Klasické serologické metody aglutinace / precipitace, RID, nefelometrie / turbidimetrie Vyšetření funkce komplementu Peter Slanina (peter.slanina@fnusa.cz) Ústav klinické imunologie a alergologie FN u sv. Anny a Lékařská fakulta MU Laboratórne vyšetrenie IN VITRO • Preanalytická fáza - odber, príprava, spracovanie vzorky pred zahájením laboratórneho vyšetrenia - skladovanie, transport • Analytická fáza - kalibrácia a justovanie zariadení (analýza kontrol- IKK, EHK) - prevedenie lab. vyšetrenia + kontrol - spracovanie výsledkov, LIS • Postanalytická fáza - skladovanie, likvidácia materiálu - preskúmanie výsledkov, uvoľnenie, uchovávanie LIS - NIS Rozdelenie imunologických laboratórnych metód serologické (humorálne)- detekcia antigénov a protilátok, Metódy preukázanie tvorby protilátok proti infekčnému agens bunečné- počty a funkcie jednotlivých typov leukocytov Serologické metódy Reakcia antigénu (Ag) s protilátkou (Ab) = imunokomplex: 1. Primárna – rýchla, nepozorovateľná voľným okom fáza – tvorba imunokomplexov Ag + Ab – vznik väzby jednotlivých epitopov s väzbovými miestami protilátok 2. Sekundárna – pomalá, pozorovateľná voľným okom fáza – uplatňuje sa multivalencia Ag a polyvalencia Ab – vznik priestorového komplexu Pokiaľ nedochádza k sekundárnej fáze reakcie, je nutné imunokomplexy vzniknuté v primárnej fáze vizualizovať – imunochemické metódy http://www.wikiskripta.eu Serologické metódy 1. Klasické serologické metódy - Aglutinácia (priama / nepriama) - Precipitácia (v kvapaline, v géle) 2. Imunochemické metódy s následnou detekciou - Imunofluroscencie (priama / nepriama) - Imunoanalýza (EIA-ELISA, RIA, FIA, LIA) - Imunoblot, imunodot 3. Metódy založené na efektorovom účinku protilátok (využívané v klinickej mikrobiológii) - Komplement fixačné reakcie - Inhibičné a neutralizačné testy Aglutinácia vs Precipitácia Aglutinácia (zhlukovanie) Ag + Ab Ag-Ab aglutinogén aglutinin aglutinát makromolekulárny imunokomplex „zhluk“ korpuskulárny nerozpustný Protilátky namierené proti epitopom antigénnych častíc vytvárajú medzi korpuskulami mostíky, ktoré vedú k vzniku zhlukov (aglutinátov) Precipitácia (zrážanie) Ag + Ab Ag-Ab precipitogén precipitin precipitát nízkomolekulárny imunokomplex „zrazenina“ nekorpuskulárny rozpustný Reakcia medzi solubilným antigénom a protilátkou s následným vznikom precipitátu (hydrofóbne väzby – nerozpustný komplex) Aglutinácia 1. Priama - korpuskulárny Ag prirodzene nesie cieľové epitopy - identifikácia baktérií, hemaglutinácia 2. Nepriama - rozpustný antigén naviazaný na povrchu vhodných makromolekulárnych častíc (latex) - stanovenie RF, ASLO Krvné skupiny Systém AB0 Detekce protilátek vázaných na erytrocyty in vivo Detekce volných protilátek proti erytrocytům v séru Hodnotenie aglutinácie • KVALITATÍVNE - aglutinácii dochádza / nedochádza (pozitívna / negatívna) • KVANTITATÍVNE - stanovenie najvyššieho riedenia séra, kedy je ešte badateľná aglutinácia - titer (titr) = prevrátená hodnota riedenia séra (riedenie 1:32 → titer 32) Revmatoidní artritida • Systémové autoimunitní onemocnění – poškození kloubů • Příčiny – genetika + faktory vnějšího prostředí • Patologická citrulinace proteinů – imunitní systém rozpozná imunodominantní epitopy imunitní