Krevní buňky a principy jejich
vyšetřování
na hematologických
analyzátorech a mikroskopicky
Bourková L., OKH FN Brno
Vyšetřování krevních buněk v periferní krvi
 nesrážlivá periferní krev
 antikoagulační činidlo: K3EDTA, K2EDTA nebo Na2EDTA
 vyšetření:
 hematologické analyzátory
 mikroskop
hematopoetické kmenové buňky
Leokocytární vývojová stádia - Granulocyty
BLAST PROMYELOCYT
neutorfilní
myelocyt
neutorfilní
metamyelocyt
neutorfilní
tyč
neutorfilní
segment
eozinofilní
myelocyt
eozinofilní
metamyelocyt
eozinofilní
tyč
eozinofilní
segment
bazofilní
myelocyt
bazofilní
metamyelocyt/
tyč
bazofilní
segment
neu My eoz My bazo My
Leukocytární vývojová stádia - Monocyty
MONOBLASTY
PROMONOCYTY
MONOCYTY
Leukocytární vývojová stádia - Lymfocyty
LYMFOBLASTY PROLYMFOCYTY
LYMFOCYT LGL-LYMFOCYT PLAZMATICKÁ BUŇKA
Megakaryocytární vývojová řada
MAGAKARYOBLASTY
PROMEGAKARYOCYT
MAGAKARYOCYT
TROMBOCYTY
Normoblastová vývojová řada
PROERYTROBLAST
ČASNÝ ERYTROBLAST
(bazofilní normoblast)
STŘEDNĚ ZRALÝ
ERYTROBLAST
(polychromní normoblast)
POZDNÍ
ERYTROBLAST
(ortochromní/oxyfilní
normoblast) RETIKULOCIT ERYTROCYT
speciální
barveníbývají laločnaté
výběžky cytoplazmy
Hematologické analyzátory
linka
analyzátor
nátěrový automat
digitální morfologie
12
3
start
konec
Principy měření hematologických analyzátorů
 principy měření buněk:
 impedanční analýza
 optická analýza
– kombinace různých principů analýzy
– hydrodynamická fokusace:
usměrnění buněk proudem izotonické kapaliny
(diluentem) při průchodu měřícím kanálem „po jedné“
 spektrofotometrická analýza hemoglobinu
Principy měření umožňují vyšetření:
 kvantitativní – počet buněk
 kvalitativní – morfologie buněk
 tvar buňky
 tvar a velikost jádra
 obsah cytoplazmy
Impedanční analýza
 ředění buněčné suspenze
 diluent - vodivý
 krevní buňka – nevodivá
 průchod buněk mezi elektrodami (stejnosměrné elektrické pole) → impulz
 prochází vždy jediná buňka
 počet impulzů = počet buněk
 velikost impulzů = velikost buněk
 možné doplnění vysokofrekvenční analýzou
 na buňku superponováno vysokofrekvenční elektrické pole
 analýza vysokofrekvenčního napětí buňky = morfologie buňky
Optická analýza
 ředění buněčné suspenze
 diluent – opticky inaktivní
 krevní buňka – opticky aktivní
 interakce buněk s monochromatickým
laserovým paprskem
 po interakci buňky s paprskem se provádí analýza:
 prošlého světla (0°)
 odraženého světla
 depolarizovaného světla
 fluorescence
o cytochemické barvení enzymu (peroxidáza) v buňkách, doplňková analýza absorbce
a rozptylu světla dle stupně reakce enzymu v cytoplazmě (u některých typů přístrojů)
 vyšetření:
 kvantitativní a velikost buňky → detekce ve směru (0°)
 kvalitativní/morfologie buňky → detekce odraženého a depolarizovaného
světla, fluorescence, případně kombinace s cytochemickou analýzou
Spektrofotometrická analýza hemoglobinu
 hemolýza všech erytrocytů lyzačním (bezkyanidovým) roztokem
 uvolněný HGB je převeden na chromogenní formu s nejvyšší
hodnotou absorbance při λ = 540 nm
 HGB je převeden na chromogenní formu reagencií (např. imidazolem nebo
sodium lauril sulfátem), která vytváří hemoglobinový komplex
 měření absorbance hemolyzovaného vzorku
a blanku (lyzační roztok)
 z rozdílu absorbancí je vypočítána koncentrace HGB
Mikroskopovací zařízení
Zhotovení nátěru krve
 roztírací sklíčko položit před kapku krve na podložním skle pod
úhlem cca 30 - 40° (nikdy ne do kapky krve); po doteku krve a
roztíracího skla se krev rozlije podél hrany skla; po té rychle
krev rozetřít po podložním skle
 sílu nátěru zvažovat – čím větší úhel, tím silnější nátěr
 úhel se řídí hodnotou HCT: čím ↑HCT, tím ↓úhel; čím ↓HCT, tím ↑úhel
 nátěr musí být: rovnoměrný, přiměřeně tenký, dlouhé okraje
musí být rovné, na konci přechází „do ztracena“
Mikroskopování
 mikroskop
 suchý objektiv: mezi preparátem a objektivem je vzduch (přehledné prohlížení a buněčnost preparátu)
 imerzní objektiv: mezi preparátem a objektivem je imerzní olej (morfologie buněk)
o imerzní olej má podobný index lomu jako sklo – vznikne opticky homogenní prostředí, zvýší se index lomu prostředí
mezi preparátem a objektivem
imerzí může být: voda, parafinový olej, glycerol, cedrový olej, kanadský balzám (voda má vyšší index lomu než vzduch,
ale nižší než imerzní olej)
 zvětšení:
1000x (morfologie buněk)
200x (přehledný náhled na preparát)
 hodnotit nátěr komplexně (WBC, RBC, PLT)
 hodnocení subpopulací WBC a obecně jaderných buněk v periferní krvi i KD v %
 digitální morfologie
nové generace analyzátorů svým softwarovým vybavením digitálně zpracovávají
a vyhodnocují krevní nátěry, hovoří se o virtuální mikroskopii (telehematologie), digitální
analýza vytváří databázi digitálních fotografií krvinek, které lze i exportovat
e-mailem nebo po internetu odborníkům ke konzultaci
zdroj světla
X
Barvení nátěrů periferní krve a aspirátů kostní dřeně
 Panoptická barvící technika:
 fixační roztok May-Grunwald – složení: eozin Y, metylenová modř,
metylalkohol, glycerol
 barvící roztok Giemsa-Romanowsky – složení: metylenová modř, azureozin,
azur II, metylalkohol, glycerol, fosfátový pufr pH 6,8-7,0
 Základní principy barvení:
 Aniontové (kyselé) barvivo eosin Y se váže na kationtové části molekul
proteinů a barví oranžovočerveně hemoglobin a eozinofilní granula
 Kationtové (zásadité) barvivo azur B, se váže na aniontové části molekul a
barví modrošedě zbarvení nukleové kyseliny (DNA nebo RNA),
nukleoproteiny, granula bazofilů a sekundární granula neutrofilů.
Pro správné vyhodnocení preparátů je nutná pravidelná kontrola kvality
panoptického i speciálního cytochemického barvení.
Celkové obarvení nátěru je výsledkem řady různých kombinací těchto
barevných reakcí, které nakonec dávají výsledný vzhled nabarveného
preparátu.
Preparáty lze připravovat manuálně nebo na nátěrových a barvících automatech.
Princip barvení je vždy stejný.
Podpořeno MZ ČR – RVO (FNBr, 65269705)