KONCEPCE GENOMU „READ AND WRITE“ A DŮSLEDKY JEJÍ APLIKACE V ONKOLOGII TZKM 19. 9. 2018 ÒGenomy jsou databáze DNA, které obsahují kódující a formátující sekvence, které umožňují dědičné předání schopnosti syntetizovat biologicky adaptivní molekuly RNA a proteinů. V průběhu evoluce se kódující sekvence i formátující signály mění, což umožňuje stále nové adaptace pomocé restrukturalizace genomu (Shapiro, 2011 a Shapiro, 2013). ÒDynamický read–write (RW) genome střídá tradiční představu „read only memory“ (ROM) genomu. ÒZákladní ideou této koncepce je myšlenka, že buňky používají DNA jako modifikovatelný prostředek skladující data („data storage medium“), který kóduje RNA a proteinové molekuly: tyto molekuly si musejí poradit s měnícím se prostředím. ÒZměna je pro žijící organismy kontinuálním dějem. Ke změnám dochází během průchodu buněk cyklem buněčného dělení, s měnícími se vlastnostmi vnějšího prostředí, se zkušeností buněk s poškozením, s vývojem multicelulární morfogenezy a s interakcí buněk s jinými buňkami a organismy. KONCEPCE „READ AND WRITE (RW) GENOME“ ÒKe zvládnutí krátkodobých změn buňky primárně nasazují přechodně vznikající nukleoproteinové komplexy, které jsou schopny regulaci exprese genomických dat a umožňují tak růst a replikaci buněk. ÒPro dlouhodobější změny, jako je buněčná diferenciace a multicelulární morfogeneze, vstupují do hry dědičné epigenetické modifikace genomu. ÒPro nejdlouhodobější změny, které vytvářejí nové biologické funkce během evoluce, buňky nasazují schopnost „natural genetic engineeringu“, které umožňují přebírat a alterovat sekvence DNA a rekonfigurovat organizaci genomu. Někdy tyto funkce mění strukturu DNA také v zájmu krátkodobých cílů (např. rychlá nastolená diverzita mezi receptory adaptivního imunitního systému). https://static-content.springer.com/image/art%3A10.1007%2Fs13277-016-5278-5/MediaObjects/13277_2016 _5278_Fig1_HTML.gif •Tumorigeneze je komplexní evoluční proces zahrnující mnoho genetických a epigenetických alterací. Epigenetické změny během iniciace a progrese tumoru poskytují abundantní zdroj variability, která podporuje rychlou adaptaci tumoru a poskytuje bohatý zdroj labilních biomarkerů pro genetickou analýzu. • •Tumour Biol. 2016 Jul 28. Biomarkers of genome instability and cancer epigenetics. Reis AH, Vargas FR, Lemos B. PRŮBĚH KANCEROGENEZE ØTři stádia: Ø(1) Iniciační stádium, které představuje prvotní genetickou událost, tj. mutaci určitého kritického genu. Jde o období časově krátké, ale nevratné; iniciovaným buňkám přináší růstovou selekční výhodu. Buňka tak získává potenciál maligní transformace; v tomto stádiu se může proces zastavit. (2) Promoční stádium, které trvá léta, až desetiletí; postižené buňky (klon) jsou stimulovány ještě k intenzivnější proliferaci. Promoční faktory samy o sobě nejsou však schopny vyvolat maligní nádorovou transformaci, jen ji podpořit. Intenzita promočních mechanismů musí dosáhnout určitého stupně, aby byl iniciovaný klon stimulován, a naopak odstranění podpůrných faktorů může proces kancerogeneze zpomalit nebo i zastavit. Ø(3) Stádium progrese je charakterizováno dalším postupným nahromaděním genetických změn jako je ü(a) nekontrolovaný růst pro trvalou aktivaci signální transdukce růstového stimulu, ü(b) alterace kritických bodů buněčného cyklu, ü(c) deregulace DNA- transkripčních faktorů. ÒNádor zůstává nejprve v místě svého vzniku, ale aktivací dalších faktorů se začne šířit do nejbližšího okolí (invaze) a cestou krevního oběhu na místa vzdálená (metastázy). Velmi důležitou podmínkou pro růst nádoru je dostatečný přísun živin a kyslíku, který musí být zajištěn vytvořením cévního zásobení (nádorová neoangiogeneze). •Schéma vývoje tumorigeneze • • obr2 ÒBuněčný cyklus je u zdravého jedince regulován tak, že každý buněčný typ v daném orgánu „ví“, kdy přestat s růstem. ÒU dospělého jedince jsou téměř všechny tkáně kontinuálně regenerovány a buňky opět „vědí“, kdy přestat s dělením. ÒU rakoviny buňka selhává ve schopnosti přijmout nebo interpretovat signály prostředí. ÒU nádorového bujení je postižena především regulace přechodu G1-fáze do S-fáze. Tři komplexy cyklindependentních kinas, cyklin D/cdk4, cyklin D/cdk6 a cyklin E/cdk2 fosforylují produkt retinoblastomového genu – Rb, a to na 10ti různých místech a mění tak schopnost Rb asociovat s buněčnými proteiny. Jeden takový protein - E2F – je transkripční faktor, který tvoří heterodimer s jiným transkripčním faktorem DP1, čímž se aktivuje několik genů nutných pro rozvoj S-fáze. Znamená to indukci aktivace dihydrofolátreduktasy, thymidinkinasy, DNA-polymerasy