Imunologické laboratorní metody ZÁKLADNÍ DĚLENÍ IMUNOLOGICKÝCH LABORATORNÍCH VYŠETŘENÍ •Serologická vyšetření –základním materiálem pro vyšetření •SÉRUM • •Buněčná vyšetření –základním materiálem pro vyšetření •PERIFERNÍ ŽILNÍ KREV • •Další zdroje materiálu pro imunologické vyšetření –mozkomošní mok, lymfatické uzliny, bioptické vzorky orgánů, kostní dřeň, bronchoalveolární laváž ODBĚR MATERIÁLU K IMUNOLOGICKÉMU VYŠETŘENÍ 4. uchování séra k dalšímu použití • 2 týdny při teplotě 4 °C • měsíce při teplotě –20 °C • roky při teplotě –80 °C 1. odběr venózní srážlivé krve 2. centrifugace 3. přenesení séra do jiné zkumavky SEROLOGICKÁ VYŠETŘENÍ – proces získávání séra ODBĚR MATERIÁLU K IMUNOLOGICKÉMU VYŠETŘENÍ Krev odebranou pro buněčná vyšetření není většinou možno skladovat delší dobu. Vyšetření je nutné provést do několika desítek minut (vyšetření fagocytárních funkcí) až několika hodin (vyšetření počtu a funkce lymfocytů). BUNĚČNÁ VYŠETŘENÍ – proces získávání buněk protisrážlivé činidlo EDTA protisrážlivé činidlo heparin PRIMÁRNÍ A SEKUNDÁRNÍ FÁZE SEROLOGICKÉ REAKCE •Primární fáze serologické reakce •pokud je zkoumaná protilátka v séru přítomna, dochází k vazbě protilátky na antigen • •není patrná pouhým okem o o •Sekundární fáze serologické reakce •uplatňuje se multivalence antigenu a polyvalence protilátek •vzniká prostorový komplex velkého počtu molekul antigenu a protilátek o vysoké molekulové hmotnosti PRIMÁRNÍ A SEKUNDÁRNÍ FÁZE SEROLOGICKÉ REAKCE •… vzniklé komplexy jsou • •viditelné pouhým okem • (AGLUTINACE, PRECIPITACE) • •mění roztok pravý na nepravý (koloidní) • (TURBIDIMETRIE, NEFELOMETRIE) •_________________________________________ •pokud uspořádání reakce umožňuje průběh jen primární fáze reakce nebo průběh sekundární fáze jen ve velmi omezeném rozsahu, je nutné vizualizovat reakci imunochemicky následnou detekcí • (IMUNOESEJE) CITLIVOST METOD K PRŮKAZU PROTILÁTEK •precipitace •30 mg/ml • •aglutinace •1 mg/ml • •radioimunoassay a ELISA –1 pg/ml • POLYKLONÁLNÍ a MONOKLONÁLNÍ PROTILÁTKY •POLYKLONÁLNÍ PROTILÁTKY oSměs imunoglobulinových molekul, jejichž vazebná místa nesou specificitu vůči různým epitopům na celé molekule antigenu oZískávají se obvykle imunizací zvířat – •MONOKLONÁLNÍ PROTILÁTKY oProdukt jednoho klonu B-lymfocytů, vykazují jedinečnou specificitu proti jednomu epitopu na molekule antigenu oZískávají se obvykle metodikami in vitro – PŘEHLED METOD PRO STANOVENÍ ANTIGENU NEBO PROTILÁTKY •vizualizace pomocí sekundární fáze reakce • oAGLUTINACE (přímá, nepřímá) oPRECIPITACE (jednoduchá, v kombinaci s elektroforézou, imunofixace) – o •vizualizace pomocí následné detekce • oIMUNOFLUORESCENCE oIMUNOANALÝZA (RIA, EIA, řada modifikací) oIMUNOBLOT, IMUNODOT – a g l u t i n a c e p r e c i p i t a c e E L I S A i m u n o f l u o r e s c e n c e e l e k t r o f o r é z a i m u n o e l e k t r o f o r é z a i m u n o f i x a c e W e s t e r n b l o t a g l u t i n a c e princip reakce antigen KORPUSKULÁRNÍ POVAHY •snadná vizualizace proběhlé reakce odíky velikosti antigenu odíky průběhu reakce v tekutině – Vazbou dvoj a vícevazebných protilátek na povrch antigenu dojde k překonání odpudivých, způsobených negativním nábojem na povrchu částic (zeta potenciál), a vytvoří se mezi nimi můstky … … vzniká AGLUTINÁT H:\FOTO