reakce, produkce autoprotilátek • V kloubu se tvoří zánětlivá tkáň – pannus – narušení chrupavky • Osteoklasty – degradace kosti • muži : ženy 1 : 2-3 • 1 % populace • Stanovení: revmatodní faktor (RF) + protilátky proti cyklickým citrulinovaným peptidům (anti-CCP) Autor obrázku: Osmosis, video zde: https://www.youtube.com/watch?v=EB5zxdAQGzU&ab_channel=Osmosis Latex-fixačný test • Reumatoidný faktor (RF) - autoprotilátka namierená proti Fc části IgG molekuly - prítomný asi u 80% pacientov s reumatoidnou artritídou - pozitívny je tiež u asi 5-10% chorých s inými systémovými autoimunitnými ochoreniami, autoimunitné hepatitídy, SLE, Sjogrenův syndrom - môže byť pozitívny i u zdravých osôb - diagnosticky najdôležitejší je RF v triede IgM (rutinně se měří nefelometricky!) Princíp testu aglutinace na nosičích: Streptokoková infekce a pozdní následky • Streptokoky skupiny C mají M protein - jeho struktura je podobná strukturám srdce nebo ledvin – molekulární mimikry • Protilátky proti M proteinu zkříženě reagují s těmito strukturami • Poststreptokoková sterilní karditida, glomerulonefritida • Během streptokokové infekce se také tvoří ASLO – anti-streptolyzin O antibodies • Stanovuje se při podezření na poststreptokokové sterilní následky Stanovenie ASLO (ASO) nepriamou aglutináciou • ASLO- anti streptolysin O antibodies • Slúži k stanoveniu protilátok v sére proti Streptolysinu O (exotoxín bakterií z rodu Streptococcus) • Princíp testu: - Stejný jako u RF – latexová aglutinace (na latexových částicích vázán streptolyzin O) Precipitácia 1. V géle - Jednoduchá RID - Dvojitá RID 2. V tekutom prostredí - Nefelometria - Turbidimetria Precipitácia v géle – jednoduchá RID • Prostředí – agarózový gel • Princip 1. Do gelu je při teplotě těsně před tuhnutím přidána protilátka proti hledanému antigenu (např. chceme stanovit C5 v gelu protilátka proti C5) 2. Ztuhnutí gelu 3. Vykrojení jamek do gelu 4. Pipetujeme kalibrátory a vzorky 5. Antigen difunfuje do gelu – v místě ekvimolární koncentrace Ag-Ab se vytvoří kruhový precipitát 6. Průměr a plocha kruhu je úměrná množství antigenu ve vzorku Radiálna imunodifúzia • Pomocou RID je možné stanoviť koncentrácie mnohých bielkovinových súčastí séra • Metodika sa v minulosti používala pri meraní hladín celkového IgG, IgA, IgM, zložiek komplementu alebo rôznych proteínov akútnej fáze- väčšina týchto vyšetrení je dnes automatizovaná a prevádzaná na princípe nefelometrie • Stanovenie C2 a C5 zložiek komplementu! • Jednoduchá RID - koncentračný gradient jedného z reaktantov (väčšinou Ag) - druhý reaktant (väčšinou Ab)- rovnomerne rozptýlený v štruktúre gélu - výsledkom sú ostro ohraničené krúžka precipitátu - plocha prstenca = úmerná koncentrácii vyšetrovaného Ag - podľa konc. štandardu – kalibračná krivka Kalibračná krivka • Charakterizuje vzťah medzi koncentráciou vyšetrovanej látky a priemerom kruhov na príslušnej vyšetrovacej doske • Dvojitá RID (podľa Ouchterlonyho) - sledujeme antigennú príbuznosť antigénov - Prostředí – čistý gel – do jamek pipetujeme antigen i protilátku - gradient vytvára ako Ag, tak Ab a dochádza k protismernej difúzii oboch reaktantov (radiálne) - v zóne ekvivalencie – precipitačná línia, ktorá ukazuje na pozitivitu reakcie - hodnotenie: kvalitatívne Precipitácia- v tekutom prostredí • Využíva sa efekt, že pri reakcii Ag-Ab vzniká zákal- precipitát, ktorého intenzita je pri konštantnom množstve pridanej protilátky úmerná pridanej koncentrácii vyšetrovaného antigénu • Meranie intenzity zákalu: nefelometria, turbidimetria – Tyndalův jev • Obe metodiky umožňujú kvantitatívne stanovenie obsahu proteínov vo vzorke odčítaním z kalibračnej krivky Nefelometria a turbidimetria • Reakcie založené na meraní množstva imunitných komplexov vytvorených interakciou špecifických protilátok s antigénom • Stanovenie sérových bielkovín • Meranie prebieha v tekutom prostredí v meracej kyvete (pufr, látka urýchľujúca reakciu, Ag, Ab) • Množstvo vytvorených komplexov je úmerné koncentrácii Ag Precipitácia v tekutom prostredí Nefelometria - vhodná pre nižšie koncentrácie viditeľné svetlo detektor je v smere kolmom na vstupujúci lúč Meria množstvo svetla rozptýleného pri prechode lúča (množstvo svetla odrazeného od vznikajúcich komplexov) Turbidimetria - Vhodná pre koncentrovanejšie roztoky viditeľné svetlo detektor je v ose lúča Meria množstvo prechádzajúceho svetla (úbytok intenzity svetla, ktoré prešlo roztokom v kyvete) nefelometria je 5-10x citlivejšia a nákladnejšia ako turbidimetria Dynamika precipitačních reakcí Imunoprecipitační křivka (Heidelberg-Kendallova) 1) Oblast nadbytku protilátky – měření přístrojem 2) Zóna ekvivalence 3) Oblast nadbytku antigenu – protilátka spotřebována, imunokomplexy se rozpadají a odezva na detektoru klesá Hook efekt Závěr: Pro 2 rozdílné koncentrace antigenu lze získat jednu hodnotu absorbance riziko falešně nízkých hodnot Přístroje mají různé postupy, jak Hook efekt rozpoznat Při nefelometrickém i turbidimetrickém měření musí zůstat zachována podmínka nadbytku protilátky v reakční směsi Měření zákalu je relevantní pouze ve vzestupné části křivky – probíhá kinetickým proměřováním vzorku s intervalem 5 vteřin Po proběhlé reakci přístroj do reakční směsi přidá antigen: 1) Pokud absorbance odpět stoupne (3) měření proběhlo v oblasti nadbytku protilátky (tvoří se nové imunokomplexy) a pro výpočet koncentrace analytu tedy může být použita naměřená hodnota absorbance původního ředění 2) Pokud po přídavku antigenu k nárůstu signálu nedojde (4) protilátka byla spotřebována (příliš mnoho antigenu) analýza musí být opakována znovu s vyšším ředěním vzorku Beckman Coulter IMMAGE 800 • Stanovenie koncentrácie: • I: - imunoglobulíny: IgG, IgA, IgM (g/l) - proteíny akútnej fáze: CRP (mg/l) - (RF+ASLO) • II: - Podtřídy Ig - zložky komplementu: C3, C4, C1q - proteíny akútnej fáze: A1AT (alfa 1 antitrypsin), OROSO (orosomukoid), A2M (alfa 2 makroglobulin), CPL (ceruloplasmin), TRF (transferin), PREA (prealbumin) www.beckmancoulter.com/en/products/protein- chemistry/immage-800 Referenční meze pro dospělého • IgG – 7,5 - 15,5 g/l • IgG1 IgG2 IgG4 IgG3 • IgA - 0,8 – 4,5 g/l • IgA1 IgA2 • IgM – 0,5 – 3 g/l • IgE < 100 kU/l • IgD < 100 IU/ml • CRP - 0-8 mg/l Siemens BNII • Stanovenie koncentrácie: - imunoglobulíny: IgE (IU/ml), IgD, IgA1, IgA2, IgAp (nízke koncentrácie) - zložky komplementu: C1 inhibitor www.healthcare.siemens.com/plasma-protein/systems/bn-ii-system Vyšetření cirkulujících imunokomplexů – CIK