a, c-myc, c-myb a cdc2. Kromě této podpory růstových faktorů podporuje Rb také diferenciaci prostřednictvím jeho asociace s transkripčními faktory jako je MyoD a aktivovaný transkripční faktor, kterým jsou komplexy (ATF)/cAMP-response element binding proteiny (CREB). Rb je také místem zásahu pro transformující viry jako SV40 large T-antigen, adenovirový E1A a antigen E7 lidského papillomaviru (human papilloma virus E7). BUNĚČNÝ CYKLUS A NÁDOROVÉ BUJENÍ ÒJe-li poškození DNA příliš rozsáhlé a tedy neopravitelné, buňka se stává nenormální a je eliminována apoptózou. ÒNedojde-li však k apoptóze, vzniklá mutace přetrvává a může být při dělení takto mutované buňky přenesena na buňky dceřiné. Vzniká tak fenomén genové nestability, který podporuje maligní transformaci. Stává se to častěji kupř. u nosičů genu HNPCC (hereditární nepolypózní kolorektální karcinom). Je zde defekt v „opravném čtení“, takže chyba v replikaci DNA není zjištěna a opravný mechanismus není nastartován. •Základní skupiny proteinů regulujících buněčný růst • obr4 STÁRNUTÍ BUNĚK Øs postupujícím věkem se objevují funkční i morfologické změny skoro ve všech orgánech a tkáních. Tyto změny mají svůj podklad též ve stárnutí buněk. ØV mitochondriích se postupně snižuje kapacita oxidační fosforylace Ømění se syntéza strukturálních proteinů i enzymů pro alterace v DNA a RNA vznikající s narůstajícím věkem. Østárnoucí buňky mají sníženou schopnost opravovat poškozené chromosomy; snižuje se jejich potřeba množství živin. ØZměny v morfologii buňky: Jádro se stává abnormálně laločnaté a nepravidelné, dochází k pleomorfní vakuolizaci mitochondrií, ubývá endoplasmatického retikula a Golgiho aparát se zkrucuje. V buňkách se hromadí lipofuscin jako produkt lipidové peroxidace. TEORIE STÁRNUTÍ BUNĚK ÒPříčiny stárnutí buněk jsou pravděpodobně multifaktoriální: Øendogenní molekulární program stárnutí Øvliv exogenních škodlivých faktorů, který ovlivňuje životaschopnost buněk ØDlouhověkost je patrně specificky regulována na genové úrovni a řídí takové aktivity, jako je opravné mechanismusmy pro DNA nebo antioxidační obrana). ØKandidátní geny dlouhověkosti mohou též souviset s genetickým polymorfismem protektivních alel lipidového metabolismu, jako je např. e2 alela u apolipoproteinu E2. U dlouhověkých zjištěna též prevalence genetického polymorfismu genu paraoxonasy na kodónu 192. STÁRNUTÍ BUŇKY ØDochází k progresivnímu poškozování buněk reaktivními formami kyslíku a dusíku. Děje se tak nepříznivými vlivy z okolí, jako je ionizující záření a stále se snižující kapacita antioxidačních mechanismů. ØPeroxidace poškozuje nukleové kyseliny. Reaktivní formy kyslíku (ROS) způsobují denně alteraci 10 000 bazí DNA v jedné buňce, což převýší možnosti opravného mechanismu, jehož kapacita se s narůstajícím věkem snižuje. Mutace se hromadí nejen v DNA v jádře, ale též v mitochondriální DNA. Tento jev dramaticky roste s věkem. ØVolné kyslíkové radikály katalyzují oxidační modifikaci proteinů, včetně enzymů, což vede k jejich degradaci cytosolovými proteázami. Znamená to další omezení funkce buněk. STÁRNUTÍ BUŇKY ØU stoletých lidí byla prokázána vyšší poly(ADP-ribosyl)ační aktivita. Poly(ADP-ribosyl)ace nukleárních proteinů katalysovaná poly(ADP-ribosa)-polymerasou (PARP-1) (s NAD+ jako substrátem) je posttranslační děj ovlivňující DNA-šroubovici, což má vliv na instabilitu genomu způsobovanou endogenními i exogenními genotoxiny. ØS věkem stoupají post-translační modifikace intracelulárních a extracelulárních proteinů, což vede k funkčním i morfologickým změnám. Jednou z nich je neenzymová glykace proteinů a vznik konečných produktů pokročilé glykace (AGE-products). Øzměny v indukci proteinů tepelného šoku (heat shock proteins), zvláště Hsp70. Tyto proteiny jsou velmi důležitým obranným mechanismem vůči různým formám nadměrné zátěže. STÁRNUTÍ BUŇKY - TELOMERY ØTelomery jsou klíčovým stabilizačním faktorem terminální části chromosomu. Skládají se ze složky DNA (repetitivní sekvence 5'-TTAGGG-3‚) a z 6 proteinů. ØDélka telomer se zmenšuje po mnohonásobných pasážích (cekem se předpokládá 50-80 buněčných dělení / život). ØNejdelší jsou u spermií; u buněk fetálních jsou delší než u buněk z dospělých jedinců. ØJejich obnovování je katalyzováno telomerázou; délka telomer koreluje s obsahem telomeráz. Z toho důvodu se předpokládá, že úbytek DNA od konce chromosomů zkracováním telomer vede k deleci nezbytných genů, což má za následek omezení života buněk. STÁRNUTÍ BUŇKY - TELOMERY ÒTelomery jsou koncové části chromosomů. Při buněčném