laboratoř\IMG_2144.JPG a g l u t i n a c e faktory ovlivňující kvalitu aglutinační reakce •dostatek protilátek opříliš velké ředění protilátek ® aglutinace neproběhne – •přítomnost protilátek proti různým epitopům orozdíl v aglutinaci mezi monoklonálními a polyklonálními protilátkami • •vzdálenost mezi jednotlivými antigenními částicemi oodpudivé elektrické síly na povrchu částic klesají se čtvercem vzdálenosti a g l u t i n a c e přímá a nepřímá •přímá aglutinace •antigeny se nacházejí přímo na zkoumané částici – •průkaz krevních skupin, přímý Coombsův test, určování izolovaných bakteriálních kmenů (zejména ze skupiny enterobaktérií), Widalova reakce, Weil-Felixova reakce, průkaz některých zoonóz, … – •nepřímá aglutinace –zkoumaný antigen je navázán na povrchu vhodných makromolekulárních částic – –latex-fixační test, nepřímý Coombsův test, rychlé testy pro ambulantní vyšetření (ASLO), … – a g l u t i n a c e určování krevních skupin •ANTIGENY NA POVRCHU ERYTROCYTŮ • •polysacharidové •skupinový systém AB0 (antigen A, antigen B) •skupinový systém Lewis, P a Ii • •glykoproteinové •skupinový systém Rh (antigen D) •skupinový systém MNSs, Lutheran, Kell, Duffy, Diego • a g l u t i n a c e p r e c i p i t a c e E L I S A i m u n o f l u o r e s c e n c e e l e k t r o f o r é z a i m u n o e l e k t r o f o r é z a i m u n o f i x a c e W e s t e r n b l o t p r e c i p i t a c e princip reakce antigen NEKORPUSKULÁRNÍ POVAHY o nízké molekulové hmotnosti Antigen o nízké molekulové hmotnosti je rozpustný v kapalině a tvoří pravý roztok a při optimálním poměru antigenu a protilátky dochází ke vzniku makroskopicky zřetelné prostorové mřížky tvořené imunokomplexy. … vzniká PRECIPITÁT PRECIPITACE PROBÍHÁ … • v kapalinách (nefelometrie, turbidimetrie) • v gelech (vstřícná a radiální imunodifuze) … vzniká precipitační linie v místě ekvimolární koncentrace antigenu a protilátky … antigen a protilátka difundují gelem na podkladě koncentračního gradientu p r e c i p i t a c e … v gelech p r e c i p i t a c e … v kapalinách NEFELOMETRIE měření rozptylu viditelného světla TURBIDIMETRIE měření úbytku prošlého světla viditelné světlo a g l u t i n a c e p r e c i p i t a c e E L I S A i m u n o f l u o r e s c e n c e e l e k t r o f o r é z a i m u n o e l e k t r o f o r é z a i m u n o f i x a c e W e s t e r n b l o t E L I S A enzyme-linked immunosorbent assay princip reakce ke zjištění koncentrace antigenu nebo protilátky k detekci reakce mezi antigenem a protilátkou se používá enzym (konjugát zvířecí protilátky proti lidské protilátce IgG, IgA nebo IgM značené enzymem) Použití v klinické praxi: ·v současnosti zřejmě nejvíce používaná laboratorní metoda v imunologických a klinických laboratořích ·průkaz protilátek (antibakteriálních, antivirových, autoprotilátek) nebo antigenů ·vysoká citlivost testu umožňuje průkaz analytů o nízké koncentraci · ·ELISA není vhodná k detekci analytů o vyšší koncentraci (např. koncentrace sérových imunoglobulinů) – vzhledem k nutnosti vysokého ředění vzorků možnost velké chyby stanovení! E L I S A enzyme-linked immunosorbent assay princip reakce ke zjištění koncentrace antigenu nebo protilátky ·vazba antigenu na pevnou fázi (jamka mikrotitrační destičky) ·inkubace a následné promytí destičky ·aplikace séra s předpokládaným