Vyšetření funkce fagocytů Mgr. Julie Štíchová Výkonné buňky nespecifické imunity Profesionální fagocyty  Neutrofilní granulocyty  Tvoří 50 – 70 % z WBC  Nízká fagocytární kapacita – „mikrofágy“  Krátká životnost  Monocyty  2-12 % z WBC  Z cirkulace přecházejí do tkání kde diferencují v makrofágy  Dlouhá životnost  Vyšší fagocytární kapacita První obranná linie  Poranění tkání  aktivace tkáňových makrofágů  Produkce prozánětlivých cytokinů a chemokinů  Rozvoj zánětu, lákání neutrofilů do místa infekce, indukce syntézy proteinů akutní fáze v játrech, vzrůst teploty (hypothalamus) Průnik do místa infekce 1. ADHEZE  Endotelie – vlivem prozánětlivých cytokinů exprese adhezivních molekul  Průběh ve 2 fázích:  Fáze 1: E a P selektiny - reverzibilní vazba granulocytů – rolling  Fáze 2: Pokud během rollingu přetrvává zánětlivý signál, následuje ireverzibilní vazba na endoteliální stěnu – LFA na povrchu neutrofilu se váže na endoteliální integriny – VCAM, ICAM Průnik do místa infekce 2. Extravazace, diapedéza  Prostup skrze endotelie  PECAM, JAM, CD99  Paracelulární - hlavní  Transcelulární Průnik do místa infekce 3. Chemotaxe  V místě zánětu tvořeny látky s chemotaktickými účinky  Exogenní – fMLP  Endogenní – C3a, C5a, IL-8, CXCL8, CXCL-7  Vazba na chemokinové receptory neutrofilního granulocytu  Receptory řízený pohyb ve směru koncentračního gradientu  Produkce hydrolytických enzymů  narušení mezibuněčné hmoty  prostup do místa zánětu pomocí reverzibilních interakcí adhezivních molekul Rozpoznání patogenní částice  Pattern recognition receptors (PRR)- rozpoznávají PAMPs (103 struktur)  TLR, NOD-like, NLR, RIG-like receptory  Vazba patogenní částice na receptory zahájí vlastní proces fagocytózy:  Tvorba pseudopodií  Ingesce  fagosom  Digesce -splynutí fagosomu s lysozomy – konečná degradace  Mechanismy zabíjení na kyslíku nezávislé  Mechanismy zabíjení na kyslíku závislé Mechanismy zabíjení na O2 nezávislé  Antimikrobiální peptidy a enzymy  Kathepsiny  Lysozym  Defenziny  Kyselé pH  Proteiny omezující dostupnost stopových prvků a vitaminů  Laktoferin – vyvazuje železo  Vitamin B12 binding protein Mechanismy zabíjení na O2 závislé  Enzymatická tvorba reaktivních kyslíkových mediátorů  Doprovázená výraznou spotřebou kyslíku – oxidační vzplanutí  Ústřední role – NADPH oxidáza NADPH oxidáza  Intracelulární lokalizace - membrány  6 podjednotek (2 v membráně fagolysosomů, 4 v cytosolu (klidový stav)  Aktivace – signální kaskáda spuštěná receptory – fosforylace  propojení membránových a cytoplazmatických podjednotek NADPH oxidáza a tvorba reaktivních kyslíkových mediátorů (ROS) Myeloperoxidáza  Oxidoreduktáza  Obsahuje hemovou skupinu – nazelenalé zbarvení  Přeměna peroxidu vodíku na kyselinu chlornou, která je až 50 krát účinnější  Kyselina chlorná může být substrátem dalších reakcí, při kterých vzniká hydroxylový radikál a signletový kyslík – lipoperoxidace membrán  smrt fagocytující buňky Závěrečná fáze fagocytózy  Vyloučení degradovaných částí patogenů exocytózou  Neutrofily brzy podléhají poškození a umírají  Ve tkáních jsou fagocytovány makrofágy  Nahromadění zbytků mikroorganismů a fagocytů – hnis (nazelenalé zbarvení způsobuje MPO) Neutrofily nedisponují pouze fagocytózou!  