dělení se telomery zkracují kvůli neschopnosti syntetizovat konce lineárních nukleových kyselin. ÒPůvodní délka se obnovuje obvykle během tvorby pohlavních buněk činností telomerázy, což je neobvyklá RNA dependentní DNA polymeráza nesoucí si vlastní molekulu RNA jako templát pro tvorbu DNA. Kromě pohlavních buněk jsou své telomery schopné znovu prodlužovat i kmenové buňky díky přítomnosti vlastní telomerázy. ÒVětšina rakovinných buněk také obnovuje své telomery pomocí telomerázy, což umožňuje potlačit růst řady rakovinných buněk blokací telomerázy,[část rakovinných buněk ale opravuje své telomery alternativním systémem využívajícím rekombinaci. ÒPostupné zkracování délky telomer vede ke stárnutí buňky (senescence). ØFamiliární- více členů téže rodiny má nádor ØSporadické – jen jeden člen rodiny má nádor Ø ØRůzné mechanismy ØAčkoli některé formy nádorů jsou dědičné, většina vzniká na podkladě remodelace somatických buněk a je způsobena endogenními chybami v replikaci DNA, které jsou vyvolány genetickými (mutace v DNA, chromosomální aberace) i epigenetickými změnami. ØVliv kancerogenů ØUV-záření příslušné vlnové délky může být absorbováno bazemi DNA, která je tak poškozena za vzniku dimerů dvou sousedících pyrimidinů. Tato změna překáží normální transkripci i replikaci DNA. ØÚčinek ionizujícího záření je odlišný: dochází k rozštěpení (přerušení) DNA-řetězce; vznikají tak volné řetězce DNA, které musí být beze zbytku opět navázány opravným mechanismem. Nestane-li se tak (buňka netoreluje volné konce DNA), může dojít k translokaci určitých úseků chromosomů, což bývá příčinou aktivace proto-onkogenů. ÒJedna genetická změna však nestačí navodit maligní transformaci buňky; ta obvykle vzniká až po několika (5ti až 10ti) genových mutacích v průběhu řady let. ØGenová alterace navodí vznik nádorového fenotypu, např.: Øproliferace epitelové buňky hyperplazie adenom dysplazie karcinom „in situ" karcinom invazivní. ØPřeměna normální tkáně organismu do stavu invazivní nádorové choroby trvá v průměru 5 – 10 let. Ovlivňují to hereditární genetické faktory a somatické faktory genetické i epigenetické. GERMINATIVNÍ VS. SOMATICKÉ MUTACE ÒGerminativní mutace přítomny ve všech buňkách. V průběhu života se nemění (genetická predispozice) ÒSomatické mutace vznikají v somatických buňkách v průběhu života (maligní transformace). VZÁCNÉ ALELY A POLYMORFISMY ÒVzácné alely jsou „špatné“ (loss of function, gain of function) ÒJsou často pod tlakem selekce ÒPolymorfismy (> 1% frekvence v populaci) ÒVýznam: ÒZdroj vrozené variability genomu ÒFaktor přežití vzhledem k patogenům? ÒJak vzácné mutace, tak polymorfismy jsou způsobeny genovými mutacemi. ÒGenom současníků je výrazně modifikován evolucí (dlouhodoběji-paleolit) a historií pandemií (krátkodoběji-mor, syfilis, černé neštovice v Evropě) VZNIK GENOVÉ MUTACE ÒPravděpodobnost chyby při replikaci DNA během buněčného dělení je vysoká. Proto je nad stavem DNA ustaven přísný dohled, který zajišťuje stabilitu genomu (supresorové geny, např. P53). ÒPorucha supresorových genů (zejména obou alel) zakládá přirozeně větší riziko vzniku mutací. Ò Ò ØSoučasná koncepce modelu vícestupňového vývoje maligního nádoru předpokládá, jak bylo řečeno, nejprve postupné hromadění genetických změn. Ty se odehrávají v určitých skupinách genů jako jsou: üproto-onkogeny ütumor-supresorové geny ügeny udržující stabilitu genomu ümodifikující geny. •MR Stratton et al. Nature 458, 719-724 (2009) natureRGB nature07943-f1 •Mutace somatických buněk: kolorektální karcinom •MR Stratton et al. Nature 458, 719-724 (2009) natureRGB nature07943-f2 •Mutace somatických buněk: příklad •Sporadický kolorektální karcinom ÒProto-onkogeny tvoří normální vybavení genomu; Òkódují proteiny, které řídí proliferaci, diferenciaci a přežívání buněk. Ò100 různých lidských proto-onkogenů v každé somatické buňce. ÒJsou cílem extra- a intracelulárních cest transdukce signálů (zejména mitogenních), kterými se reguluje jejich exprese. ÒDojde-li k mutaci proto-onkogenů, mění se na onkogeny a jejich aktivita získává tumorigenní charakter. ÒK přeměně proto-onkogenu na onkogen stačí alterace pouze jedné alely genu – tzv. dominantní mutace a gen má charakter dominantního onkogenu. ÒMechanismy aktivace mají různé cesty: Ò(a) virová transdukce (kupř. onkogen src) Ò(b) genová amplifikace (myc, abl), Ò(c) virová inzerce (myc) Ò(d) chromosomální přestavba (myc, abl) Ò(e) mutace (ras) PROTO-ONKOGENY A ONKOGENY Ò ÒOnkogen může vzniknout mutací genů kódujících proteiny signálních drah, které realizují přenos růstového stimulu (růstového