výskytem protilátek proti vyšetřovanému antigenu (dojde k vazbě protilátky na antigen) ·inkubace a následné promytí destičky ·aplikace konjugátu zvířecí (myší, králičí, …) protilátky proti lidskému IgG, IgA nebo IgM konjugované s enzymem ·inkubace a následné promytí destičky ·aplikace substrátu (bezbarvý substrát ® enzym ® barevný produkt) ·inkubace ·zastavení probíhající enzymatické reakce ·změření absorbance jamek spektrofotometricky (intenzita výsledného zbarvení je v určitém rozmezí koncentrací přímo úměrná množství navázané protilátky) ELISA_VK ELISA_I-VK Assay results ELISA READER a g l u t i n a c e p r e c i p i t a c e E L I S A i m u n o f l u o r e s c e n c e e l e k t r o f o r é z a i m u n o e l e k t r o f o r é z a i m u n o f i x a c e W e s t e r n b l o t i m u n o f l u o r e s c e n c e princip reakce zjištění přítomnosti antigenu nebo autoprotilátky k detekci přítomnosti antigenu nebo protilátky se používá fluorochrom (konjugát zvířecí protilátky proti antigenu nebo proti lidské protilátce ve třídě IgG, IgA nebo IgM značené flourochromem) PŘÍMÁ IMUNOFLOURESCENCE ·detekce přítomnosti antigenu nebo protilátky ve tkáních pomocí protilátek značených flourochromem ·diagnostika puchýřnatých chorob, SLE, porfyrií, vaskulitid, glomerulonefritid a podobně NEPŘÍMÁ IMUNOFLOURESCENCE ·detekce přítomnosti specifických protilátek v séru tak, že protilátky přítomné v séru pacienta jsou po vazbě na antigen dárcovské tkáně označené zvířecí protilátkou proti lidským IgG, IgA a IgM imunoglobulinům značenou flourochromem ·detekce přítomnosti autoprotilátek Přímá a nepřímá imunofluorescence Imunofluorescence_VK ANA Pozitive granular type IMM006 ANA – homogenous type a g l u t i n a c e p r e c i p i t a c e E L I S A i m u n o f l u o r e s c e n c e e l e k t r o f o r é z a i m u n o e l e k t r o f o r é z a i m u n o f i x a c e W e s t e r n b l o t e l e k t r o f o r é z a princip metodiky ·nabité částice se pohybují v elektrickém poli ·rychlost pohybu částic je závislá na velikosti celkového povrchového náboje, velikosti a tvaru molekuly a její koncentraci v roztoku · NATIVNÍ GELOVÁ ELEKTROFORÉZA BÍLKOVIN ·bez denaturačních činidel ·proteiny migrují gelem podle svého celkového náboje, velikosti a tvaru (citlivost elektroforézy je dána charakterem pórů gelu) ·elektroforéza sérových bílkovin (rozdělení proteinů plazmy na 5-6 frakcí) · ·Využití elektroforézy v klinické praxi: ·analýza a dělení směsí bílkovin, charakterizace povrchů organizmů (bakterií, virů a podobně), diagnostika monogenních chorob a podobně Aplikace séra pacientů do elektroforetických drah … … rozdělení sérových proteinů dle náboje, proteinů a velikosti … e l e k t r o f o r é z a albumin alfa 1 globulin alfa 2 globulin beta 1 globulin beta 2 globulin gama globulin elektroforéza sérových bílkovin a g l u t i n a c e p r e c i p i t a c e E L I S A i m u n o f l u o r e s c e n c e e l e k t r o f o r é z a i m u n o e l e k t r o f o r é z a i m u n o f i x a c e W e s t e r n b l o t W e s t e r n b l o t i m u n o b l o t princip metodiky 1.fáze ·rozdělení séra elektroforézou na gelu · 2. fáze ·přenos rozdělených antigenů na vhodnou matrici ·imobilizace antigenů a zablokování nespecifických vazebných míst ·vizualizace antigenů radiograficky, barevnou