hemolýza Paroxyzmální noční hemoglobinurie Hereditální angioedém oZpůsoben deficitem C1 inhibitoru (C1 INH) – který inhibuje serinové proteázy C1r, C1s (ireverzibilní vazba – C1 INH se spotřebovává) oDůsledek: 1) Aktivace klasické cesty komplementu – konzumpce složek, zejména C2 a C4 (provokující faktory – menstruace, stres, zubní zákroky….) 2) Nedostatečná regulace kininového systému (C1 INH inhibuje také kalikrein) Mechanismus: C1 INH není schopen dostatečně tlumit přeměnu prekalikreinu na kalikrein  Kalikrein štěpí vysokomolekulární kininogen na bradykinin  ten se váže na bradykyninové receptory na endoteliích  vazodilatace, zvýšená permeabilita cév (lokálně)  vznik nezánětlivého edému Hereditální angioedém Klinický obraz: oEpizodické otoky, edémy – podkoží, pod sliznicí oBledá barva otoků, nesvědivé, bez lokální zvýšené teploty oMohou být bolestivé – napětí ve tkáních oVětšinou se vyvíjejí postupně, během 12-36h oOtoky nereagují na antihistaminika, nedostatečně na kortikosteroidy oKlinické obtíže značně variabilní – dle výskytu otoku oOtok v oblasti krku – nebezpečný – hrozí udušení oOtok v oblasti břicha – připomíná akutní příhodu břišní oÚtlak močových cest, střeva  retence moči, střevní neprůchodnost Hereditální angioedém Typ 1: porucha tvorby C1INH, 85% nemocných ◦ Snížení C1INH na 12-50%, C3 v normě, snížené C2 a C4 Typ 2: Funkční porucha C1INH ◦ C1INH může být snížený, v normě i zvýšený, ale je funkčně neaktivní, snížené C2 a C4 Typ 3: estrogen dependentní – mutace FXII • Bez abnormalit v množství a funkčnosti C1 INH Pozn. Existuje také získaný angioedém, na který je třeba v diferenciální diagnostice myslet – snížení C1q 1) Zvýšený katabolismus C1 INH – některá lymfoproliferativní onemocnění 2) Autoimunitní onemocnění – tvorba autoprotilátek, které blokují aktivní místo C1 INH  ztráta funkce Vyšetření u hereditálního angioedému (HAE) oScreeningový test HAE: vyšetření C4 složky  pokud je snížená následuje: oVyšetření koncentrace a funkce C1 INH oStanovení dalších složek komplementu: C2, C3, C5 oVyloučení získaného angioedému: stanovení C1q oPotvrzení diagnózy pro HAE typ I a II: Genetické vyšetření – mutace v genu pro C1 INH HAE typ I 1 HAE typ I 2 3 Normální funkce klasické dráhy – pacient je mimo ataku Zvýšený C1 inhibitor HAE typ II 4 HAE typ II  pacient v atace 5 HAE typ I Kazuistika oŽena, 35 let obere antikoncepci Po vysazení antikoncepce otoky zmizely HAE typ III https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3760933/ Léčba HAE oSnaha minimalizovat stresující faktory, které indukují edémy o Omezení sportu o Volba vhodného povolání 3 strategie léčebné terapie: 1. Dlouhodobá profylaxe – mimo ataku 2. Krátkodobá profylaxe – prevence vzniku edému během zákroků 3. Léčba akutní ataky Léčba HAE 1. Dlouhodobá profylaxe o Atenuované androgeny – zvyšují syntézu C1 INH v játrech (nesmí se podávat dětem a těhotným ženám, zvážení užití u žen ve fertilním věku negativní vedlejší účinky - viritizace) o Kyselina tranexamová – inhibuje plazmin, čímž se „šetří“ C1 INH o Koncentrát C1 INH – u lidí, kde výše zmíněné léky nelze podávat nebo u závažných forem HAE 2. Krátkodobá profylaxe – snaha zabránit vzniku edému během operací, endoskopií a zubních extrakcí o Koncentrát C1 INH 3. Léčba akutní ataky o Koncentrát C1 INH – derivát z plazmy nebo rekombinantní o Icatibant – kompetitivní antagonista bradykininových B2 receptorů – kompetice o vazbu s bradykininem