turbidimetrie • Při onemocněních (např. chřipka) se tvoří imunokomplexy – bolest svalů a kloubů • Pouze přechodné obtíže (fyziologické) odstranění ve slezině (makrofágy) • Autoimunitní onemocnění – tvorba imunokomplexů ukládání do tkání zánět • V určité fázi onemocnění je lze detekovat v krvi – CIK-PEG (precipitace imunokomplexů polyethylenglykolem) zákal měření turbidity (prošlého světla) CIK –PEG – pouze orientační vyšetření • Nevýhoda: • Detekují se jakékoli imunokomplexy – pozitivní u jakékoli akutní fáze infekce kde se tvoří Ab-Ag přítomnost imunokomplexů nemusí pro pacienta nutně znamenat zdravotní problém • Ale zároveň: Negativní výsledek neznamená, že je pacient zdravý imunokomplexy se již uložily do tkání a v krvi nejsou detekovatelné • Typicky pozitivní u imunokomplexových systémových autoimunit – RA, SLE • Malá výpovědní hodnota • Alternativou je stanovení vazby imunokomplexů na C1q (ELISA) – stanoví se pouze ty imunokomplexy, které mají schopnost aktivovat komplement Denná prax na analyzátore Provozní denník Údržba analyzátorov: - denná/týždenná/mesačná Kalibrácie: - 1 krát do mesiaca / pri zmene šarže reagencií - kalibračná krivka Kontroly IKK: - každý deň, pred zahájením merania pacientskych vzoriek - viazané na metódu, jedno-/viac-úrovňové - referenčné medze Kontroly EHK (SEKK- systém externí kontroly kvality): - podľa časového plánu - zasielané z externého laboratória (nie je známa výsledná koncentrácia) - prevedie sa meranie → Výsledky sa vo forme protokolu odošlú späť organizátorovi - organizátor porovná výsledky meraní jednotlivých laboratórií a spätne ich informuje o úspešnosti - medzi-laboratórne porovnávacie skúšky Lewey-Jenningsův diagram – sledování kontrol v čase Westgardova pravidla – detekce chyb v analytické proceduře (rozhoduje o schválení či zamítnutí analytické série) Priebeh vzorky Sérum = odběr srážlivé krve Alikvotácia vzorky Vytvorenie pracovného listu pre jednotlivé analyzátory = zoznam vzoriek Analyzátor = vzorka + špecifické antisérum + pufr (stabilizácia a urýchlenie reakcie) Analyzátor prepojený s LIS (laboratórny informačný systém)= získa informácie o potrebnom meraní + výsledok automaticky odošle Interpretácia výsledkov • Výsledky sú pred vydaním viacnásobne kontrolované • Pozor: falošná pozitivita (malá špecificita testu) falošná negativita (malá senzitivita testu) • Hladina imunoglobulínov IgG, IgA, IgM (g/l): ↑ - zápalové procesy infekčného pôvodu - jedna trieda = myelom; monoklonálna gamapatia - zvyšovanie s vekom ↓ - poruchy tvorby = imunodeficity - lymfomy, leukémie, myelomy, následkom liečby, nefropatie Interpretácia výsledkov • Hladina IgE (IU/ml): ↑ - alergické stavy prvého typu precitlivenosti - parazitárne choroby - autoimunity, imunodeficiencie • Vyšetrenie komplementového systému (sérová hladina C3 a C4 (g/l), C1-INH) ↑ - zápalová aktivita (zriedka) ↓ - vrodená / získaná porucha tvorby (jaterní selhání; zvýšená spotreba- tvorba imunokomplexov; hereditárny angioedém) Interpretácia výsledkov • Reaktanty akútnej fázy ↑ - akútna zápalová reakcia = opsonizační a prozánětlivý efekt - regulačná funkcia; prenášače iontov; hemokoagulácia CRP (mg/l) ↑ - bakteriálne infekcie - infarkt myokardu, pooperačné obdobie - reumatické choroby