reakcí, fluorescenčně (specifické protilátky ® immunoblotting) ·Využití v klinické praxi: ·testy na HIV pozitivitu, definitivní test pro BSE, konfirmační test pro hepatitidu B, diagnostika boreliových infekcí elektroforetické dělení bílkovin a jejich následní přenesení na povrch membrány a typizace specifickými protilátkami výsledný protokol blotu … •Buněčné laboratorní imunologické techniky •lymfatické tkáně a orgány •buňky imunitního systému •molekuly imunitního systému ZÁKLADNÍ SLOŽKY IMUNITNÍHO SYSTÉMU Imunitní reakce je zajišťována různými druhy buněk a molekul a jejich vzájemnými interakcemi. Buňky imunitního systému spolu s buňkami pojivovými a dalšími strukturami tvoří funkční a anatomické celky … DIFERENCIÁLNÍ KREVNÍ OBRAZ odběr nesrážlivé krve do EDTA kojenci děti dospělí LEUKOCYTY 9 – 15 x 109/l 8 – 12 x 109/l 4 – 9 x 109/l GRANULOCYTY/POLYMORFONUKLEÁRY % % % neutrofilní granulocyty 25 - 65 35 - 70 55 - 70 • segmenty 22 - 65 25 - 65 50 - 70 • tyče 0 - 10 0 - 10 3 - 5 eozinofilní granulocyty 1 - 7 1 - 5 2 - 4 basofilní granulocyty 0 - 2 0 - 1 0 - 1 MONONUKLEÁRNÍ LEUKOCYTY % % % lymfocyty 20 - 70 25 - 50 25 – 40 monocyty 7 - 20 1 - 6 2 - 6 CD klasifikační systém (Paříž 1982) CD znaky (CD = cluster of differentiation) •molekuly buněčných membrán prokazované monoklonálními protilátkami (metodikou průtokové cytometrie) • •dnes známých více než 350 CD znaků (9th International Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens (HLDA9), březen 2010) •Využití v klinické praxi: vyšetření absolutního a relativního zastoupení buněčných subpopulací pomocí průtokové cytometrie (v imunologii rutinně vyšetření T-lymfocytárních, B-lymfocytárních subpopulací a NK buněk) •Odběr: nesrážlivá krev (EDTA) • LYMFOCYTÁRNÍ SUBPOPULACE CD ZNAKY PROCENTUÁLNÍ ZASTOUPENÍ Z LYMFOCYTŮ T lymfocyty CD3+ 58 – 85 % Th lymfocyty CD3+CD4+ 30 – 60 % z CD3+ Tc lymfocyty CD3+CD8+ 15 – 35 % z CD3+ B lymfocyty CD19+ 7 – 23 % NK buňky CD16+/56+ 6 – 20 % PŘEHLED BUNĚČNÝCH IMUNOLOGICKÝCH VYŠETŘENÍ V rámci imunologického vyšetření buněčných subpopulací stanovujeme: •absolutní a relativní počty buněk imunitního systému •Vycházíme ze stanovení celkového počtu leukocytů a diferenciálního krevního obrazu (absolutní a relativní počet lymfocytů, monocytů, granulocytů) •funkci buněk imunitního systému Vyšetření relativního a absolutního zastoupení lymfocytárních subpopulací PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE •využívá principu přímé imunofluorescence •buňky jsou inkubovány s protilátkou proti konkrétním CD znakům na povrchu buněk imunitního systému, která je označena fluorescenčním barvivem • •buňky laminárně proudí tryskou přístroje vystaveny laserovému paprsku světla • Průtokový cytometr IMG_0063 Průtoková cytometrie • http://images.google.cz/imgres?imgurl=http://www.abcam.com/ps/CMS/Images/Flow-Cytometry-Diagram2.jp g& Flow-Cytometry-Diagram2 lymfocytes monocytes granulocytes granularity CD3 CD4 CD3 CD8 CD3 CD8 Funkční vyšetření lymfocytárních subpopulací in vitro PROLIFERAČNÍ SCHOPNOST LYMFOCYTŮ jeden z fyziologických jevů buněčné aktivace •Lymfocyty aktivovány •Polyklonálními mitogeny •pro B lymfocyty •pokeweed mitogen (PWM) •pro T lymfocyty •phytohemagglutinin (PHA) •konkanavalin A (ConA) •Specifickými antigeny •tuberkulin •tetanický toxoid •