faktoru), dojde-li k jeho abnormální aktivitě. To může být způsobeno tím, že se tvoří v buňce, kde se normálně netvoří nebo se tvoří v nadměrném množství anebo v tak pozměněné formě, která se vymyká normální regulaci. ÒTakovéto mutované geny jsou tumorigenní, protože umožňují buňce proliferovat i v nepřítomnosti extracelulárního signálu. Ò Jsou klasifikovány do 5 tříd: Ò(1) růstové faktory Ò(2) receptory pro růstové faktory Ò(3) komponenty intracelulárních signálních drah Ò(4) jaderné transkripční faktory Ò(5) proteiny řídící buněčný cyklus •Onkogeny a antionkogeny, jejich produkty • obr6 • GEN Alterace genu TUMOR Retinoblastoma gen (Rb) Delece Bodová mutace Retinoblastomy, osteosarkomy sarkomy měkkých tkání, Malobuněčné karcinomy plic, karcinomy močového měchýře a prsu Cyklin D Translokace chromosomů, Genová amplifikace Adenom parathyreoidey, Některé lymfomy,Karcinomy mléčné žlázy, hlavy a krku, jater (primární), jícnu cdk4 Amplifikace, Bodová mutace Glioblastom, sarkom, melanoblastom p16INK4a (p15INK4b) Delece, bodová mutace, metylace Karcinomy pankreatu, ezofagu, plic (malobuněčné), Glioblastomy, sarkomy, familiární melanomy a karcinomy pankreatu • • • Regulátory buněčného cyklu u maligních nádorů •Přehled některých recesivních onkogenů podmiňujících nádorová onemocnění • Symbol Název Nádorové onemocnění APC Gen adematózní polypózy tlustého střeva Kolorektální karcinom Karcinom pankreatu Desmoidy Hepatoblastom BRCA1 Gen 1 pro familiární karcinom prsu/vaječníku Hereditární karcinom prsu/ ovaria BRCA2 Gen 2 pro familiární karcinom prsu/vaječníku Hereditární karcinom prsu/ ovaria CDH1 Gen pro kadherin 1 Familiární karcinom žaludku Lobulární karcinom prsu CDNK2A Gen inhibitoru cyklin-dependentní kinasy 2A (p16) Maligní melanom kůže CYLD Gen familiární cylindromatózy Cylindromy EP300 Gen vazebného proteinu 300 kD-E1A Karcinomy kolorektální, pankreatu, prsu • • ÒVliv apoptózy na přežití nádorových buněk (pro- a anti-apoptózové faktory) ÒZvýšená exprese Bcl-2 inhibuje zánik buněk apoptózou. ÒJe to způsobeno vazbou Bcl-2 proteinu na BAX-protein, což zabrání jeho homodimerizaci, která podporuje apoptózu. obr5 GENY UDRŽUJÍCÍ STABILITU GENOMU ÒOznačují se někdy jako mutatorní geny a bývají i řazeny k tumor-supresorovým genům. Produkty těchto genů se uplatňují v opravných mechanismech poškozené DNA. ÒJejich mutace vede ke zvýšené frekvenci mutovaných onkogenů a tumor-supresorových genů, někdy až 1000krát. E:\PREDNASK\obr8.gif GENY UDRŽUJÍCÍ STABILITU GENOMU ÒPatří sem geny, jejichž produkty zajišťují vystřižení poškozeného úseku DNA a umožňují excizní opravný proces. Jejich recesivní mutace způsobuje onemocnění zvané xeroderma pigmentosum a Cockayenův syndrom, což jsou prekancerózy se zvýšenou náchylností ke karcinomům kůže navozeným expozicí na UV-záření. GENY UDRŽUJÍCÍ STABILITU GENOMU Ò Další skupinou mutatorních genů jsou „mismatch“ opravné geny; kódované proteiny opravují chybné zařazení baze při replikaci DNA (nikoliv však komplementární). Projevem mutací těchto genů je instabilita na nukleotidové úrovni – mikrosatelitová instabilita. Zárodečné mutace zejména MSH2 a MLH1 genů jsou podkladem hereditárního nepolypózního kolorektálního karcinomu (HNPCC) . ÒMutace genů, jejichž produkty zajišťují „opravné čtení“, jehož úkolem je identifikace chybných úseků DNA při replikaci, byly prokázány u karcinomu žaludku a tlustého střeva. Jedná se především o mutaci genu pro polymerasu d. GENY UDRŽUJÍCÍ STABILITU GENOMU Ò Rozpoznání poškozené DNA a aktivace p53 vyžaduje přítomnost ATK. Tento gen kóduje kinasu, která aktivuje jak CHK2 tak p53 při poškození DNA. Děti trpící ataxií-teleangiektazií mají inaktivující mutaci obou alel. ÒV klinickém obraze je pak imunodeficience, mozečkové příznaky a zvýšené riziko vzniku maligního nádorového onemocnění, především lymfomů. Buňky těchto pacientů nemohou aktivovat p53 jako odpověď na poškození DNA. Ò Jiný syndrom označovaný jako NBS (Nijmegen breakage syndrom) je způsoben homozygotní inaktivací genu NBS, který se podílí přímo na opravách poškozené DNA. Do tohoto mechanismu rozpoznávajícího a opravujícího poškozenou DNA vstupuje též gen BRCA1. Mutace v jedné alele zárodečných buněk nesoucích tento gen je odpovědná asi za polovinu případů karcinomu mléčné žlázy s familiárním výskytem. Při účinku proteinu BRCA1 hraje důležitou funkci jak ATM tak CHK2, které umožňují jeho fosforylaci, když dojde k poškození DNA. ATM také fosforyluje kofaktor BRCA1 - CtIP, který reguluje transkripci genu BRCA1. Defekty DNA-opravného mechanismu přispívají k akumulaci genetických