Jak se fagocyty podílejí na eliminaci patogenů, které nemohou být díky své velikosti nebo agresivitě zfagocytovány? Pseudomycelia Candida albicans jsou příliš velké a fagocyt je nedokáže pohltit Staphylococcus aureus – mohutná biochemická aktivita – produkce hydrolytických enzymů  zahubí fagocyty dříve, než se k bakterii vůbec stihnou dostat NETóza  Nový typ buněčné smrti  Reaktivní kyslíkové mediátory tvořené NADPH oxidázou jsou druhými posly  Jádro - dochází k citrulinaci histonů (peptidylarginindeimináza 4 – PAD4), rozvolnění jaderného chromatinu a jeho vypuzení do extracelulárního prostoru NETóza  Vzniká síť tvořená jaderným materiálem, obsahující MPO a některé další antibakteriální peptidy z granulí neutrofilů  Do procesu NETózy vstupuje pouze malá část z aktivovaných neutrofilů  Účel –většinou boj s velkými patogeny, které nemohou být zfagocytovány  MPO, cadheliciny, defenziny – mikrobicidie  Síť – omezení šíření patogenů v prostoru  Možné nežádoucí důsledky  Uvolnění intracelulárních komponent – možná tvorba autoprotilátek proti intracelulárním strukturám neutrofilů (např. vznik autoprotilátek proti myeloperoxidáze)  Podezření z účasti na imunitně podmíněné trombóze Vyšetření fagocytózy  1. Test adheze  Cytometrická detekce CD11b/CD18 – deficit – LAD syndrom  2. Test chemotaxe  Boydenova komůrka  migrace fagocytů v nádobce skrze membránu s velmi malými póry ve směru chemotaktického gradientu  Počítání buněk které pronikly na druhou stranu membrány  Migrace pod agarózou  Do agarózového gelu se vyříznou 2 jamky – do jedné se pipetuje suspenze vyšetřovaných buněk, do druhé chemoatraktant  Buňky migrují směrem k jamce s chemoatraktantem  Po inkubaci 4 h se gel usuší a obarví  Odečítá se vzdálenost, kterou buňky urazily od středu jamky  Recidivující flegmonózní záněty kůže a sliznic – snížení Vyšetření fagocytózy  2. Test chemotaxe  Boydenova komůrka  migrace fagocytů v nádobce skrze membránu s velmi malými póry ve směru chemotaktického gradientu  Počítání buněk které pronikly na druhou stranu membrány  Migrace pod agarózou  Do agarózového gelu se vyříznou 2 jamky – do jedné se pipetuje suspenze vyšetřovaných buněk, do druhé chemoatraktant  Buňky migrují směrem k jamce s chemoatraktantem  Po inkubaci 4 h se gel usuší a obarví  Odečítá se vzdálenost, kterou buňky urazily od středu jamky  Nejčastější klinické projevy snížené chemotaxe fagocytů  recidivující flegmonózní záněty kůže a sliznic Vyšetření fagocytózy  3. Test ingesce  Testuje se schopnost buněk pohltit mikrosferické hydrofilní partikule (MSHP)  Krev se inkubuje s MSHP částicemi  Poté se zhotoví nátěr krve a obarví se  Počítá se 100 buněk, pozitivní jsou ty, co obsahují v cytoplazmě 3 a více MSHP částic  Význam má snížení – sepse, nádory, nezralé formy granulocytů Vyšetření fagocytózy  4. Mikrobicidní test  Vyšetření funkce celého procesu fagocytózy – sleduje se schopnost fagocytů pohltit a usmrtit živý mikroorganismus  Princip - inkubace plné krve s kvasinkou Candida albicans  Fagocyty candidy usmrtí pokud mají schopnost fagocytózy v pořádku  Následuje osmotická lýza fagocytujících buněk a vitální barvení trypanovou modří (mrtvé candidy jsou modré, živé bílé)  Odečet poměru živých a mrtvých candid v mikroskopu  V rutině se test nepoužívá – příliš pracný, malá výpovědní hodnota Vyšetření oxidačního vzplanutí  INT/NBT test  Inkubace krve s bezbarvým nitroblue tetrazolium chloridem (NBT) nebo jod nitroblue tetrazolium chloridem (INT) a látkou stimulující oxidační vzplanutí  Při oxidačním vzplanutí dochází k redukci NBT nebo INT na nerozpustný barevný formazan  Nátěr krve  hodnocení počtu pozitivních buněk (obsahují barevná granula)  Chemiluminiscence  Stimulace konkrétního počtu buněk (PMA, fMLP, E.coli, zymosan)  Přídavek