defektů (viz genová nestabilita navozená genem HNPCC = gen pro hereditární nepolypózní kolorektální karcinom) podporují progresi maligně transformovaných buněk. Òje jeden z nukleárních proteinů, který má klíčovou úlohu v regulaci cyklu buněčného dělení při přechodu z G0 do G1-fáze. Obsahuje domény pro vazbu na specifický úsek DNA, dále oligomerizující a transkripci aktivující domény. Váže se jako tetramer na vazebné místo na určitém úseku DNA a tím aktivuje expresi genů, kódujících faktory inhibující proliferaci a podporující invazivitu buněk. ÒMutanty genu p53 jsou nalézána u řady maligních tumorů. Pozměněný TP53 ztrácí schopnost vazby na příslušný lokus DNA, což vede k nedostatečné produkci faktorů potlačujících nádorový růst. Alterace genu p53 se objevuje nejen jako somatická mutace, ale též jako mutace v zárodečných buňkách u některých nádorových onemocnění s familiárním výskytem (syndrom Li-Fraumeni Øje klíčovým regulačním faktorem, který monitoruje poškození DNA. I Øinaktivace p53 bývá jedním z prvních kroků, který vede k maligní transformaci při vývoji řady nádorových onemocnění. ØPacienti s Li-Fraumeniho syndromem mají obvykle jednu mutantní alelu v zárodečných buňkách a tím i riziko vzniku sarkomů, leukemie a karcinomu mléčné žlázy. Vzácně pacienti s Li-Fraumeniho syndromem nemají v zárodečných buňkách tuto mutaci, ale mutaci genu CHK 2, kódující proteinkinasu, která fosforyluje protein p53, čímž dochází k jeho aktivaci. Tito pacienti však mívají alteraci v jiných genech – MDM 2 a p14ARF, které regulují expresi p53. ÒKromě mutací v proto-onkogenech mohou vznikat mutační změny v anti-onkogenech (tumor-supresorové geny). ÒNa rozdíl od onkogenů jimi kódované proteiny mají antiproliferační účinek, podporují diferenciaci a apoptózu. V každé somatické buňce je asi 40 tumor-supresorových genů. Aby se staly tumorigenními, musí být mutovány obě jejich alely – proto název recesivní onkogeny. S tím souvisí tzv. dvouzásahová teorie, kterou po prvé formuloval Knudson, když vysvětloval vznik vzácného hereditárního retinoblastomu. Na rozdíl od mnohem častějšího sporadického retinoblastomu, kde se jedná o náhodné mutace jedné a posléze druhé alely v buňce sítnice, je u hereditární formy jedna mutovaná alela zděděna, příslušný jedinec je heterozygot, u něhož se zděděná nádorová predispozice zatím neprojevuje. Dojde-li však k mutaci/eliminaci druhé alely, iniciuje se rozvoj nádorového klonu buněk sítnice. Tomuto procesu se říká ztráta heterozygozity (LOH=loss of heterozygozity). Prvně objevený tumor-supresorový gen byl nazván retinoblastomový gen = Rb-gen a jeho produkt RB-protein. Vyskytuje se v každé buňce, kde reguluje buněčný cyklus dělení. ÒVarianty s různým počtem kopií jsou asociovány s různými fenotypy. Naůř. Trisomie 21 chromosomu způsobuje Downův syndrom. ÒZvýšená exprese genů na chromosomu 21 má za následek klinicky heterogenní onemocnění z příznaky poruchy kognitivních funkcí, obličejové dysmorfie, opožděného růstu, predispozice k nádorům, mikrocefalie a abnormalit srdce a kostry. •O´Driscoll M: Curr Genomics. 2008 May; 9(3): 137–146 MODIFIKUJÍCÍ GENY ÒJde o geny, jejichž mutace může ovlivnit vznik a rozvoj nádorového procesu. ÒJejich produkty mohou pozitivně nebo negativně působit na průběh kancerogeneze, a to s interindividuální nebo interfamiliární variabilitou. ÒNa jejich prozkoumání se teprve čeká; bude umožněno nejnovějšími technikami molekulové biologie v oblasti genomiky a proteomiky. ÒLidské rakovinné buňky nesou řadu genetických abnormalit ÒEepigenetické alterace mohou být odpovědné za začátek tumorigeneze(Baylin and Jones, 2011; Sandoval and Esteller, 2012; Sharma et al., 2010). ÒTumorózní epigenom je charakteristický podstatnými epigenetickými změnami. ÒJedná se především o změny v metylaci DNA a histonů a v acetylaci histonů. ÒHuman malignant tumors are characterized by pervasive changes in the patterns of DNA methylation. These changes include a globally hypomethylated tumor cell genome and the focal hypermethylation of numerous 5'-cytosine-phosphate-guanine-3' (CpG) islands, many of them associated with gene promoters. ÒSpecific DNA methylation changes were linked with tumorigenesis in a cause-and-effect relationship. ÒCancer-associated DNA hypomethylation may increase genomic instability. ÒPromoter hypermethylation events can lead to silencing of genes functioning in pathways reflecting hallmarks of cancer, including DNA repair, cell cycle regulation, promotion of apoptosis or control of key tumor-relevant signaling networks. ÒMany of the most commonly hypermethylated genes encode developmental transcription factors, the methylation of which may lead to permanent gene silencing. Inactivation of such genes will deprive the cells in which the tumor may initiate from the option of undergoing or maintaining lineage differentiation and will lock them into a perpetuated stem cell-like state thus providing an additional window for cell transformation. •Int J Mol Sci. 2018 Apr 12;19(4) MALIGNÍ TRANSFORMACE BUŇKY ØDělení buněk je velmi pečlivě řízeno tak, aby odpovídalo potřebám celého organismu. ØV časných fázích života jedince kapacita dělení buněk převažuje nad jejich zanikáním, v dospělosti je v dynamické rovnováze, ve stáří začíná převažovat involuce. ØNěkteré buňky se však vyhnou kontrole replikace (neodpovídají na vnější signály, kontrolující jejich dělení, jsou autonomní), a mění se tak na buňky nádorové. ØTy, které si alespoň přibližně zachovávají vzhled i funkci buněk normálních a především zůstávají stále na místě, kde vznikly, jsou buňky benigní a jejich proliferace dá vzniknout benigním tumorům. Buňky, které ztratily většinu vlastností buněk, od kterých jsou odvozeny a mají snahu pronikat do svého okolí (invazivita) i na vzdálená místa (metastázy), jsou buňky maligní a tvoří maligní tumory. ÒNavození transkripce onkogenů, kódujících syntézu onkoproteinů, transkripčními faktory zahajuje maligní transformaci buňky. Onkoproteiny jsou velmi podobné (někdy i shodné) s proteiny kódované proto-onkogeny normálních buněk, jejichž úkolem je řídit a kontrolovat růst, proliferaci, diferenciaci a zánik buněk. Klasifikují se do pěti tříd: Ò(1) růstové faktory Ò(2) receptory růstových faktorů Ò(3) intracelulární transducery signálu Ò(4) nukleární transkripční faktory Ò(5) proteiny kontrolující buněčný cyklus. NÁDOROVÉ BUŇKY ØNádorové buňky proliferují neomezeně – jsou „nesmrtelné“. Úplné vysvětlení tohoto replikačního stárnutí není zatím jasné. Bylo navrženo několik možných mechanismů: ü(a) aktivace genů pro stárnutí na chromosomu 1 a 4, üb) alterace nebo ztráta genů pro regulaci buněčného růstu (c-fos nebo Rb-gen), ü(c) indukce inhibitorů buněčného růstu, ü(d) další příčiny, např. zkracování telomer. Øse vyznačují především pokračujícím dělením. ØSnižují se u nich požadavky na přítomnost hormonů a růstových faktorů. ØNěkteré transformované buňky produkují vlastní specifické růstové faktory (autokrinní stimulace). ØDochází ke ztrátě schopnosti zastavit růst. U normálních buněk totiž snížení hladiny isoleucinu, fosfátu, epidermálního růstového faktoru a dalších látek, které regulují růst, pod určitou prahovou koncentraci, navodí přesun do klidového stavu (G0-fáze). Normální buňky začínají růst (dělit se) pouze, když jejich nutriční požadavky jsou řádně zajištěny. Nádorovým buňkám tato schopnost zastavit růst jako reakce na nedostatek živin a růstových faktorů schází; dokonce pokračují v proliferaci, i když přitom mohou zahynout. NÁDOROVÝ FENOTYP ÒTransformované buňky vykazují zvýšené vychytávání glukosy pro vyšší afinitu glukózového transportéru v membráně, podobně jako je tomu normálně pouze u erytrocytů nebo buněk v mozku. Koreluje to s vysokou glykolytickou aktivitou. ÒChybí u nich dále povrchový fibronektin, který mají klidové buňky a který udržuje jejich tvar. ÒZměny cytoskeletových elementů (aktinová mikrofilamenta nejsou difuzně rozptýlena, ale koncentrují se blíže povrchu) jsou příčinou zvýšené mobility povrchových proteinů. ÒNepřiměřená sekrece transformujícího růstového faktoru a a b a dalších růstových faktorů, které řídí normálně vývoj embryonálních buněk. ÒProdukují též plasminogenový aktivator, což je proteáza přeměňující plasminogen na plasmin. Vysoká tvorba plasminu nádorovou buňkou pomáhá penetraci skrz lamina basalis. ÒMikroprostředí nebo stroma, v kterém se nádorové buňky nalézají, mají rovněž vliv na progresi („teorie semene a půdy"). Bylo prokázáno, že metaloproteinasy stromální proteinové matrix (MMP 9) hrají významnou úlohu v časných stádiích vývoje tumoru a při angiogenezi. U metastáz karcinomu prostaty do kostí se předpokládá jakýsi „osteomimetický" účinek (chemoatrakce a podpora adherence ke kostnímu endotelu) a ovlivňování vlastností a chování osteoblastů a osteoklastů. Ò üNádorový fenotyp je charakterizován maligní transformací buňky, která se projevuje: - ztrátou kontroly buněčného dělení (alterace buněčného cyklu, antiapoptóza – „nesmrtelnost“ nádorové buňky, alterace v transdukci signálů), - ztrátou kontaktu buňka-buňka, invazivitou, - změnami v metabolismu (podpora enzymů anaerobní glykolýzy a potlačení enzymů oxidace