chemiluminiscenční látky – vlivem oxidačního vzplanutí dochází k oxidaci chemiluminiscenční sondy*  emise fotonů  přístroj luminometr počítání záblesků (vztažení k počtu buněk v reakci)  Luminol, isoluminol Vyšetření oxidačního vzplanutí Burst test (BTT)  Detekce oxidačního vzplanutí v granulocytech a monocytech pomocí průtokové cytometrie  Princip – produkty oxidačního vzplanutí oxidují fluorescenční barvivo  Funkční test  Odběr krve do heparinu  Nejsou stanoveny konkrétní referenční meze  Nutno se vzorkem pacienta vždy zpracovat i vzorek zdravé kontroly!!  Hodnocení – porovnání pacienta s kontrolní osobou – % pozitivních granulocytů a monocytů Burst test (BTT)  Krok 1: Stimulace fagocytů (1 pacient = 4 zkumavky)  PBS – negativní kontrola  E. Coli – vazba na PRR receptory – aktivace fosfatidylinositol 3-kinázy (PI3K)  fMLP – chemoakraktant - vazba na formyl peptidový receptor spřažený s malými G proteiny – aktivace fosfolipázy A2 (PLA2)  PMA – malá molekula – rychlý průnik skrze membránu do cytoplazmy – přímá vazba na proteinkinázu C (PKC) – rychlá a masivní aktivace, která po krátké době může vést i ke smrti buňky  Proč 3 stimulancia?  široké spektrum patogenů, různé cesty aktivace  Snaha postihnout několik signálních drah, které vedou k fosforylaci NADPH oxidázy Burst test (BTT)  Krok 2: Zviditelnění produkce ROS pro průtokový cytometr  Fluorescenční barvivo Dihydrorhodamin 123 (DRH 123)  vlivem ROS dochází k oxidaci na Rhodamin 123  Fluorescence při 536 nm (zelená)  Světelná emise zaznamenána detektory cytometru  Intenzita fluorescence úměrná aktivitě oxidačního vzplanutí Burst test (BTT) – hodnocení Intenzita fluorescence Chronická granulomatózní choroba (GCD)  Defekt NADPH oxidázy – porucha tvorby ROS  Dědičnost X- vázaná (závažnější) nebo autosomálně recesivní (mírnější)  1:250 000  Náchylnost k infekcím kataláza pozitivními patogeny a mikromycetami (plísně)  Neschopnost fagocytů degradovat patogenní materiál  Tvorba hlubokých abscesů (mohou působit útlak okolních tkání)  Časný nástup choroby (děti) GCD X-vázaná GCD De-novo mutace (autosomálně recesivní) Deficience myeloperoxidázy  Deficience vrozená: 1. částečná - výskyt cca 1:2000 2. úplná - výskyt cca 1:4000  Dědičnost - autosomálně recesivní  Až 50% pacientů klinicky asymptomatických  Závažný průběh nemoci – 5-10% postižených (časté infekce, zejména plísně)  Deficience získaná:  diabetes mellitus, těžké infekce, nedostatek železa, intoxikace olovem, diseminované tumory, některé leukemie MPO – příprava vzorku  1 pacient – 2 zkumavky  Značení buněk pomocí anti-CD14 (rozliší monocyty od granulocytů)  Promytí  Fixace a permeabilizace membrán (MPO je intracelulární marker)  Pouze jedna zkumavka -značení protilátkou anti-MPO  Druhá zkumavka se neznačí – slouží jako izotypová kontrola  Hodnocení - % MPO pozitivních granulocytů a monocytů  Norma 75 -100% Vyšetření Deficit MPO Exprese MPO - monocyty ZDRAVÁ KONTROLA PACIENTKA SROVNÁNÍ pacientka zdravá kontrola ZDRAVÁ KONTROLA PACIENTKA SROVNÁNÍ Deficit MPO Exprese MPO - granulocyty pacientka zdravá kontrola89% ZDRAVÁ KONTROLA PACIENTKA SROVNÁNÍ Deficit MPO Burst test - stimulace E. coli Počet aktivovaných buněk: 95% Stimulační index: 163 Počet aktivovaných buněk: 89% Stimulační index: 22 pacientka zdravá kontrola fluorescence ZDRAVÁ KONTROLA PACIENTKA SROVNÁNÍ Deficit MPO Burst test - stimulace PMA Počet aktivovaných buněk: 97% Stimulační index: 281 Počet aktivovaných buněk: 92% a 6% Stimulační index: 23 a 201 pacientka zdravá kontrola