cestou Krebsova cyklu, „uchvacování“ dusíku nádorovými buňkami, zvýšená lipolýza, tvorba nádorových antigenů), - podporou angiogeneze. ü Maligně transformované buňky jsou pravděpodobně odolné vůči stresovým faktorům okolí jako je hypoxie, kyselé pH, nedostatek glukosy a živin, odloučení od bazální membrány, které normální buňky ničí. ØPři vzniku metastáz hrají důležitou úlohu chemokiny. ØÚloha chemokinů u nádorového bujení je složitá: üpodporují vrozenou nebo specifickou protinádorovou imunitu, ümohou podporovat nádorový růst a tvorbu metastáz tím, že posilují proliferaci nádorových buněk, migraci a neovaskularizaci. üChemokiny tvořené nádorovými buňkami mohou působit inhibici protinádorové imunitní odpovědi, stejně jako autokrinním mechanismem působí jako růstové faktory. Ø Dalším rysem maligně transformované buňky je ztráta závislosti adherovat k podkladu (substrátům). V buněčné kultuře normální buňky, plovoucí volně v živném roztoku (gelu), mohou sice metabolizovat (žít), ale nikoliv se dělit; nádorové buňky ano. ØZtráta inhibice motility kontaktem se sousedními buňkami je další charakteristika nádorových buněk. Znamená to, že mohou růst jedna přes druhou, mohou být na sobě i pod sebou a jen zřídka vytvářejí mezerové spoje (gap junction). ØZměny na buněčné membráně jako je modifikace glykolipidů a glykoproteinů (snížení množství sialové kyseliny vázané na proteiny, redukce gangliosidů). To sice nemění strukturu transformované buňky, ale zvyšuje laterální mobilitu povrchových lipidů, respektive vazbu membránových proteinů na cytoskelet. Ø Maligní buňky mají zvýšenou motilitu a schopnost pronikat do okolí (invazivitu) a po průniku do krevní cirkulace usadit se a množit na jiném místě (tvořit metastázy). Ø K tomu jsou vybaveny schopností produkovat receptory, aby se mohly zachytit na proteinech bazální membrány (tvorba adhezních molekul), dále tvorbou hydrolytických enzymů, které pomohou rozrušit kolageny, proteoglykany a glykosaminoglykany bazální laminy a umožnit tak pronikání do okolí, natrávit stěnu cév, zachytit se v cirkulaci na shlucích trombocytů a vytvořit tak nádorové emboly, odolávat účinkům protinádorového imunitního mechanismu, zachytit se na stěně cév vzdáleného místa, proniknout do intersticia tkáně, založit metastázu, proliferovat, podporovat angiogenezi a případně vytvářet metastázy metastáz. Ø To je tzv. metastázový fenotyp. E:\PREDNASK\obr9.gif E:\PREDNASK\obr10.gif APOPTÓZA A TUMORIGENEZE Ò ÒRůst nádorových buněk je podmíněn nejen nekontrolovaným buněčným dělením, ale také snížením jejich opotřebovatelnosti a naopak zvýšenou schopností přežít. ÒVětšina nádorových buněk, ne-li všechny, získala rezistenci vůči mechanismům vedoucím k jejich programovanému zániku – apoptóze. Existují experimentální důkazy, že narušení signalizace apoptózy je obecným předpokladem existence a rozvoje nádorových buněk. Velmi důležitou úlohu přitom má pravděpodobně onkogenní potenciál faktoru rodiny Bcl2. Ò ÒBcl2 (B-cell lymphoma 2) gen byl původně objeven jako gen napojený na imunoglobulinový lokus v průběhu chromosomové translokace u folikulárního lymfomu. Přitom se též zjistilo, že jeho nadměrná exprese má spíše než na proliferaci vliv na apoptózu, respektive na její narušení. Znamená to, že nascentní neoplastické buňky získávají touto inhibicí programovaného zániku selekční výhodu. Mohou setrvávat zahnízděny jako ložiska v hostitelské tkáni, zejména v místech, kam se nedostanou cytokiny a kyslík. Tento únik před apoptózou je pak podpořen dalšími onkogenními sebezáchovnými mechanismy, které vedou ke vzniku agresivnějších klonů; defektní apoptóza též usnadňuje metastázování, protože buňky mohou ignorovat restrikční signály přicházející z okolí a přežívat odděleně od extracelulární matrix. Mutace, které favorizují rozvoj nádoru, odvracejí odpověď na cytotoxickou terapii a vznikají tak refrakterní klony. Úloha Bcl2 (a jeho homologů – Bcl-xL a Bcl-w) v mechanismu inhibice apoptózy spočívá pravděpodobně v ochranném účinku na integritu mitochondrií tím, že brání výstupu cytochromu c do cytoplasmy, což znemožní aktivaci kaspasové kaskády. obr2 ÒNádorová buňka se stává „nesmrtelnou“. Je to způsobeno zvýšenou aktivitou enzymu telomerasy. Opakované dělení buněk je omezeno - zkracováním telomer. ÒTelomery jsou klíčovým stabilizačním faktorem terminální části chromosomu a ukotvují je k nukleární matrix. Telomery mají opakující se sekvenci nukleotidů TTAGGG. Délka telomer se zmenšuje po mnohonásobných pasážích (1 buněčný cyklus = zkrácení o 1 telomeru) a dále v buněčných kulturách od pacientů v pokročilém věku. Jejich obnovování je katalyzováno telomerasou; délka telomer koreluje s obsahem telomeras. Z toho důvodu se předpokládá, že úbytek DNA od konce chromosomů zkracováním telomer vede k deleci nezbytných genů, což má za následek omezení života buněk. ÒPočet telomer slouží jako generační hodiny, které odpočítávají jednotlivé cykly buněčného dělení a určují tak životnost buněk a replikační potenciál. Nádorové buňky mají replikační potenciál vysoký; umožňují jim to nejméně dva mechanismy, kterými si udržují dostatečný počet telomer, respektive jejich obnovování. Nejběžnější (aktivita prokázána u 85-90% nádorových buněk) je Òmechanismus TERT, což je proteinová komponenta telomerasy; jen malá část nádorových buněk využívá další mechanismus Òtzv. alternativní prodlužování telomer (ALT), které umožňuje udržování počtu telomer bez účinku telomerasy. VÝZNAM ANGIOGENEZE V ROZVOJI NÁDOROVÉHO ONEMOCNĚNÍ Ò ÒAngiogeneze má klíčový význam pro růst nádoru. Rostoucí nádorové ložisko může bez cévního zásobení dosáhnout velikosti pouze 1 – 2 mm3, kdy přívod kyslíku a živin je možný ještě difuzí z okolní tkáně. Nádor pro další růst potřebuje vlastní cévní zásobení. Popud je tomu dán vzniklou hypoxií nádorových buněk. Ta navodí genetickou nestálost, dochází ke vzniku mutací; mutace genu p53, který je ochráncem genomu, neumožní opravu chyby v záměně bazí. VÝZNAM ANGIOGENEZE V ROZVOJI NÁDOROVÉHO ONEMOCNĚNÍ Ò ÒDochází dále k nerovnováze mezi antiangiogenními a proangiogenními faktory. Tato změna, kterou se zahájí proces nádorové angiogeneze, se nazývá „angiogenní switch“. Objevuje se nový fenotyp nádorových buněk, vyznačující se potlačením antiangiogenních faktorů – thrombospondinu – a zvýšenou tvorbou angiogenních působků. Buňky nádoru a sousední endoteliální buňky se v tomto směru vzájemně ovlivňují parakrinní, ale i autokrinní sekrecí angiogenetických faktorů. C:\Users\prof. Vasku\Pictures\2013-10-09 HIF\HIF 001.jpg ÒNovotvorbu cév v nádorovém ložisku předchází ÒVazodilace cév v nejbližším okolí navozená především zvýšenou aktivitou NO-syntasy a tím produkcí NO-radikálů. To také potencuje mitogenní účinek VEGF. ÒProdukce metaloproteináz rozrušuje bazální membránu, čímž se usnadňuje nejen migrace endotelových buněk po fibrinových vláknech tvořených stimulací fibroblastů, ale i migrace tumorových buněk. ÒMigrující endotelie jsou zdrojem integrinů zajišťujících jejich životnost. ÒKapilární morfogenezi podporují ještě další působky – (např. E-selektin). Vaskularizace nádorového ložiska umožní jeho prokrvení (perfuzi), a tím jeho další růst. ÒTyto procesy jsou alespoň částečně koordinovány HIF cascade_image[1] ØČím je angiogeneze intenzivnější, tím je prognóza nádorového onemocnění nepříznivější; zvyšuje se riziko metastáz. ØStupeň angiogeneze může sloužit jako prognostický faktor. ØNejintenzivnější angiogeneze bývá na okraji nádorového ložiska, kde lze její intenzitu posoudit histologicky. Používá se také zviditelnění tzv. horkých ložisek (hot spots) pomocí monoklonálních protilátek proti cévním endoteliím nebo proti adhezivním molekulám (CD31, CD34), event. proti von Willebrandovu faktoru. ØCitlivým ukazatelem hustoty kapilárního řečiště je stanovení akvaporinu-1 (AqP-1); jde o faktor působící synergicky s VEGF a významně zvyšující cévní propustnost. •Copyright ©2005 American Association for Cancer Research •Nyberg, P. et al. Cancer Res 2005;65:3967-3979 •Figure 1. The pathologic and physiologic angiogenic balance ÒEpigenetické změny („switches“) hrají důležitou roli v rozvoji rakoviny. ÒVětšina až dosud objevených „switches“ je indukována zánětem nebo používá zánětlivé signální cesty. ÒChronické infekce a zánět se účastní asi u 25 % všech maligních tumorů. ÒV mnoha případech je vyvolávají prozánětlivý faktor (např. IL-6) dále aktivován v nádorových buňkách k udržení nového (nádorového) fenotypu. ÒTo znamená, že zánětlivá signalizace, která pochází z imunitních buněk, je rakovinnými buňkami „adoptována“ prostřednictvím epigenetických „switchů“. Protože tyto „switche“ jsou reverzibilní, mohou se stát cílem protinádorové léčby. •Fig. 2 Schematic outline of the reduced mtDNA copy number mediated mitochondrial retrograde signaling in C2C12 myocytes. Reduction of mtDNA content below 70% disrupts Δψm which results in elevated cytosolic Ca 2 + and activation of Calc... •Manti Guha , Narayan G. Avadhani •Mitochondrial retrograde signaling at the crossroads of tumor bioenergetics, genetics and epigenetics •Mitochondrion Volume 13, Issue 6 2013 577 - 591 •http://dx.doi.org/10.1016/j.mito.2013.08.007